Guiapracticademicrobiologia 120817175002 Phpapp02

DOCENTES:
Dra. GRACIELA ALBINO CORNEJO (Coordinadora) Med. LILIANA TORRES SAMAME
INDICE:
I.- PRESENTACIN. II.- COMPETENCIAS. III.- INSTRUCCIONES GENERALES.
IV.- NORMAS ADICIONALES V.- NORMAS DE BIOSEGURIDAD. I.- PRESENTACIN

La presente Gua de Practica permitir a los estudiantes de Medicina Humana de la Universidad de Chiclayo, tener un alcance de los procedimientos experimentales que se llevaran a cabo en el laboratorio lo que complementar las clases Tericas programadas durante este semestre acadmico. En esta se consideran las Normas y Procedimientos generales de trabajo de Bioseguridad e instrucciones para el desarrollo de cada una de las sesiones practicas a realizar. El estudiante de Medicina lograr cada una de las competencias que implica la realizacin de las prcticas programadas por lo cual deber cumplir las normas de Bioseguridad, cumplir satisfactoriamente el desarrollo total de las prcticas y llegar a las conclusiones que implica la temtica propuesta. La presente Gua Prctica tiene como propsito el desarrollo de habilidades, destrezas, correlatos e interpretacin por parte del estudiante de medicina para lograr sus competencias que la formacin profesional exige.
II.- COMPETENCIAS
1.- Competencias Generales: Comprende, demuestra y explica la morfologa, estructura , composicin qumica, fisiologa, gentica, taxonoma y accin de los microorganismos y parsitos.
2.- Competencias del trabajo en el laboratorio: 2.1.- Identifica materiales y equipos empleados en el laboratorio. 2.2.- Trabaja en equipo y elabora informes de las prcticas realizadas. 2.3.- Investiga y comprende temas relacionados a la medicina aplicando conocimientos de Microbiologa
III.- INSTRUCCIONES GENERALES

Para el normal desarrollo de las Prcticas de Laboratorio el estudiante deber: 1.- Ser puntual y cumplir las normas de Bioseguridad. 2.- Usar en forma obligatoria Mandil Blanco manga largas. 3.- Leer previamente la prctica correspondiente para su mejor interpretacin. 4.- Mantener disciplina, orden, seriedad y responsabilidad durante la prctica. 5.-Abstenerse de realizar experimentos no autorizado por el docente. 6.-Formar grupos de trabajo que se mantendr durante el semestre acadmico. 7.- Dejar limpio el material utilizado al finalizar la practica 8.- Evitar ruidos y el molestar a los otros compaeros, apagar celulares. 9.-Tomar nota de todos los datos de, observaciones y resultados. 10. Presentar el informe de la prctica a la siguiente sesin de laboratorio. 11. Consultar con el docente sobre alguna duda o inquietud durante la prctica. 12. Lavarse las manos y dejar todo en orden antes de salir del laboratorio. 13. Reponer el material roto o deteriorado durante la prctica.
IV.- NORMAS ADICIONALES

14. No se permitir el ingreso al laboratorio despus de iniciada la prctica. 15. El Informe de laboratorio ser evaluado de acuerdo a lo dispuesto en el silabo. 16. Las practicas son obligatorias las justificaciones por escrito y sustentadas. 17. Observar las normas de Bioseguridad recomendadas.
V.- NORMAS DE BIOSEGURIDAD
1.- Leer cuidadosamente los rtulos de los reactivos a ser utilizados. 2.- Identificar zonas de proteccin y localizacin de extintores en le laboratorio. 3.- Cerrar las llaves de gas despus de cada prctica, evitar fugas de gas. 4.- Solventes inflamables mantenerlos lejos de los mecheros. 5.- No manipular equipos elctricos con las manos mojadas. 6.- Evitar verter agua a los cidos, por generar reacciones peligrosas. 7.- No tocar ni probar sustancia alguna durante la prctica. 8.- No tocarse la cara ni frotarse los ojos mientras se trabaja en el laboratorio. 9.- No pipetear directamente los reactivos, utilizar peras de aspiracin. 10. No coger directamente material de vidrio recientemente calentado. 11. No trasladar varios objetos de vidrio al mismo tiempo. 12. Llevar a cabo la experiencia programada. 13. Si hubiera salpicado reactivo qumico en los ojos lavar con abundante agua. 14. Verter en el lavadero todos los residuos lquidos y dejar correr abundante agua 15. Manipular sustancias de gran evaporacin bajo campanas extractoras.
PRACTICA N 1
CONTENIDO TEMATICO PROCEDIMENTAL:
I UNIDAD
INSTRUMENTAL BSICO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

I.
-
COMPETENCIA:
Reconoce el equipo y/o material bsico del laboratorio Microbiolgico. Conoce el uso ms importante de cada equipo y material observado. Conoce el manejo de microscopio compuesto, horno, autoclave, estufa y bao mara.
II.
-
MATERIAL:
EQUIPOS: Microscopio compuesto, horno, autoclave, estufa, bao mara, frigidez, bomba de vaco, contador de colonias, balanza (normal y analtica), centrifuga. MATERIAL DE VIDRIO: Placas petri, tubos de ensayo, pipetas volumtricas, Pipetas Pasteur, Matraces, Probetas, Vasos de precipitacin, Buretas, Embudos, termmetros, Mechero, Varillas porta laminas, agitador de bagueta, laminas porta y cubre objetos. MATERIAL METLICO: Soportes, Pinzas, Gradillas, Trpode, Asas bacteriologas, Esptula, Mechero de Bunsen. MATERIAL DE PLSTICO: Frascos lavadores, Hipodrmicas. MATERIAL DE MADERA: Gradillas.
III.
-
PROCEDIMIENTO:
Observe y reconozca el material indicado. Represente esquemticamente y describa brevemente el material y/o equipo observado especificando su uso ms importante. Realice prctica de manejo del microscopio, compuesto, Horno, Autoclave, Estufa y Bao Maria siguiendo los lineamientos de las experiencias indicadas a continuacin:
EXPERIENCIA 1: MANEJO DE MICROSCOPIO Y PREPARADO EN FRESCO PARA EXAMEN DIRECTO
Obtener una muestra de sarro dentario con asa bacteriolgica estril. Homogenizar la muestra en solucin salina fisiolgica (S.S.F) estril (1 gota) sobre una lmina o portaobjetos.
Cubrir el preparado con laminilla. Enfoque y observe el microscopio con objetivos de 3.5X, 10X y 40X.
EXPERIENCIA 2.- MANEJO DE HORNO Colocar en el horno el material a esterilizar debidamente acondicionado. Cerrar la puerta y encender la fuente calorfica. Graduar la temperatura del Horno a 170C 180C y mantener el material por espacio de 2 horas.
Precauciones en el manejo:
No abrir la puerta del horno mientras la temperatura en su interior se mantenga elevada un cambio brusco de la temperatura puede causar destrozos en el material de vidrio.
Cuidar de no elevar excesivamente la temperatura; de esta manera se evitara la carbonizacin del papel y tampones de algodn.
etc.
No colocar materiales que pueden ser destruidos por la temperatura como delantales, guantes de goma,
EXPERIENCIA 3: MANEJO DE LA AUTOCLAVE Depositar agua en la caldera hasta unos centmetros de la parrilla. Colocar el material a esterilizar en el aparato. Cerrar la tapa y asegurar el cierre ajustando los tornillos o mariposas, tomando de dos en dos tornillos
diagonalmente opuestos. Dejar abierta la espita. Encender la fuente de calor. Cerrar la espita cuando se produzca un flujo de vapor continuo. Observar la espita cuando se produzca un flujo de vapor continuo. Observar el manmetro y mantener la presin en 15 libras mediante el control de la temperatura (121C) durante 15 a 20 minutos. Iniciar la cuenta del tiempo en el momento que se consigue la temperatura deseada. Apagar el sistema de calefaccin despus del tiempo de esterilizacin. Dejar enfriar hasta que el manmetro marque cero. Abrir la espita para que salga el exceso de vapor de agua. Aflojar los tornillos y levantar la tapa ponindose detrs del aparato para evitar que los vapores lleguen a la cara del operador.
Precauciones en el manejo: Par evitar la perdida de material por ebullicin se recomienda no llenar los recipientes. No colocar los materiales muy juntos. Es preferible dejar espacios libres para favorecer la circulacin de vapor. No apresurar bajar la presin abriendo la espita. Esta medida puede ocasionar perdida de material y rompimiento de los recipientes de vidrio por el cambio brusco de la presin.
EXPERIENCIA 4.- MANEJO DE LA ESTUFA O INCUBADORA Colocar En la estufa el material a incubar: placas petri o tubos de ensayo conteniendo el medio de cultivo
inoculado. Cerrar la puerta y encender la fuente calorfica. Graduar la temperatura de la estufa a 37C o la deseada y mantener el material en incubacin durante 24 o 48 horas.
EXPERIENCIA 5.- MANEJO DEL BAO MARIA Colocar la cantidad de agua suficiente en la canastilla del equipo.
Encender la fuente calorfica. Graduar la temperatura deseada. Colocar dentro del agua el material a calentar y mantenerlo durante el tiempo deseado.
CUESTIONARIO
1. 2. 3. 4. 5. A qu temperatura debe encontrarse una incubadora o (estufa) par el crecimiento de bacterias patgenas? Los medios de cultivo en que material de vidrio se preparan. Que uso tienen las asas? Cul es la temperatura de esterilizacin en autoclave? Cul es la temperatura y tiempo de esterilizacin en el horno?
PRACTICA N 02 y 03:
TINCIN DE LOS MICROORGANISMOS

