Facultad de Ciencias de la Vida

Departamento de Ciencias Biológicas

Informe 5 de Laboratorio
Organización Subcelular
Integrantes: Pamela Yévenes, Enrique Godoy y Josefa Jeria
Carrera: Ingeniería en biotecnología y Bachillerato en ciencias
Fecha:
Sección: 1660

1. Introducción

Para lograr el estudio de un organelo en específico de la célula, existen diferentes métodos, es

decir, procesos para separar sus componentes, aislarlos y de esta forma estudiarlos para
comprender su funcionamiento. Para realizar algunas de estas técnicas de separación se utiliza
la centrífuga , la cual consiste en un sistema de rotores con cavidades para colocar los tubos
que contienen la muestra y hacerlos girar a diferentes velocidades para finalmente lograr la
separación. Uno de los procesos más utilizados es el fraccionamiento celular. Este último
consiste en 2 etapas, la primera consiste en homogeneizadores mecánicos. Estas últimas que
han sido homogeneizadas reciben el nombre de lisados. El resto de los componentes continúa
intacto (Ham, David, 2010). La segunda etapa consiste en una serie de centrifugaciones,
realizada con la centrífuga antes mencionada, a diferentes velocidades, y en cada una de estas
se obtienen 2 porciones, el pellet , el cual queda depositado en el fondo, y el sobrenadante que
queda por encima (Murray, 2001). Este último es reutilizado para las centrifugaciones
posteriores para así poder ir obteniendo el resto de los componentes celulares.
Para la identificación más clara de los organelos, se utilizan marcadores subcelulares como
el ADN y enzima, los cuales son marcadores de la presencia de núcleos y mitocondrias
respectivamente. Estos marcadores pueden ser identificados con colorantes, los cuales, se
unen a ella cuando está ionizada, como por ejemplo : el azul de tripán ( Ross, Michael,2006)

Hipótesis: Se espera detectar una acción enzimática solo en la fracción mitocondrial y la

homogeneización de la muestra.
Objetivos:
-Observar las diferentes tinciones de las fracciones celulares por el azul metileno
-Observar una muestra de fracción nuclear bajo la tinción de azul tripán
-Observar el fraccionamiento celular reaccionando a los marcadores moleculares que se
encuentren en cada fracción.
-Comprender el funcionamiento del fraccionamiento celular.
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Fraccionamiento subcelular del hígado

Se tomó un trozo de hígado de pollo frío al que después se le agregó un poco de suero
fisiológico y se picó en trozos pequeños utilizando una tijera, dichos trozos se colocaron en un
vaso precipitado y se realizó tres lavados de suero fisiológico con el fin de sacar el exceso de
sangre en el tejido, luego se agregó 100 ml de suero fisiológico, el cual está rotulado en una
probeta, esta muestra se llevó al Ultraturrax, en una cubeta de hielo a 4º C , ya que, se
minimiza la activación de daño generado por fosfolipasas y proteasas. La muestra se lleva a un
proceso llamado homogeneización, el cual produce la rotura de las membranas celulares, con
lo que el líquido que al comienzo era incoloro se tornó rojo, se obtuvo un homogeneizado total
con componentes celulares y tejido sin romper.
Se procedió a un nuevo homogeneizado, llamado homogeneizado crudo. En este
procedimiento se filtró la muestra utilizando una gasa dispuesta en el embudo de vidrio, en la
que quedó una solución homogénea, luego de eso, se echó 10 ml del homogeneizado total a un
tubo de centrífuga, el cual se puso en una máquina centrifugadora dejándolo a una velocidad
baja de 1000 RPM por 5 minutos y se calibró con un tubo con 10 ml de Buffer para no
descalibrar la centrifugación. Finalizado ese tiempo se sacó el tubo, en el cual se observó dos
fracciones de sustancias diferentes ,el pellet en la parte inferior del tubo y el sobrenadante en
la parte superior, se retiró con la ayuda de una pipeta el sobrenadante a un tubo limpio,
correspondiente a esto se realizó la segunda centrifugación con el mismo procedimiento
anterior pero a una velocidad más alta de 6000 RPM durante 20 minutos. Pasado ese tiempo se
obtuvo un nuevo pellet y otro sobrenadante, se agregó 5ml de suero fisiológico al primer
sobrenadante y se realizó una tercera centrifugación a la misma velocidad y tiempo. Con el
pellet que quedó, se agregó 1 ml de suero fisiológico. Finalizada la tercera centrifugación, se
obtuvo nuevamente un sobrenadante. Al acabar de centrifugar los tubos, se procedió a
rotularlos, el primer tubo centrifugado pasó a llamarse fracción nuclear, compuesto por células
de forma intacta y organelos de mayor tamaño, el segundo pellet, sedimentado por
mitocondrias, lisosomas y peroxisomas y el tercer sobrenadante una fracción microsomal
compuesto por membranas plasmáticas, retículos endoplasmáticos, restos de vesículas y
citoplasmas .