I.
-
COMPETENCIA:
Ejecuta las tcnicas bsicas de coloracin en el estudio bacteriolgico: Tincin negativa, simple y Gram. Interpreta el proceso de coloracin de las tcnicas estudiadas.
II.
FUNDAMENTO TERICO:
Los microorganismos, a excepcin de los virus, son visibles con el microscopio comn. La observacin puede ser realizada en muestras hmedas sin colorear (examen en fresco) o en preparacin previamente coloreadas. Las tcnicas son mltiples y en un trabajo se eligen aquellas que mejor sirven a un propsito determinado.
Las muestras hmedas (examinadas con poca luz: condensador bajo y diafragma semicerrado) dan informaciones sobre movilidad de microorganismos o sirven para detectar elementos formes en una muestra (leucocitos, cilindros, hemates, etc). Es tambin el mtodo bsico para el estudio parasitoscpico. Para este fin se emplean suspensiones de la muestra en suero fisiolgico u otros diluyentes.
Una muestra hmeda puede ser tambin observada en campo oscuro contraste de fases por mtodos en fluorescencia y otros. En estos casos los propsitos son ms avanzados que los de un examen simple a menor aumento en microscopio corriente. Las coloraciones varan en forma extraordinaria, desde aquellas que usan un solo colorante, como el azul de metileno, hasta otras en las que las tcnicas son ms complejas. Ellas varan de acuerdo con los fines del estudio y guardan relacin con la naturaleza y caractersticas biolgicas del germen que se trata de observar. En las practicas que conforman este primer capitulo se describen tcnicas bsicas de coloracin, tiles en el estudio morfolgico y estructural de los microorganismos. A travs de ellas, es fcil formarse una idea de los mltiples procedimientos ideados por el hombre para objetivar la fiel imagen de los microorganismos.
III.-MATERIALES DE LABORATORIO:
Material Biolgico: -Secrecin farngea. - Sarro dentario - Hisopos estriles. -Cultivo bacteriano Material de Vidrio y Otros: - Lminas portaobjetos. - Mechero de alcohol. - Baja lenguas .
Reactivos y Colorantes: -Alcohol cetona. -lugol para Gram. -Cristal violeta o violeta de genciana. -Safranina. -Azul de metileno. -Nigrosina -Aceite de inmersin. -Solucin salina fisiolgica (SSF 0.9%)
Equipos: -Microscopios.
IV.
-
PROCEDIMIENTOS:
Experiencia 1.- PREPARACIN DE FROTIS Y FIJACIN Muestra: Sarro dentario, cultivos bacterianos o esputo. Esterilizar el asa al rojo vivo en el mechero. Colocar con el asa una gota de S.S.F. en un portaobjetos limpio. Esterilizar el asa. Djela enfriar. Obtener la muestra en pequea cantidad con el asa estril. Frotis o extensin: colocar la muestra e la gota S.S.F del portaobjetos. Con el asa realice una emulsin y extindala por la superficie del portaobjetos. Debe conseguir extensiones finas. Esterilizar el asa. Fijacin: secar al aire la preparacin o pasndola ligeramente por el mechero. Realice 2 preparados de sarro dentario o cultivo bacteriano y una con esputo y proceda con las experiencias siguientes:
o o o -
Experiencia 2.- COLORACIN SIMPLE Muestra: Sarro dentario o cultivo bacteriano. Realice el frotis y la fijacin segn la experiencia 1. Coloraron con una de las soluciones siguientes: Cristal Violeta (violeta de genciana) durante 1 minuto. Azul de metileno de Loeffler durante 5 minutos. Fucsina fenicada (diluida) durante 30 segundos. Lavar en agua corriente. Secar y observar el microscopio con objetivo de inmersin. Esquematice e interprete sus observaciones.
Experiencia 2.- TINCIN NEGATIVA Muestra: Sarro dentario o cultivo bacteriano. Depositar un par de asas del cultivo bacteriano o sarro dentario sobre el porta, y adicionar un asa de la
solucin de Nigrosina. Mezclar totalmente, hacer la extensin y secar al aire. (No secar por el calor). Observar el microscopio con objetivo de inmersin. Esquematice e interprete sus observaciones.
Experiencia 3.- COLORACIN GRAM Muestra: Sarro dentario o cultivo bacteriano. Realice el frotis y la fijacin segn la experiencia 1. Coloracin con Cristal Violeta durante 1 a 2 min. Lavar en agua corriente. Aplicar solucin de yodo (lugol) durante 1 min. Decoloracin con alcohol 95% o alcohol -. Acetona, gota, hasta que no se desprenda color violeta (solo 5-
15 seg. En el caso de las extensiones sean finas y bien hechas). Lavar en agua corriente. Coloraron de contraste, aplicar Safranina durante 10 20 seg. Lavar en agua corriente. Secar y observar el microscopio con objetivo de inmersin. Esquematice e interprete sus observaciones.
V.
RESULTADOS
COLORACION SIMPLE
COLORACION GRAM
CUESTIONARIO
1. 2. 3. 4. 5.
Qu precaucin es fundamental antes de colocar aceite de cedro sobre la lmina? A qu altura se encuentra el endurecedor en la observacin en fresco? A que altura se encuentra el condenador de una muestra colocada? Cul es el comportamiento de las bacterias frente al Gram? En la coloracin simple que tipo de colorante usa de que color abrumo a los microorganismos?
PRACTICA N 4
PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

I.
-
COMPETENCIA:
Conoce la composicin de algunos medios de cultivo de uso comn: slidos, lquidos, medios comunes, enriquecidos, selectivos y diferenciales. Conoce la tcnica de preparacin de medios de cultivo Conoce el proceso de esterilizacin de los medios de cultivo
II. FUNDAMENTO TERICO

los grmenes tienen requerimientos nutritivos variados, los que son tomados en cuenta al preparar un medio de cultivo, cuya composicin varia de acuerdo con las exigencias del germen. En consecuencia, los medios de cultivo son compuestos necesarios para el desarrollo bacteriano y deben contener: a) b) c) d) Sustancias nutritivas apropiadas (protenas, carbohidratos, sales minerales, etc) Tener un pH conveniente; generalmente de 6.8 a 7.6. Estar previamente esterilizados. Estar protegidos de contaminacin.
Los medios pueden tener como finalidad: a) b) c) d) e) f) Aislamiento de grmenes. Identificacin Conservacin Clasificacin Obtencin de toxinas Recoleccin o cosecha para preparacin de vacunas y otros fines.
CLASES DE MEDIOS
Segn su aplicacin se dividen, convencionalmente, en comunes y especiales. Los comunes se destinan al cultivo de la mayora de las bacterias. Ejemplo: Agar o gelosa simple, caldo simple, gelatina, etc. Los especiales tienen distintas finalidades: a) Si se les adiciona sustancias de mayor poder nutritivo, como sangre, liquido asctico, huevo, etc. sirven para cultivar grmenes exigentes e sus requerimientos culturales. Estos se llaman medios mejorados.
b)
Son selectivos aquellos medios cuya finalidad es la de favorecer el desarrollo de determinadas especies bacterianas y la que se pretende aislar. Este efecto se consigue con la adicin e determinadas sustancias de accin ya conidias. Esos son los llamados medios de aislamiento.
c)
Cuando a un medio selectivo se le agrega una sustancia indicadora, el medio se llama selectivo indicador.
III. MATERIAL:
Placas petri estriles Tubos de ensayo estriles Matraces erlenmeyer Mechero, esptula, autoclave y bao mara. Papel indicador de PH Algodn, papel, hilo Balanza
Medios de cultivo:
o Agua peptonada - Peptona: 1.0 g MEDIOS COMUNES: Agar Simple - Peptona: 1.0g
- Cloruro de sodio: 0.5 g. - Agua destilada: 100 ml
- Cloruro de sodio: 0.5g - Agar: 1.5g
- Agua destilada: 100ml
Caldo nutritivo - Peptona - Cloruro de sodio - Extracto de carne: - Agua destilada 1.0g 0.5g 0.3g 100 ml
Agar Nutritivo - Peptona: 1.0g
- Cloruro de sodio: 0.5g - Extracto carne: - Agar: 0.3g 1.5g
- Agua destilada 100ml o Agar Sangre: o Agar CHAPMAN Formula Preparada: - Peptona proteosa - Extracto carne: - NaCl: - d-manitol: 1.0 g 0-1 g 7.5 g 1.0 g Agar simple estril (45C) 95 mL Sangre: 5 mL MEDIOS ENRIQUECIDOS:
MEDIOS SELECTIVOS DIFERENCIALES:
- Rojo de fenol - Agar:
0.25 ml. Viraje; amarillo (PH 6.8)- Rojo (PH 8.4) 1.5 g
Disolver en 100 ml de agua destilada. PH : 7.4
Agar Mac Conkey Formula Preparada: - Peptona: - Peptona proteosa: - Lactosa - Sales biliares: - Cloruro sdico: - Agar: - Rojo neutro: - Violeta Cristal: 1.7 g 0.3 g 1.0 g 0.15g 0.5 g 1.35g 0.003g Viraje: Rojo (PH 6.8)- Incoloro (PH 8) 0.0001 g
Disolver a bao mara en 100 mL de agua destilada PH: 7.1
IV. PROCEDIMIENTOS:
matraz erlenmeyer. Disolver los ingredientes, a bao mara, en la cantidad de agua destilada indicada. Enfriar moderadamente y ajustar el pH entre 6.8 7.4 u otro que fuese indicado. Colocar un tapn de algodn en la boca del matraz y cubrirlo con papel ajustndolo con hilo al cuello del recipiente. a) Esterilizar e autoclave a 121C durante 15 min. Distribuir los medios de cultivo en placas y/o tubos estriles: Los medios lquidos repartirlos en tubos y/o placas estriles frente a la llama de mechero. A los medios slidos repartidos en tubos, antes que solidifiquen, se les dar la inclinacin respectiva. b) Realizar el control de esterilidad de los medios de cultivo incubado los tubos y/o placas en la estufa a 37C durante 24 horas. c) Conservar los tubos y/o placas de medio de cultivo en la refrigeradora hasta su posterior uso. Pesar las sustancias segn indique la composicin del medio de cultivo y agregarlos a un
PRACTICA N 05
TCNICAS DE SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

I.
-
COMPETENCIA:
Al termino de la practica el alumno debe: Adquirir la manuabilidad y destreza en la siembra de microorganismos que le permitan la obtencin de cultivos puros. Realiza el aislamiento de microorganismos mediante las tcnicas de asilamiento por diseminacin y diluciones. Obtiene cultivos puros mediante transplante en caldo, Agar. Inclinado y agar por picadura.
II. FUNDAMENTO TEORICO:

La siembra es el paso inicial en el estudio de las propiedades culturales de un germen. La prctica pretende dar al estudiante la manuabilidad necesaria para sembrar muestras en diversos medios y comprender que la meta del trabajo es el aislamiento de los grmenes. Se efecta utilizando el asa bacteriolgica, una esptula, una torunda o cualquier otra forma que permita una diseminacin de los grmenes en el medio de aislamiento, cuando este es slido. El fin perseguido es el de conseguir que un germen quede aislado de oro en la superficie del medio, donde se reproducir hasta el punto de dar una colonia, cuyos componentes en ultimo termino descienden de un solo germen (o de un acumulo de grmenes de un solo tipo). Esta forma de aislamiento fue un aporte fundamental a la tcnica bacteriolgica y se debe a Roberto Koch. Tambin se puede utilizar medios lquidos para cultivos primarios, sobre todo cuando se trate de aislar anaerobios, debiendo anotarse que en este ltimo caso, no siempre es posible conseguir un cultivo puro.
MODALIDADES DE SIEMBRAS: Para la diseminacin es necesaria una amplia superficie de medio nutritivo, sta se logra en las placas de Petri y en menor medida en el agar inclinado. La tcnica de la siembra en si, consiste en pasar sobre toda la superficie del medio, el instrumento portador del inculo; en esta modalidad es recomendada evitar daar la superficie del medio. Las formas como debe hacerse la diseminacin, se esquematizan en otra hoja. Practicada la siembra, llevar la placa a una temperatura adecuada. Debe observarse que la placa este seca antes de la siembra.
INCUBACIN: Despus de la siembra, debe quedar en la incubadora con la tapa hacia abajo, para que el agua de condensacin (Desprendida por el calor de la estufa) no malogre la siembra. El cultivo por grmenes anaerobios, constituye un procedimiento especial que ser referido al tratar de estos grmenes.
LECTURA DE LA SIEMBRA: Entre las 12 y 24 horas aparecen por lo comn las primeras colonias y es cuando comienzan la observacin del cultivo. En las colonias se estudia la forma, tamao, contorno, coloracin, emulsionabilidad, grado de opacidad, superficie y consistencia. En los medios lquidos se observa el grado de turbidez, pelcula sobre los diversos componentes del medio. Uno de os caracteres fundamentales en una colonia es el referente a su contorno y superficie. Las colonias de contorno regular y superficie lisa, se llaman colonias S (de la palabra inglesa Smooth que significa suave - liso). Las de contorno y superficie irregulares, se llaman colonias R (de Rouge que significa rugoso). Estos aspectos tienen relacin con la virulencia de algunos grmenes. TRANSPLANTE O RESIEMBRA: El estudio macroscpico de las colonias se completa con un estudio microscpico que se realiza emulsionando una fraccin de la colonia en una pequea gota de suero fisiolgico o agua cuidando que la extensin sobre la lmina sea fina. Se fija, se colorea y se observa su inmersin. Luego se proceder al transplante o resiembra que consiste en tonar con el asa la fraccin de la colonia elegida (repicaje de colonias) y llevar este inculo a otro medio liquido o slido en el que se obtendr el desarrollo de una sola especie de grmenes, lo cual constituye la fase final del proceso de aislamiento. El germen aislado en estado de pureza constituye una cepa, aunque el termino se reserva con mas estrictez a grmenes cuyas propiedades han sido profundamente estudiadas y sirven inclusive como patrones de comparacin. Los procedimientos de siembra en los transplantes varan segn el medio que se va a usar. Si el medio es liquido, bastar tocar la superficie de este con el inoculo. Si el medio es slido varia la forma de siembra siendo en unos casos por estra, o sea pasando el inculo en zig-zag sobre la superficie del medio inclinado, y en otros por puncin o picadura, que consiste en introducir la aguja hasta el fondo o a poca profundidad segn la naturaleza del medio. El asa se esteriliza al rojo antes y despus de su empleo. Los tubos y petri se marcan con un lpiz para vidrio poniendo nombre o numero de registro, fecha u otro dato importante.
III MATERIAL:
Suspensin bacteriana Mixta: Streptococos, Staphylococcus, E. coli. Asa bacteriolgica, placas petri estriles. Pipeta estril: 1ml Mechero. Placas de Agar Nutritivo Tubos de 5 ml de Agar Nutritivo a 50C. Placas con colonias bacterianas. Tubos con 5ml de Caldo Nutritivo estril. Tubos con Agar Nutritivo inclinado. Tubos con Agar Nutritivo.
III.
PROCEDIMIENTOS:
1. MTODO DE AISLAMIENTO.-
i. -
AISLAMIENTO POR DISEMINACIN (mtodo en superficie). Esterilizar un asa bacteriolgica y dejar enfriar por 5 sg. Con el dedo meique de la mano derecha quite el tapn de algodn del tubo con suspensin
bacteriana; flamee la boca del tubo; introduzca el asa bacteriolgica y retire una asada de la suspensin; vuelva a flamear el tubo por sus bordes y coloque de nuevo el tapn de algodn; deje el tubo en la gradilla. Flamear los bordes de una placa de agar nutritivo u otro medio. Levante la tapa de la placa justamente lo necesario para introducir el asa bacteriolgica cuya carga es diseminada por la superficie del agar mediante el proceso de estriacin por agotamiento. Segn esto la primera estriacin contendr ms cultivo que la segunda, esta ms que la tercera y as sucesivamente de modo que en las ltimas estar suficientemente agotado para dar colonias sueltas. posterior. Incubar las placas en posicin invertida a 37C por 24 hs. Realizar el estudio de las colonias y/o realice el Transplante de las colonias para obtener cultivos puros. 1 2 3 4 5 Marcar las placas sembradas, con lpiz graso, a fin de que permitan su identificacin
ii. -
AISLAMIENTO POR DILUCIONES SUCESIVAS (FIG.2) Tomar 3 4 tubos de agar nutritivo. Llevar a bao mara hasta que el agar se licue completamente,. Deje enfriar a 45 50C. Tomar el 1er tubo y agregar 0.1 ml de la suspensin bacteriana (muestra); mezclar bien
rodando el tubo entre las palmas de las manos. Extraer 0.1 ml de esta mezcla y llevar a un 2do tubo; mezclar bien. Extraer de esta 2da mezcla 0.1 ml y llevar a un 3er tubo, mezclar bien. Continuar con un 4to tubo si fuese necesario. Inmediatamente y antes de que el medio se solidifique verter en placas estriles por separado. Dejar enfriar en posicin horizontal sobre superficie plana. Incubar las placas en posicin invertida a 37C por 24 hs. Realice el estudio de las colonias y/o transplante las colonias para obtener cultivos puros.
2 Suspensin bacteriana 3
2.
MTODOS DE TRANSPLANTE: i. SIEMBRA POR ESTRAS EN AGAR INCLINADO: Esterilizar una aguja bacteriolgica. Dejar enfriar 5sg. Tomar con la mano izquierda una placa con colonias en desarrollo, flamee los bordes de la placa y levante justamente lo necesario para introducir la aguja bacteriolgica y extraer una colonia.
Tomar un tubo con agar inclinado: con el dedo meique de la mano derecha quite el tapn de algodn; flamee la boca del tubo; introduzca la aguja bacteriolgica que contiene la colonia y realice la siembra por estras sobre la superficie del agar inclinado (Fig. 3).
Retire la aguja bacteriolgica, vuelva a flamear el tubo por sus bordes y coloque de nuevo el tapn de algodn. Deje el tubo en la gradilla.
Marcar los tubos a fin de identificarlos posteriormente. Incubar los tubos sembrados a 37C durante 24 hs. Realice el estudio de las caractersticas del cultivo.
ii. -
SIEMBRA EN AGAR POR PICADURA Realice los pasos 1 y 2 del mtodo anterior. Tomar un tubo con agar no inclinado y con el dedo meique de la mano derecha quite el
tapn de algodn; flamee la boca del tubo; introduzca la aguja bacteriolgica que contiene la colonia y realice la siembra por picadura en el agar profundo. (FIG. 4)
Retire la aguja bacteriolgica; vuelva a flamear el tubo por sus bordes y coloque de nuevo el tapn de algodn deje el tubo en la gradilla.
Marcar los tubos a fin de identificarlos posteriormente. Incubar los tubos sembrados a 37C durante 24 horas. Realice el estudio de las caractersticas del cultivo.
iii. -
SIEMBRA EN CALDO Esterilizar una aguja bacteriolgica. Dejar enfriar 5 seg. Tomar con la mano izquierda una placa con las colonias en desarrollo, flamee los bordes de
la plazca y levante justamente lo necesario para introducir la aguja bacteriolgica y extraer una colonia. Tomar un tubo con caldo nutritivo; con el dedo meique de la mano derecha quite el tapn de algodn, flamee la boca del tubo, introduzca la aguja bacteriolgica que contiene la colonia y realice la siembra por suspensin en el medio liquido. (FIG. 5). Retire la aguja bacteriolgica; vuelva a flamear el tubo por sus bordes y coloque de nuevo el tapn de algodn. Deje el tubo en la gradilla. Marcar los tubos a fin de identificarlos posteriormente. Incubar los tubos sembrados a 37C durante 24 horas. Realice el estudio de las caractersticas del cultivo.
RESULTADOS:
AGAR NUTRITIVO
CALDO NUTRITIVO
PRACTICA N 6
PRUEBAS BIOQUMICAS PARA LA IDENTIFICACIN DE BACTERIAS