Determinar la presencia de la enzima succinato deshidrogenasa

Se dispuso de 5 tubos de ensayo, los cuales fueron rotulados de la siguiente manera: “ Blanco
n° 1”, “ Homogeneizado crudo n° 2, “ Fracción nuclear n° 3, “ Fracción mitocondrial n° 4, “
Fracción microsomal n° 5”a los cuales se les agregó 1 ml de succinato, 1 ml de azul de
metileno y cada una de las fracciones moleculares anteriores al tubo correspondiente. Al
primer tubo no se le agregó nada porque es el blanco, al tubo n° 2 se le agregó el
homogeneizado filtrado con la gasa, al tubo n °3 se le agregó 1 ml del pellet de la primera
centrifugación, al tubo n° 4 se le agregó 1 ml del pellet de la segunda centrifugación y al
último tubo se le agregó 1 ml del sobrenadante 3. Dado esto, se les agregó 1 ml de vaselina
con el fin de aislar las muestras del oxígeno para que no se oxiden. Los tubos de ensayo fueron
dispuestos en una gradilla metálica apta para la exposición de una baño termorregulador a una
temperatura de 37° C por un tiempo de 10 minutos. Finalizado ese tiempo se sacó la gradilla
con los tubos para la observación de dicha reacción.
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2. Resultados

Actividad 1: Fraccionamiento subcelular

La siguiente imagen, corresponde a una muestra de fracción nuclear teñida con azul de
tripán observada al microscopio. Con respecto a esta imagen indique tres observaciones
(puede ayudarse de las flechas para una adecuada interpretación)

A
Título: Observación microscópica de fracción nuclear
B
Dibujo N°: 1
20 µm

Nombre: Fracción nuclear

Tipo de muestra: temporal
Tinción: Azul de tripán
Aumento del objetivo: 40X
Aumento Total: 400X

Observaciones:
1) Se pueden observar un alto número de núcleos teñidos con azul de tripán
2) Se confirma el contenido enriquecido en núcleos de la fracción nuclear.
3) Se observa que los núcleos se tienden a agrupar.
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Tabla N°1: Evaluación del fraccionamiento subcelular mediante marcadores moleculares

TUBO Muestra Color de la Color de la Indique si la reacción es negativa o
muestra muestra positiva y anote sus observaciones.
antes de después de
someterla a someterla a
calor calor
1 Blanco
Negativo , Aun no se llega a hacer ningún
proceso por lo tanto tienen el color
original del azul metileno con las
muestras.

2 Homogenizado
Crudo (HC)
Positiva, la muestra sometida antes al
calor tuvo un cambio de calor verdoso y la
sometida al calor después cambio a un
rojizo .

3 Fracción Negativo , no hubo ninguna diferencia de

Nuclear (FN) coloración ya que sigue del mismo color
que las primeras muestras.

4 Fracción Positivo, ya que se observa un cambio de

Mitocondrial color en la muestra sometida al calor
(FMit) después debido a la acción de la enzima
succinato deshidrogenasa.