I. bacterias. efectuadas. Realiza las lecturas e interpretaciones correspondientes de las pruebas bioqumicas COMPETENCIAS: Realiza algunas pruebas bioqumicas que son de utilidad general para la identificacin de
II.
MATERIAL Y MTODOS:
EXPERIENCIA N 1
DEGRADACIN DE GLUCOSA-LACTOSA- SACAROSA Y PRODUCCIN DE GAS Y H2S (PRUEBA TS1: TRIPLE Azcar, Hierro) 1. Finalidad: Incluye varias pruebas que permite determinar: La utilizacin microbiana de glucosa, lactosa y/o sacarosa. La produccin microbiana de gas y cidos. La produccin de H2S.
2. -
Medio de cultivo: Agar TS1: Extracto de carne.................... 0.3 g.
Extracto de levadura ............... 0.3 g.
pH: 7.3 0.1
Peptona ................................... 1.5 g. Proteosa peptona .................... 0.5 g. Glucosa .................................. 0.1 Lactosa .................................. 1.0 Sacarosa ................................ 1.0 Slfato ferroso ...................... 0.02 Cloruro sodico ...................... 0.5 Tiosulfato sodico ............... 0.03 Agar ................................... 1.2 Rojo fenol ..................... 0.0024 H2O destilada .....................100 g. g. g. g. g. g. g. g. ml
EL indicador Rojo de fenol a pH: 8.4 (alcalino) vira a rojo y a pH: 6.8 (cido) vira a amarillo.
Se dispone en el comercio este medio en forma deshidratada; prepararlo en la forma indicada en el envase. Repartir en tubos de 150 x 16 mm, llenando un tercio de los mismos y tapar de modo que se mantengan en condiciones de aerobiosis durante su utilizacin. Enfriar los tubos en posicin inclinada.
3.
Cultivos Bacterianos: Cepas de Proteus vulagris, Salmonella tiphi y Escherichia coli.
4.
-
PROCEDIMIENTO:
Siembra: tomar 4 tubos de agar TSI inclinado y con lpiz de cera rotulados del 1 al 4. inocular P. vulgaris en el tubo 1; S.tiphi en el tubo 2; y E. coli en el tubo 3. el tubo 4 no inocular, servir de control. La inoculacin se realiza introduciendo una sola vez, el asa bacteriolgica de extremo recto por el centro basta tocar el fondo del tubo, retirar por el mismo trazo y sembrar en estra la pare inclinada. a) Incubacin: incubar a 37C durante 24 horas. Lectura , simbologa e interpretacin del TSI: La produccin de H2S se manifiesta por el precipitado negro en el medio (H2S positivo). Se simboliza de acuerdo a su intensidad de 1+ a 4+. b) La presencia de gas se manifiesta por el resquebrajamiento del medio (Gas positivo). Se simboliza segn su intensidad de 1+ a 4+. c) d) La Acidez se manifiesta por un cambio del medio al color amarillo (acidez positiva). Se simboliza con la letra A. La alcalinidad en este medio se manifiesta por su cambio al color grosella (alcalinidad positiva). Se simboliza con la letr K. e) La degradacin de la glucosa se manifiesta por la alcalinidad en la parte inclinada (K) y acidez en el fondo (A) (Glucosa +) se simboliza por K/A. f) La degradacin de la Lactosa y/o sacarosa se manifiesta por el cambio total del medio al color amarillo. (lactosa y/o sacarosa +). Se simboliza por A/A.
EXPERIENCIA N 2
PRUEBA DE PRODUCCIN DE INDOL
1. 2.
Finalidad: poner de manifiesto la produccin microbiana de Indol a partir del aminocido triptfano. Medio de cultivo: Agar SIM, Caldo Triptona (o agua de peptona) Caldo triptona: pH : 7.2 Repartir en tubos (5 ml) y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 min. La triptona es el tipo de peptona recomendada para esta prueba ya que es rica en triptfano. Triptona.................1-2 g. NaCl.....................0.5 g. H2O destilada...........100 ml.
3. -
Reactivos: Reactivo de Kovacs para Indol Para dimetil amino benzaldehido ...... 5 g Alcohol anilico.......................75 g HCL concentrado.......................25 ml
Se disuelve el aldehido en el alcohol y luego se aade lentamente el cido. Se guarda en nevera. Se prefiere este reactivo porque es mas sensible, debido a l mayor solubilidad del complejo coloreado en la capa de alcohol. 4. 5. de control. Incubacin: incubar a la temperatura de 37C. durante 24 a 48 hrs. Lectura: aadir 0.5 ml del reactivo de Kovacs para indol, se agita suavemente y luego esposar en posicin vertical. Anotar como prueba positiva si aparece un color rojo intenso, que se separa en la capa correspondiente al alcohol. Interpretacin: Una prueba positiva indica produccin de Indol a partir del aminocido triptfano. Esquematice sus observaciones y anote sus resultados. Realice un calendario de la prueba y plantee su conclusin. Cultivos bacteriolgicos: E. coli, Proteus , Shigella, y otros. Procedimiento: Siembra: tomar 2 tubos, inocular uno de los tubos con la cepa problema. El otro tubo servir
EXPERIENCIA N 3
PRUEBA DEL CITRATO
1. Finalidad: Determinar la utilizacin del citrato por bacterias como la nica fuente de carbono.
2. Medio de cultivo: Agar Citrato de Simons 3. Cultivo bacteriano: Cepas de Proteus 4. Procedimiento -Siembra; Sembrar un inculo de Proteus, por picadura en la columna de agar y poe estra en la superficie inclinada, en un tubo de agar citrato de Simons inclinado. Utilizar para esto una asa bacteriolgica con el alambre recto a fin de sembrar el inculo pequeo.
-Incubacin : Incubar a 37 C por 24 a 48 hs. Lectura: Observar ambos tubos y anotar como reaccin positiva(Citrato +) si el crecimiento es visible; y como reaccin negativa(citrato -) si no lo es. El crecimiento se manifiesta por cambio de color: verde a azul. El color azul es por la presencia en el medio del indicador azul de bromo timol que a pH 6.0(cido) vira a amarillo y a pH 7.6 (alcalino) vira a azul.
EXPERIENCIA N 4
DESCARBOXILACION DE LA LISINA, PRODUCCIN DE INDOL Y H2S (Agar lisina fierro:LIA )
1. Finalidad: Incluye varias pruebas que permite determinar: La utilizacin microbiana de la lisina por los mecanismos de descarboxilacin y desaminacin. Demostrar la produccin de Indol y H2S.
Aunque la produccin de H2S, como producto de la degradacin microbiana de aminocidos no tiene mayor importancia en el medio LIA sin embargo, solamente se le considera de valor cuando en el TSI sea negativo y en el LIA positivo.
2. Medio de cultivo: Medio Agar Lisina Hierro (LIA):
EL indicador Rojo de fenol a pH: 8.4 (alcalino) vira a rojo y a pH: 6.8 (cido) vira a amarillo. Se dispone en el comercio este medio en forma deshidratada; prepararlo en la forma indicada en el envase. Repartir en tubos de 150 x 16 mm, llenando un tercio de los mismos y tapar de modo que se mantengan en condiciones de aerobiosis durante su utilizacin. Enfriar los tubos en posicin inclinada.
5.
Cultivos Bacterianos: Cepas de Proteus vulagris, Salmonella tiphi y Escherichia coli.
6.
-
PROCEDIMIENTO:
Siembra: tomar 4 tubos de agar TS1 inclinado y con lpiz de cera rotulados del 1 al 4. inocular P. vulgaris en el tubo 1; S.tiphi en el tubo 2; y E. coli en el tubo 3. el tubo 4 no inocular, servir de control. La inoculacin se realiza introduciendo una sola vez, el asa bacteriolgica de extremo recto por el centro basta tocar el fondo del tubo, retirar por el mismo trazo y sembrar en estra la pare inclinada. g) Incubacin: incubar a 37C durante 24 horas. Lectura , simbologa e interpretacin del TS1: La produccin de H2S se manifiesta por el precipitado negro en el medio (H2S positivo). Se simboliza de acuerdo a su intensidad de 1+ a 4+. h) La presencia de gas se manifiesta por el resquebrajamiento del medio (Gas positivo). Se simboliza segn su intensidad de 1+ a 4+. i) j) La Acidez se manifiesta por un cambio del medio al color amarillo (acidez positiva). Se simboliza con la letra A. La alcalinidad en este medio se manifiesta por su cambio al color grosella (alcalinidad positiva). Se simboliza con la letra K. k) La degradacin de la glucosa se manifiesta por la alcalinidad en la parte inclinada (K) y acidez en el fondo (A) (Glucosa +) se simboliza por K/A. l) La degradacin de la Lactosa y/o sacarosa se manifiesta por el cambio total del medio al color amarillo. (lactosa y/o sacarosa +). Se simboliza por A/A.
REALIZAR EL SIGUIENTE ESQUEMA DE SIEMBRA:
AGAR AGAR UREA CITRATO AGAR LIA AGAR TSI AGAR SIM
DE
Siembra en la superficie en forma de zig-zag
(Estra)
Se pica en el fondo y luego se realiza un zig-zag en la superficie
Se pica en el centro del medio
Despus de realizar las siembras llevar a incubar a la estufa calibrada de 35 37 C por 24 horas. Observar los resultados.
18
PRACTICA N 7
EL ANTIBIOGRAMA
I.
COMPETENCIAS:
Determina la sensibilidad in vitro de los microorganismos frente a los antibiticos. Selecciona los antibiticos adecuados en al terapia especifica de infecciones bacterianas.
II.
MATERIAL Y PROCEDIMIENTO:
Los mtodos usados en la determinacin de la sensibilidd in vitro de las bacterias a los diferentes antibiticos, pueden ser clasificados en: 1. Mtodos de dilucin 2. Mtodos de difusin.
1.
MTODOS DE DILUCIN: En los que la sensibilidad es medida por la inhibicin del crecimiento de los microorganismos en una serie de tubos con medios de cultivo lquido o placas con medio slido y concentraciones crecientes de antibiticos.
2.
MTODOS DE DIFUSIN: En medio slido (MUELLER HINTON), en el que la sensibilidad es
medida por los Halos de inhibicin que se obtienen alrededor de discos de papel absorbente o cilindros que contienen cantidades conocidas de un antibitico. Para le trabajo prctico, se prefiere por lo comn el sistema de difusin en medio slido por su sencillez aunque tenga el inconveniente de su relativa inexactitud.
ESQUEMA DE LA PRCTICA:
a) b) Utilizar placas de Petri con medio de cultivo adecuado a las necesidades nutritivas del germen a estudiar. Emplear como inoculo una suspensin en suero fisiolgico de grmenes provenientes de u cultivo puro, de 18 a 20 horas y con una concentracin aproximadamente de 600 millones de grmenes por ml. Esto se determina por turbidimetra, comparando con patrones conocidos. Puede emplearse un cultivo de Escherichia coli u otro. c) Sembrar el inoculo regando con una pipeta toda la superficie de la placa, y luego extraer el exceso del liquido con la misma pipeta. A continuacin, colocar cada uno de los discos, en concentraciones determinadas, utilizando para el caso unas pinzas; l separacin entre los discos debe ser de ms o menos 3 cms. d) e) Incubar las placas a 37 c por 18 a 24 horas. Leer los resultados, tomando en cuenta los halos de inhibicin del crecimiento en torno a los discos colocados en la placa. Se aconseja dividir los grmenes en sensibles y resistentes segn su comportamiento frente la antibitico (halo de inhibicin). f) Esquematice las observaciones.
MEDIO MUELLER HINTON Dejar reposar por 2 3 minutos, luego llevar a incubar por 18 24 horas a por 35 37 C . La LECTURA se efecta por HALOMETRIA (de acuerdo a la zona de inhibicin del crecimiento bacteriano que presenta el frmaco). Se debe tener en cuenta los parmetros de lectura: mayor de 12mm Sensible y menor de 12mm Resistencia. INTERPRETACIN:
ANTIBIOTICOS
AMPICILINA CIPROFLOXACINA ERITROMICINA SULFAMETOXAZOL NORFLOXACINA GENTAMICINA CEFAZOLINA PENICILINA CLORAMFENICOL ERITROMICINA
MEDIDA DEL HALO
PARAMETRO
CUESTIONARIO
a) b) c) Qu opinara usted si dentro de un ntido halo de inhibicin desarrollan varias colonias? Qu factor tomara en cuenta para elegir un antibitico adems del resultado del Antibiograma? Qu opinara si los discos antibiticos pertenecientes a un lote producen un efecto frente a un germen y discos del mismo antibitico de otro lote no produce efecto alguno?
PRACTICA N 8 CONTENIDO TEMATICO PROCEDIMENTAL:
ACCIN DE LOS AGENTES FSICOS Y QUMICOS SOBRE EL DESARROLLO BACTERIANO

-COMPETENCIA:
Observa la accin de los agentes fsicos y qumicos sobre las bacterias.
-MATERIAL Y PROCEDIMIENTO:
I. a) b) c) ACCIN DE LA TEMPERATURA: Sembrar tubos con caldo de cultivo con cepas de Micrococcus y Bacillus subtilis esporulados. Someterlos a temperatura de ebullicin durante diferentes periodos de tempo: 1, 5 y 10. Marcar y llevar a incubar a 37C por 24 horas. Leer los resultados.
II.
ACCIN DEL Ph: Sembrar cepas de Escherichia coli y Bacillus subtilis en tubos de caldo nutritivo de pH 2.7 y 10. Incubar a 37C por 24 horas y leer los resultados.
III. a) b)
ACCIN DE AGENTES QUMICOS: Sembrar capas de Micrococcus y Escherichia coli en placas de agar. Colocar en la superficie sembrada, discos estriles de papel filtro embebidos en cada uno de los siguientes elementos: 1. 2. 3. 4. Alcohol al 70% Formaldehdo al 10% Fenol al 1% Amphyl al 1/500
Incubar a 37C por 24 horas y leer los resultados. El numero de agentes fsicos y qumicos que pueden ser ensayados, es muy grande y las condiciones de la prueba pueden variar enormemente.
CUESTIONARIO
a) b)
A que factor biolgico atribuye usted el resultado obtenido al aplicar la temperatura? Por qu las `lacas de cultivo sembradas se incuban a 37C?
c) Qu explicacin dara usted a la accin de los agentes qumicos?
FASES DEL ESTUDIO BACTERIOLGICO DE UN PRODUCTO
Los productos que mas usualmente son objeto de la investigacin microbiolgica son: pus de diverso origen, esputo, sangre, heces, orina, secreciones, liquido cfalo raqudeo (L.C.R), piezas operatorias, contenido gstrico, alimentos, agua, aire, tierra, y en general todo elemento en el que sospeche la presencia de grmenes.
En todo trabajo de esta naturaleza con las variantes necesarias, deben observarse los siguientes pasos:
A)
OBTENCIN DE LA MUESTRA: Es fundamental que la muestra sea obtenida en recipientes estriles y evitando la contaminacin por grmenes ajenos al producto que es motivo de estudio. Las directivas varan de acuerdo con las muestras en el caso de productos alimenticios, las muestras examinadas debern tener adems un valor representativo en relacin con un conjunto.
B)
DATOS REFERENTES A LA MUESTRA: Nombre del paciente, edad, hospital, sala y cama que ocupa si esta internado, numero de historia clnica, zona del organismo de donde ha sido tomada la muestra y fecha de obtencin, mtodo empleado para la obtencin. Si se trata de otro tipo de productos, debe identificarse su naturaleza y origen y precisarse el tipo de examen solicitado.
C)
EXAMEN MACROSCPICO: Aspecto macroscpico (Caracteres organolpticos)
D)
EXAMEN MICROSCPICO: En fresco. Coloraciones: comunes Espaciales.
E)
CULTIVOS: Siembra: Medios comunes- Medios especiales. Resiembra a medios diferenciales (estudio bioqumica)
F) G) H) I) J)
PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBITICOS (cuando esta indicada) ESTUDIO SEROLGICO INOCULACIONES (en caso necesario) RESULTADOS INFORME Estos lineamientos generales son los que deben seguirse en el estudio de muestras remitidas al laboratorio. Una ficha completa debe contener los datos clnicos ms importantes del paciente, en caso de investigaciones especiales. Es imprescindible que todo estudio microbiolgico sea practicado inmediatamente despus de obtenida la muestra a fin de impedir todo efecto agregado, dependiente de contaminaciones o perdida de viabilidad del germen o grmenes en estudio.
II UNIDAD
PRACTICA N 09
CONTENIDO TEMATICO PROCEDIEMNTAL
BACTERIOLOGIA
COMPETENCIAS :
Los trabajos de laboratorio correspondientes al capitulo de Bacteriologa, estn orientados a los siguientes competencias: A) Conoce las fuentes de aislamiento de los grmenes y estudiar sus principales aspectos morfolgicos, tintoriales y culturales, incidiendo en aquellas pruebas de orden bioqumica, serolgico y biolgico (inoculaciones) que sean necesarias para su identificacin y para la mejor comprensin de su patogenicidad. B) Familiariza al estudiante con las tcnicas de Bacteriologa, consistentes en el manejo de medios, colorantes y reactivos empleados para la deteccin y caracterizacin del germen o grmenes presentes en una muestra determinada. El orden de presentacin de los asuntos sigue la secuencia natural y lgica de un procedimiento de identificacin bacteriana a fin de facilitar una mejor comprensin de las experiencias programadas.
PRACTICA N 09
Genero STAPHYLOCOCCUS
Especies: S. aureus y S. epidermidis
COMPETENCIA
Observa e identifica el comportamiento de los Gneros Staphylococcus en diferentes medios de cultivo, as mismo ver su grado de patogenicidad a travs de pruebas bioqumicas.
MATERIALES:
Muestras y su procedencia: Los productos a parir de los cuales es posible aislar este germen pueden ser: pus de diverso origen, secrecin de lesiones superficiales o profundas, esputo, heces, (en nios), sangre (por hemocultivo), orina, etc. tambin se investiga Staphylococcus en alimentos, bebidas, en material hospitalario, ambientes y otros. Examen directo: colorear con Gram extensiones de la muestra elegida. Observar que el germen es un coco Gram positivo, que se presenta aislado, en diplococos o en racimos. Carece de espora y de cpsula. Aislamiento: Sembrar la muestra por estra, empleando un aza, en los siguientes medios repartidos en placas: agar sangre y Chapman. Composicin, preparacin y comportamiento de los medios:
MEDIO DE CHAPMAN: Extracto de carne .............. 1 grs
Protesosa peptona .............. 10 grs Clroruro de sodio .............. d-Mannitol ...................... 75 grs. 10 grs.
Agar ............................ 15 grs Rojo de fenol ................... 0.025 grs Agua destilada .................. 1,000 ml pH .............................. 7.2 7-4
En este medio crece el Staphylococcus con colonias grandes, algo opacas, convexas, de superficie brillante. Hay inhibicin del desarrollo de otros grmenes, a excepcin de los bacilos difteroides y Bacillus, cuya morfologa es francamente diferente a ka del Staphylococcus. Las cepas que fermentan la manita (d-mannitol positivas) presentan colonias amarillas por acidificacin del medio. Ese medio se utiliza nicamente cuando la muestra es altamente contaminada.
AGAR SANGRE: Este medio se prepara agregando 10 cms. De sangre a cada 100 de agar simple estril, previamente licuado y a una temperatura de mas o menos 45 C. se reparte en tubos o en petris con la mxima esterilidad. La sangre empleada pede ser humana, de conejo, de carnero u otro animal. Para pequeos volmenes se prefiere la del conejo; la extraccin en ese se hace directamente del corazn o de la vena marginal de la oreja. Controlar la esterilidad en estufa.
En este medio, el Staphylococcus crece con notable rapidez y en algunos casos produce hemlisis, el que se manifiesta por un halo claro alrededor de la colonia. Es preciso distinguir las colonias de este germen de las correspondientes a oros grmenes que pueden crecer al mismo tiempo. En agar simple el germen desarrolla con facilidad y presenta colonias grandes. Blanquecinas y opacas.
PRUEBAS DE PATOGENCIDAD IN VITRO Test de Coagulasa Proporcin del medio: se obtienen plasma citratado a partir de sangre total, tomada con anticoagulante y centrifuga de gran velocidad durante 10 minutos. El plasma as conseguido, se diluye al medio y al cuarto (1 para 1 1 para 3) en suero fisiolgico estril y se reparte en tubos de hemlisis a razn de medio centmetro por tubo. Para realizar la prueba se adiciona una azada llena de cultivo de 24 horas de Staphylococcus o medio centmetro de un cultivo en caldo de la misma edad y se incuba a 37C cuando la cepa ensayada es coagulasa positiva se producir coagulacin, la que se pone de manifiesto a los pocos minutos o pasadas varias horas. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD IN VIVO Inoculaciones: Elegir de preferencia el conejo, que muere pasada una semana con lesiones diversas en el organismo. Si la muere es muy precoz, la causa puede ser una toxemia.
ESQUEMA DE LA PRCTICA Emplear una muestra de pus conseguida en el Hospital, colorear con Gram, sembrar agar sangre y Chapman (en placas). Incubar y leer. Realizar pruebas de patogenicidad empleando plasma citratado (y medio con DNA).
Dibujar las observaciones microscpicas y anotar detalladamente los resultados de los cultivos y las pruebas complementarias.
PROCEDIMIENTO:
PRIMERA PARTE
Realizar la toma de secrecin farngea con Ayuda del hisopo estril, evitando su contaminacin. Dejar la muestra tomada en una de las esquinas de las placas con Agar Sangre y Chapman. Con el asa de siembra en aro realizar la siembra en estra; con el mismo hisopo realizar un frotis en una lmina portaobjeto. Hacer una coloracin Gram con el frotis. OBSERVAR A 100X.
AGAR SANGRE
Llevar las placas a incubar por un tiempo de 18-24 horas a 35- 37C.
AGAR CHAPMAN
FROTIS
OBJETIVO DE 100X
NOTA: El mismo procedimiento se realiza con la muestra de secrecin de herida. RESULTADOS A LAS 24 HORAS:
PLACA DE AGAR SANGRE DESCRIPCIN:
PLACA DE AGAR CHAPMAN
SEGUNDA PARTE PRUEBA DE LA CATALASA:

A.-PROCEDIMIENTO: Coger una porcin de la colonia sospechosa y colocar en una lmina portaobjeto Agregar una gota de peroxido de hidrgeno (H2O2) y OBSERVAR la reaccin.
CATALASA (+)= Burbujas. CATALASA (-)= No Burbujas. B.-RESULTADO:
PRUEBA DE LA CUAGULASA: A.-PROCEDIMIENTO: Coger una porcin de colonia catalasa positiva con una esptula de madera. Agregar en el caldo plasma dicha colonia, homogenizar. Llevar a incubar a 37 C por 2 4 horas, OBSERVAR.
COAGULASA (+)= Coagulo. COAGULASA (-)= No Coagulo.
B.-RESULTADO:
CUESTIONARIO
A.- A que es debido el halo claro que se observa alrededor de la colonia de Staphylococcus en el agar sangre? B.- Qu significacin tienen la prueba de la coagulasa como medio de diferenciar especies? C.- es posible hacer el diagnostico de S. aureus por la coloracin de Gram? D.- Qu muestras examinara en el caso de surgir una epidemia de Staphylococcus en una sala de nios?
PRACTICA N 10
CONTENIDO TEMATICO PROCEDIEMNTAL:
GENERO STREPTOCOCCUS - Streptococcus pyogenes