5 Fracción Negativo , ya que no posee ningún

Microsomal cambio en su tinción.
(FMic)

La siguiente tabla muestra los resultados de la evaluación del fraccionamiento subcelular de

hígado de pollo luego de someter a cada tubo a baño termoregulado a 37°C por 10 minutos.
Cada tubo contiene: 1 mL de Succinato 0,1M; 1 mL de azul de metileno; 1 mL de agua
destilada; 1 mL de vaselina, además de la fracción que se indica en la tabla. Para cada tubo,
indique si la reacción es negativa o positiva para la presencia de mitocondrias, además de sus
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observaciones.

5. Discusión

Para la actividad n°1 donde se observó la fracción nuclear, que contiene el pellet de la primera
centrifugación y se llevó a una velocidad menor queriéndose obtener una gran cantidad de
núcleos (Prieto,2019). En la muestra de esta actividad gracias al azul de tripán se puede
confirmar que está enriquecido en núcleos viendo así que la técnica de fraccionamiento celular
cumplió con su función.

En la actividad n° 2 se busca ver como las muestras al ser sometidos por fraccionamiento
celular reaccionan positiva o negativamente con su marcador molecular respectivo usándose el
azul de metileno , la primera muestra es el blanco que tuvo una reacción negativa ya que
todavía no se ha hecho ningún proceso para obtenerse algún cambio de color que no sea el
azul .Como segunda muestra esta el homogeneizado crudo que en el que se obtuvieron ambos
tubos a una reacción positiva ,el tubo antes de someterla al calor tuvo una coloración verdosa
y el tubo que fue sometido al calor tuvo una tinción color rojiza estos cambios de tinción
fueron debido a que en el homogenizado se encuentran todas las estructuras celulares. En la
tercera muestra se encuentra la fracción nuclear que su tinción fue de color azul así que la
reacción se interpreta como negativa significado esto que no contiene un marcador molecular
(Guía N°5,2017). La fracción mitocondrial es la cuarta muestra la cual solo la muestra que fue
sometida a calor tuvo una reacción positiva ya que por el color amarillo que tiene se puede
interpretar que está enriquecida en mitocondrias que es el caso contrario de la muestra no
sometida a calor por el color azul que aun contiene del azul de metileno.
Por último, está la muestra de fracción microsomal que se espera que contenga una gran
cantidad de partículas y vesículas que aún conservan sus propiedades para llegar a estudiar la
función (Guía N°5,2017) , se obtuvo una coloración azul en ambos tubos por lo tanto es una
reacción negativa, significado que sus marcadores moleculares no tuvieron una reacción al
azul de metileno.
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6. Conclusión

Podemos concluir que la utilización de métodos como el fraccionamiento celular permite

determinar la presencia de organelos específicos, en conjunto con el uso de marcadores
moleculares los cuales determinan tal presencia mediante tinciones o la acción enzimática que
caracteriza a estas moléculas debido a su especificidad, siendo así , que en consecuencia se
puede determinar no solo la presencia sino que también la función de los ya determinados
organelos.
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7. Bibliografía
Usted debe agregar toda la bibliografía utilizada en su informe. Importante: "No está
permitido copiar y pegar en el informe oraciones o párrafos textuales desde libros, páginas
web u otros informes, etc. El informe debe ser un documento completamente original en
introducción, hipótesis, materiales y métodos, discusión y conclusiones". El no cumplir con
este aspecto, implicará cero puntos en este ítem.

Se evaluará lo siguiente:
a) Deben contener al menos un 60% de referencias de libros o revistas científicas, el otro 40%
pueden ser páginas web o manuales o guías de laboratorio.
b) Formato y presentación:
Deben aparecer solo las referencias citadas en el trabajo las cuales se utilizaron como
información para realizar el informe. Deben estar claramente enumeradas para saber en qué
parte del informe fueron utilizadas (1 plana máximo).

Bibliografía

1.- HAM, David. Histología. Editorial Harla. Edición Novena, México. P 100. Año 2010

2.-Murray. Bioquímica de Harper. 15 Ed. Manual Moderno. México D.F. Año 2001 P 316.

3.- Ross, Michael H, biología molecular, ed. Baltimore, Año 2006.

4.-Prieto, D. (2019). Actividad práctica 4 – Fraccionamiento Subcelular 1.

5.-Universidad Andres bello. (2017). Laboratorio de biologia celular ,Guia N°5

:Organizacion subcelular.