COMPETENCIA:
Los de orden general, haciendo adems nfasis en la respuesta inmunolgica del husped.
MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS:
La muestra y su Procedencia: Los productos a partir de los cuales se puede aislar el Streptococcus, son entre otros, secreciones de lesiones drmicas (imptigo y ectima), esputo, orina, lesiones amigdalianas y faringeas, procesos ticos y masteoideos. Se asla con frecuencia de loquios (en infecciones puerperales) y en muchas otras muestras.
Examen directo: Colorear con Gram y observar que el germen es Gram positivo, dispuesto en cadenas de diplococos, sobre todo cuando procede de medios fluidos. No capsulado. (en fresco, es inmvil).
Aislamiento: Emplear agar sangre en placas y caldo Thioglicolao.
Composicin , preparacin y comportamiento de los medios: Agar sangre: Observar el aspecto puntiforme y traslucido de las colonias y la accin sobre el medio que puede variar desde hemlisis completa (beta) y meta hemlisis (alfa) hasta ausencia de accin (gamma). (Comparar estas caractersticas con las del Sthaphylococcus, que tiene colonias opacas y grandes).
Caldo Thioglicolato: Casitone ......................... 15 grs
Exracto de levadura ..............5 grs Dextrosa ......................... 5.5 grs
Cloruro de sodio.................. 2.5 grs l-Cystina ........................ 0.5 grs 0.5 grs
Thioglicolato de sodio ........... Agar ............................. Rezazurin......................... 0.75 grs 0.001 grs
Agua destilada ................... 1,000 ml
Este medio se reparte en tubos a razn de 10 ml por cada uno. Con frecuencia el Streptococcus es anaerobio o microaerofilo y desarrolla bien en este medio aunque el cultivo sea negativo, sea aerobiosis (agar sangre). El germen desarrolla en grumos pequeos sin producir turbidez. Cuando se trata de muestras muy contaminadas de las cuales se desea aislar preferencialmente el Streptococcus, adicionar el agar sangre de sodio a la concentracin de 0.2 grs. Por mililitro. Esta adicin da al medio una propiedad selectiva.
ESQUEMA DE LA PRCTICA: Emplear como muestra la secrecin faringea de los estudiantes, la que ser coloreada con Gram y sembrada en agra sangre (en placas) sin azida y en agar sangre con azida. En caso de existir muestra de loquios, sembrar en agar sangre en tubos y en thioglicolato (caldo). Incubar a 37C. Observar la accin del germen sobre la sangre; registrar los resultados y hacer los dibujos pertinentes.
GENERALIDADES:
CARACTERSTICAS DE CRECIMIENTO: MEDIOS DE CULTIVO
AGAR
STAPHYLOCOCCUS
STREPTOCOCCUS Colonias pequeas puntiformes Si Hemlisis
SANGRE: medio de Colonias grandes y mucosas. enriquecimiento. Utilizacin: observar Hemlisis Si Hemlisis. de tipo Alfa, Beta y no hemlisis. CHAPMAN: medio selectivo. Utilizacin: observar especie de Staphylococos. AGAR
Buen crecimiento
Escaso crecimiento o nulo.
CUESTIONARIO: a) b) Qu tipo de agrupacin adopta el Streptococcus? Es paralela a la clasificacin serologica la clasificacin del Streptococcus segn su comportamiento en el agar sangre? c) d) Qu significacin atribuye usted a la presencia de Streptococcus en faringe de personas aparentemente normales? Qu diferencias bsicas podra usted sealar entre las colonias de Streptcoccus y la de Staphylococcus?
PRACTICA N 11
DETERMINACIN DE ANTIESTREPTOLISINAS
COMPETENCIAS: Esta prctica tiene por objeto demostrar la accin inhibitoria del suero de los pacientes afectados por Streptococcus beta hemoltico frente a la Estreptolisina O del germen. Expresa, en ltimo termino un estado inmunolgico del husped por accin de una toxina del parsito.
MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS: Para la determinacin se utiliza como antgeno la estreptolisina O, que se adquiere en el comercio debidamente standardizada y se diluye segn indicacin de la casa productora. Los glbulos rojos humanos grupo O o de conejo, lavados tres veces con la siguiente solucin isotnica bufferada: ClNa .................. 7.4 grs 3.17 grs 1.81 grs
KH2 PO4................ Na HPO4...............
H2O destilada..............1,000 ml Hacer una suspensin al 5%. El suero del paciente se diluye con la solucin bufferada a fin de obtener las siguientes diluciones:
1/10
1/100
1/ 500
En tubos 13 x 100 se colocan las diluciones del suero y ms reactivos e cantidades que se indican en el cuadro de la pgina siguiente:
CUESTIONARIO: A.-Qu significa la ausencia de hemlisis en una mezcla de hemates, de Estreptolisina 0 y de suero de un B.-Un titulo elevado de antiestreptolisinas Significa enfermedad lejana, actual o reciente? paciente?
PRACTICA N 12
CONTENIDO TEMATICO PROCEDIEMENTAL:
Diplococcus pneumoniae (NEUMOCOCO)

COMPETENCIAS Los de orden general.
MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS: De la Muestra y su procedencia: las dos fuentes esenciales de aislamiento del Neumococo son el esputo, en el cursote una neumona lobar y el liquido cfalo raqudeo, en la meningitis pigenas causadas por este germen. Tambin es habitante aparentemente inofensivo en tracto respiratorio alto.
Examen directo: Observar con coloraciones simples o con la de Gram, la morfologa caracterstica de dos cocos lanceolados opuestos por las bases. Esta agrupacin va rodeada por un halo claro que es la cpsula.
Aislamiento: Sembrar las muestra en agar sangre (placas). Incubar y observar a las 24 horas la apariencia de las colonias (puntiformes, translucidas) y con un halo verdoso de metahemlisis, semejante al observado en S. pyogenes alfa hemoltico. En agar chocolate las estras de siembra son de color amarillento.
Composicin y comportamiento de los medios (para estudios complementarios) Para caractersticas del agar sangre, ver la practica N y para el agar chocolate, la N
MEDIO DE HISS Suero sanguneo............. Agua destilada ............. Inulina .......................... Rojo de fenol.............. 1 parte 2 partes 1% c.s
PRUEBA DE LA BILIS.PROCEDIMIENTO a) A medio centmetro de un cultivo en caldo, adiciones 0.1 a 0.5 de bilis, obtenida en condiciones de asepsia, o desoxicolato de sodio al 10%. b) En caso de que el germen cultivado sea Neumococo, ocurrir su lisis o desaparicin, traducid macroscpicamente por la transparencia que cobra el medio desde los primeros minutos hasta un mximo de un cuarto de hora, lo que no ocurre con el S.pyogenes var. Viridans. Puede completarse la observacin, si as se desea, con un estudio microscpico. c) Mtodo biolgico de aislamiento: inocular el producto patolgico en el ratn blanco que por ser extremadamente susceptible al germen, muere de septicemia en el trmino de 24 horas o antes. Aislar el germen de cualquier regin de su organismo. La cpsula es claramente observada en el animal inoculado y se pierde con rapidez en los medios artificiales.
ESQUEMA DE LA PRCTICA: Obtener una muestra que se sospecha contienen Neumococo, (LC.R esputo): a) b) c) d) e) f) g) Colorear con Gram Sembrar en agar sangre o agar chocolate en placas. Incubar Leer los cultivos. Observar las caractersticas de las colonias y su accin sobre el medio. Practicar la prueba de la bilisobulidad y la prueba de la inulina. Inocular al ratn blanco Autopsiar, colorear y sembrar muestras de sangre del animal.
CUESTIONARIO a) b) c) d) Qu papel tienen la cpsula en la patogenicidad del Neumococo? En un ratn blanco muerto por inoculacin con neumoco,Cules son las vsceras que contienen el germen? Qu ocurrir si usted resiembra un cultivo de neumococo a los siete das? Qu procedimiento seguir para diagnosticar etiolgicamene una meningiis neumococica?
PRACTICA N 13
L. acidophillus (B. de doderrlein), L. bifidus

COMPETENCIAS Los de orden general.
De las muestras y su procedencia: L. acidophillus puede ser aislado de vagina, contenido intestinal de lactantes muy tiernos, de leche y otros productos. Examen directo: Bacilos Gram positivos, inmviles, no esporulados, rectos, de 1 a 3 micras de longitud y de 0.6 al micra de ancho. white. Composicin y comportamiento del medio: Jugo de tomate (400ml)............... 200 grs Bacto Peptona ....................... Leche Peatonizada ................... 10 grs 10 grs Aislamiento: el medio indicado para su aislamiento. Es el ideado or Mickle y Breed, y modificado por Kulp y
Bacto agar ..........................
11 grs
Agua destilada....................... 1,000 ml. Medio indicado para el aislamiento y para el recuento de lquidos y para apreciar el contenido intestinal en Lactobacillus. Observar que las colonias, que son translucidas, incoloras, de medio a un milmetro de dimetro; semejan a cristal groseramente esmerilado (TOPLEY), de bords y superficie mostrando ondulaciones. ESQUEMA DE LA PRCTICA: Obtener muestras de secrecin vaginal en consultorio de ginecologa. Tomar no menos de 5 muestras y sembrar todas ellas en el medio de aislamiento, previa coloracin de Gram. Observar la morfologa y los caracteres culturales y colorear una suspensin de las colonias.
100X
CUESTIONARIO: A.- Cul es la particularidad ms saltante que observa usted en estos grmenes?
B.- Qu significacin tiene la presencia de Lactobacillus en tracto intestinal y en vagina?
PRCTICA N 14
CONTENIDO TEMATICO PROCEDIMENTAL
GENERO NEISSERIA, MORAXELLA

ESPECIES IMPORTANTES N. gonorrhoeae, N.meningitidis, Moraxella, catarrhalis
COMPETENCIAS Los de orden general .
MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS: De la Muestra y su Procedencia: El gonococo se encuentra en muestra de secrecin uretral, secrecin de cuello uterino, secrecin vaginal (sobre todo en nias), en contenido prosttico y en secrecin oftlmica en la practica la frente, as comn del germen es la secrecin uretral masculina en la gonococia aguda. En los casos en que la secrecin es escasa, es preferible obtener la muestra antes de la primera miccin matinal y si aun as no se obtienen material, convendr recoger los primeros 5 a 10 ml de la miccin matinal, los que arrastran los filamentos cargados de piocitos y grmenes. Tambin es usual el estudio del esperma y muestras obtenidas previo masaje prosttico. En mujeres se recomienda obtener la muestra de cuello uterino.
Examen Directo: Observar en fresco la secrecin genital para descartar otros cuadros, de preferencia los causados por Trichomonas vaginalis.
En coloraciones, anotar que el Gonococo es un diplococo Gram negativo que semeja dos riones enfrentados por sus lados cncavos. Por la ranura que media entre coco y coco, se parece tambin a granos de caf. Mide de 0.6 l micra. Es inmvil. No capsulado.
En procesos recientes gran nmero de estos elementos se encuentran englobados en los leucocitos. En procesos crnicos o subagudos predominan las formas extracelulares.
Se recomienda preparar varias lminas para ensayar diversas coloraciones de preferencia simples (azul de metileno muy diluido) adems del Gram.
Aislamiento: Emplear para este fin placas o tubos de agar sangre y agar chocolate en ambiente de CO2.
Composicin, preparacin y comportamiento de los medios: Agar sangre Agar chocolate: este medio es tan solo el agar sangre sometido a calentamiento, el que puede ser aplicado antes de repartirlo en tubos o placas o despus de tender y enfriar el agar sangre en tubos, los que se someten en posicin inclinada, a la accin del vapor fluente y se enfran en la misma posicin, en vez de sangre puede adicionarse hemoglobina en polvo al medio base.
La incubacin debe hacerse en ambiente de CO2 para fines prcticos emplear un frasco de boca ancha invertido, en cuyos interior se coloca los tubos y una vela encendida. La boca del frasco ser aplica sobre una superficie cubierta de cera blanda o vaselina, con lo que se consigue un cierre hermtico. El oxigeno del ambiente se agota al arder la vela, la que finalmente se apaga dejando el ambiente deseado.
Tomar nota que tanto en agar sangre como en agar chocolate el Gonococo crece en 24 horas a 37CV con colonias puntiformes y translucidas al comienzo y que se hacen algo opalescentes al completar su desarrollo. Colonias convexas y algo mucosas no alteran el medio.
La aplicacin del reactivo para oxidasas sobre las colonias de N. gonorrhoeae y otras Neisserias, produce un cambio de coloracin que va del rosado al azul, lo que indica que los grmenes pertenecientes al genero, son oxidasa positivos, es decir, productores de la indofenol oxidasa. El reactivo tienen la siguiente formula: a) Alcohol etlico (95 96%)............ Alfa naftol .......................... 1 grs b) Agua destilada ....................... Para aminodimetinilina Hcl .......... ESQUEMA DE LA PRCTICA Emplear pus de secrecin uretral extendida en lminas (De ser posible obtener la muestra directamente de casos clnicos). Colorear con azul de metileno y Gram. Sembrar en agar sangre y agar chocolate. Incubar a 37C en atmsfera de CO2. 100 ml 1 grs 100 ml
100X
Observar el desarrollo a las 24 horas. Hacer las anotaciones pertinentes. Aplicar el reactivo de oxidasas observar e cambio de coloracin. Emplear como testigo un cultivo de Escherichia coli que es oxidasa negativo.
CUESTIONARIO
A.- Qu interpretacin dara usted al hallazgo de diplococos Gram negativos (Nesserias) hallados en secrecin purulenta de seno maxilar? B.- Qu interpretacin dara Usted a la observacin de Neisserias en liquido articular? C.- Qu importancia tiene la investigacin de Gonococo en meretrices? D.- Seria pertinente un cultivo de orina para investigar Gonococo?
PRACTICA N 15
CONTENIDO TEMATICO PROCEDIMENTAL
Bordetella pertussis
COMPETENCIAS
Los de orden general
De las Muestras y su procedencia: La fuente de aislamiento es la secrecin expulsada en el curso de la tos espasmdica que caracteriza la enfermedad, o las micro- gotitas de fluje que se desprenden con la misma tos. Examen directo: Colorear con Gram y anotar que el Bacilo de Bordet Gengou es un germen Gram negativo. Con frecuencia muestra coloracin bipolar. Es inmvil no esporulado ni capsulado. Mide de 1 a 1.5 micras de largo por 0.3 a 0.5 micras de ancho.
Aislamiento: Sembrar en medios que contengan una protena animal tal como la sangre, que contienen las factores X y Y, circunstancia de la que deriva el nombre de Haemophilus
Composicin y comportamiento de los medios: El medio de eleccin es el llamado de BORDET GENGOU Proteosa Peptona................ 10 grs Infusin de papa................ 125 grs Cloruro de sodio................ 5.5 grs Agar.................................. 20.00 grs Agua destilada con glicerina al 1%.......1,000 ml. En este medio el germen desarrolla con colonia mucoides, blanco cenicientas en las primeras fases de cultivo. Se aprecia la apariencia de roco sobre el medio.
ESQUEMA DE LA PRCTICA En caso de poder contarse con pacientes que presenten coqueluche, captar el inoculo durante la tos, en placas con medio de Bordet Gengou. Incubar y examinar colonias a las 24 horas y 48 horas. Colorear y registrar todos los resultados.
De no haber pacientes usar una cepa del germen; sembrar en placas con inculos muy diluidos, incubar y observar el desarrollo colorear con Gram y anotar la morfologa.
CUESTIONARIO
A.- Cul es la fuente comn de transmisin del germen? B.- Qu utilidad dara a un cultivo en fase III en una campaa preventiva? C.- Qu ocurrira si por accidente se ingiere una gran cantidad de grmenes?.
PRCTICA N 16
Genero Haemophylus: H. influenzae (Bacilo de Pfeiffer).- H. ducreyi (Bacilo del chancroide H. vaginalis)
COMPETENCIAS
Los de Origen general .
De la Muestra y su procedencia: H. influenzae se asla con relativa frecuencia de L.C.R en casos de meningitis purulenta. Se asla igualmente en condiciones no patolgicas de tracto areo superior y secrecin bronquial. H. ducreyi se asla de lesiones genitales en casos de chancoide y de pus de ganglios cuando esos son afectad durante la enfermedad. H. Vaginalis se asla de secrecin vaginal y raramente de uretritis masculina.
Examen directo: Las tres especies son bacilos o cocobacilos Gram negativos. En el caso de H. ducreyi, es frecuente en pus, su presentacin en cortas cadenas. H. vaginalis se presenta en grandes masas adheridas a clulas epiteliales cuya apariencia caracterstica ha dado lugar a que se les llama clulas gua (clue cells)
Aislamiento: Utilizar para el aislamiento agar sangre. El empleo de agar chocolate no mejora apreciablemente los resultados.
Composicin y comportamiento de los medios: Agar sangre (Practica N ) Agar Chocolate (Prctica N) Observar que en ambos medias las tres especies crecen con colonias puntiforme, translucidas dentro de las 24 horas.
ESQUEMA DE LA PRCTICA o Trabajar con L.C.R de un caso de meningitis causada por H. influenzae (en caso de conseguirse la muestra). Colorear con Gram; observar la morfologa y sembrar en agar sangre; incubar y leer los cultivos al da siguiente. Hacer una suspensin de las colonias y colorear. Anotar debidamente los resultados. o Para H. vaginalis trabajar con una suspensin de secrecin vaginal previamente obtenida de un caso adecuado. Observar en fresco, colorear, sembrar. Leer y anotar los resultados.
Para H. ducreyi seguir un proceso parecido en caso de contarse con las muestras.
PRACTICA N 17
FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE
Gneros: ESCHERICHIA, KLEBSIELLA, ENTEROBACER, SALMONELLA, ARIZNA, SHIGELLA, CITROBACTER, PROTEUS, PROVIDENCE, ERWINIA, SERRATIA Y EDWARDSIELLA.
COMPETENCIAS:
Los de orden general.
o De la muestra y su procedencia: los miembros de esta familia, considerados en conjunto, pueden ser aislados de las fuentes ms diversas. Para los fines del trabajo practico, podemos considerar 3 fuentes esenciales en el estudio de Enterobacteriaceae: las heces, la orina y la sangre.
El aislamiento de grmenes a partir de las heces se llama coprocultvo; a partir de la orina, urocultivo y a partir de la sangre, hemocultivo. En manera alguna se excluyen otras fuentes de trabajo, como son la bilis, secreciones y en general todo producto que pueda estar vinculado con grmenes de esa familia, incluyendo alimentos y otros alimentos de consumo.
Obtener las muestra en recipientes estriles y proceder a la siembra inmediatamente. Tener en cuenta que en nios menores se puede obtener la muestra directamente de la ampolla rectal. Los procedimientos que sern expuestos a continuacin se refieren esencialmente al estudio coprolgico desde un punto de vista bacteriolgico, es decir al coprocultivo. El examen directo microscpico tienen en este caso como propsito el de investigar parsitos u hongos que puedan estar presentes., los que pueden ser fcilmente detectados en un examen microscpico simple. Por otro lado, este examen informar sobre la presencia de piocitos, hemates, etc. o Aislamiento: la siembra de las heces se hace directamente en las placas de aislamiento y en los medios de enriquecimiento. Los medios de enriquecimiento mas usados son el caldo selnico de Leifson (1936) y el caldo tetrationato de Moeller (1923). Este ltimo ha sido modificado por Kauffman con la adicin de verde brillante sales biliares.
Los medios de aislamiento son selectivos e indicadores:

- Medio Tetrathionato: La cantidad de heces que puede adicionarse a 10 ml de cualquiera de estos medios es de 1 a 2 grs. La mezcla de la muestra con los medios de enriquecimiento, se lleva a la incubadora de 37C pudiendo hacerse el plaqueado a las 24 horas y a los 5 das. La muestra recin obtenida se plaquea en MacConkey, S.S, Desoxycholato citrato y en medio enriquecido sin inhibidor para serotipos enteropatogenos de Escherichia coli. De los medios de enriquecimiento (Selenito o Tetrathionato) se resiembra en S.S. MacConkey y Sulfito de Bismuto. No es indispensable sembrar en los dos medios de enriquecimiento, siendo preferible usar el de Tetrathionato. El fundamento de los medios de aislamiento y enriquecimiento es el de favorecer el desarrollo de Salmonellas y Shigellas y el de inhibir el de los grmenes Gram. positivos y coliformes. Esta inhibicin se consigue merced al contenido en concentraciones variables de sales biliares y verde brillante. El enriquecimiento es mas efectivo en cuando se refiere a Salmonella.
Comportamiento de Enterobaceriaceae
en los medios de aislamiento y composicin de estos: Los
medios ms usuales son el S.S. el MacConkey, el Desoxycholato Citrato y el Sulfito de Bismuto.
-En el MacConkey y en el S.S. los grmenes lactosas positivas producen acidez e el medio, lo que se traduce en un cambio de colocacin por viraje del indicador que es de rojo neutro, el que toma un color que va del rosado al rojo. En pH inferior a 7. Por ejemplo: las colonias del grupo Escherichia son de color rojo, mas marcadamente en el centro. Las colonias lactosa negativas son translucidas e incoloras o blanquecinas. En cuanto al tamao tambin hay diferencias apreciables. Los grmenes del grupo Escherichia dan colonias grandes y opacas; los del grupo Klebsiella, adems de estos caracteres son mucosas y grandes. El grupo Proteus que es lactosa negativo da colonias grandes y claras, con la particularidad de extenderse por la superficie del medio cuando este no es inhibidor como en el caso del agar simple o agar sangre. El MacConkey generalmente inhibe el desarrollo en manto.
En el S.S. puede observarse una gran zona negra en el centro de las colonias, las que es debida al formacin de hidrogeno sulfuro. La fuente de esta sustancia es el tiosulfato de sodio y la reaccin siguiente es del hidrogeno sulfurado con el citrato frrico o formacin de sulfuro de fierro que es negro. El Desoxicolato Citrato presenta colonias de color rosado cuando se trata de grmenes lactosa positivos e incoloros cuando el germen es lactosa negativo. En el medio sulfito de Bismuto las Salmonellas presentan un color negro y un aspecto metlico, que es debido al desprendimiento de H2S.
Eleccin de las colonias y repicaje: Despus de una incubacin que generalmente dura 20 a 24 horas, se procede a estudiar las colonias y una vez elegidas las translucidas e incoloras que se sospecha son lactosa negativas, se lleva una porcin de la colonia escogida a un medio de diagnostico preliminar. El instrumento empleado es una aguja recta con la que se toca la parte central de la colonia sin alcanzar el medio, para evitar de esta manera el contacto con otros grmenes que pudieran estar debajo. Los medios usados para este fin son muy variados; tenemos entre ellos; el T.S.I. el L.I.A.
Identificacin: Se utiliza pruebas especficos para determinar las especies siendo las ms importantes: Indol, Rojo de Metilo, Voges Proskauer, Urea, Nitratos,Citrato,etc.
Tcnica del Urocultivo:

Consiste en inocular una milsima de orina fresca obtenida en condiciones de asepsia, en placa de agar enriquecido (con triptosa y extracto de levadura) e igual cantidad en placa MacConkey, esta ultima por la posible presencia de Proteus, que se desarrolla en manto invalida la cuantificacin. Las placas, ligeramente inclinadas, deben rotarse varias veces.
Es importante en un urocultivo considerar el estudio del sedimento urinario revela la presencia y cantidad relativa de leucocitos, hemates y cilindros. El Gram de orina sin centrifugar es un tcnicas que permite apreciar la presencia o ausencia de grmenes de una muestra recin emitida sin otra maniobra que la extensin en lamina y la coloracin de Gram. es una prueba orientadora para el clnico, es igualmente aconsejable el estudio de una gota fresca de orina sin centrifugar que aporta informaciones tiles. Cabe llamar especial atencin sobre el cuidado requerido par la obtencin de las muestras. En hombres debe eliminarse el volumen inicial de la miccin y en mujeres debe evitarse la contaminacin con secrecin vaginal.
La investigacin de Enterobacteriaceae en leche, en agua y en sustancias alimenticias en general tiene aspectos cualitativos y cuantitativos y los medios de trabajo varan de acuerdo con los propsitos del estudio.
PRACTICA N 18
Genero Pseudomonas
COMPETENCIAS
Los de orden general.
De la muestra y su procedencia:
El bacilo pioceanico puede ser aislado de la piel normal de lesiones cutneas tales como quemaduras, de orina de heces, de odos, del agua de materias en putrefaccin, etc. Su presencia puede sospecharse en algunas lesiones, por la coloracin verdosa que estas adquieren debido al exopigmento del germen. Examen directo: Observar que el germen es muy mvil y que en la coloracin es un bacilo Gram negativo. El examen directo no aporta datos especficos para el diagnostico.
Aislamiento: Tomar nota del desarrollo precoz en medios simples, lquidos o slidos, con turbidez intensa, sedimento abundante y pelcula en los primeros. En medios slidos, colonias parecidas a las de Enterobaceriaceae. Caracterstica: Pigmento verde o verde azulado, impartido por el germen en los medios. Se aconseja el empleo de medios adicionados de aminocidos para inducir la pigmentacin que es un carcter distinto de gran importancia. J. Garca A, propuso un medio, por el que es posible obtener pigmentacin optima. Formula: Glutamato monosdico............1 grs
Fosfato Bipotasico................ 0.05 grs Sulfato de magnesio.............. 0.15 grs Glicerol................................. 0.5 ml Agua destilada..................... 100 ml pH ............. 7.2 7.3 (1) AJI NO MOTO, Es glutamato comercial y es satisfactorio para esta prueba. En el TSI, el germen por no fermentar la glucosa no presenta cambios como los anotados en Enterobacteriaceae. Es frecuente observar una leve alcalinidad en la pare superior que tambin es presentada por otros grmenes no fermentadores de glucosa como Alcaligenes.
Esquema de la prctica:
a) b) c) d) Observar cultivos sembrados de Ps. aeruginosa y Ps. fluorescens en medios lquidos y slidos con glutamato. Separar el pigmento mediante cloroformo. Observar cultivos de Ps. Aeruginosa en TSI y compararlos con cultivos de E. coli y Salmonella. Practicar la reaccin de oxidasas.
CUESTIONARIO
a) b) c) Qu caracterstica, observada a simple vista, podra hacer pensar a usted en una infeccin por Pseudomonas? Cul seria el aspecto de un cultivo de Pseudomona en TSI y que explicacin tendra? Cules son las diferencias fundamentales de Pseudomonas y Enterobacterias, aparte de la pigmentacin?
PRACTICA N 19
FAMILIA BACILLACEAE GENERO BACILLUS

B. anthracis ; B subtilis y otros COMPETENCIAS:
Las de orden general
El B. anthracis puede ser aislado en caso de enfermedad humana, de lesiones cutneas, de sangre (en septiseias) y aun de esputo. En caso de animales muertos por la enfermedad se asla el germen de sangre y vsceras. Examen directo: Observar que le germen se presenta en el producto patolgico como un bacilo Gram positivo de 5 a 10 micras de largo por 1 a 3 micras de ancho. Capsulado. No esporulado. Inmvil. Puede encontrarse elementos aislados o dispuestos en cortas cadenas. Un elemento de inters son los extremos cortados en escuadra. Aislamiento:
Anotar que el germen crece con suma facilidad y en forma precoz en los medios ms simples. A los 24 horas tanto en medios lquidos como en medios slidos, puede encontrarse largas cadenas ya con elementos esporulados (espora central, oval no deformante). Pierde la capsula con prontitud en medios de cultivo. Observar que la colonia del B. anthracis es bastante grande y presenta bordes desflecaos (Melena de len). En la gelatina sembrada por picadura, observar prolongaciones que toman a la lnea de puntura como eje; el conjunto sume la apariencia de un pino invertido. En medio liquido: Desarrollo sin turbidez con abundante sedimento, que en el fondo semeja un pedazo de algodn sumergido. Inoculaciones: Emplear u animal receptivo como el cobayo que muere entre 3 y 5 das despus de la inoculacin con septicemia. Tanto en sangre como en vsceras, observar el germen con su morfologa caracterstica. Esquema de la Prctica: a) b) c) Observar las laminas obtenidas en animal inoculado. Observar laminas de coloraciones de esporas Observar los cultivos en medios slidos y lquidos; los primeros sembrados con 3 das de anticipacin y hacer coloraciones a partir de ellos. d) Observar el cultivo en gelatina (sembrado con 3 das de anticipacin)
CUESTIONARIO
a) b) c) Con qu grmenes puede ser confundido el B. anthracis? Cules son las diferencias fundamentales? Qu criterios permiten identificar con seguridad al B. anthracis?
PRACTICA N 20
GENERO CLOSTRIDIUM
Clostridium tetani (Bacilo tetnico) (Nicolaier, 1884)
COMPETENCIAS:
Las de orden general
C. tetani puede aislarse en el ser humano, a partir de las lesiones infectadas por el germen. El germen goza de ubicuidad y es fcil aislarlo de la tierra y del estircol. Examen directo: Los productos patolgicos contienen por lo general muy escasos grmenes. Aislamiento:
Procedimientos, medios de cultivo y fundamentos: Emplear medios o ambientes anaerbicos. La presencia de esporas, permite por otro lado calentar la muestra hasta limites en que desaparecen las formas vegetativas y en general, los grmenes no esporulados.
a) b) c) d) -
Mtodo de Kitasato: Calentar la muestra provista de cantidad suficiente de lquido a 80C de 5 a 10 minutos. Sembrar e los medios especiales Incubar a 37C. Observar a parir de las 24 horas. Mtodo de Brewer: Se basa en el empleo de medios especiales, entre los que se seala el que sigue: Bacto triptona.....................5 grs Thioglicolato de sodio........2 grs Proteosa peptona N 3........10grs Extracto de levadura............ 5 grs Dextrosa.............................10 grs Cloruro de sodio..................5 grs Agar..................................20 grs Sulfoxilato formaldehdo de sodio 1 gr. Resazurin Agua destilada 0,002 ml 1,000 ml
Este medio puede repartirse en placas de Petri en cantidades de 45 a 50 ml y despus de solidificarlo el medio y hecha la siembra se cambia la tapa del Petri por la placa especial de Brewer, cuya finalidad es la de crear una atmsfera de anaerobiosis al hacer contacto en forma anular con la superficie del agar, quedando una pequea atmsfera cuyo tenor en oxigeno es eliminado por la accin reductora del medio. La siembra puede practicarse en superficie mezclando el inculo con el medio todava en estado lquido. Tambin son empleado los medios lquidos a base de thioglicolato de sodio y los que, como el que llevan trocitos de rganos o carne molida, que al consumir el oxigeno del medio, crean un ambiente de anaerobiosis.
Inoculaciones: El trabajo experimental ms importante es el referido a la accin de la exotoxina tetnica, son aplicables a otros grmenes anaerobios. Inoculaciones: El trabajo experimental mas importante es el referido a la accin de la exotoxina tetnica. Si se inocula al ratn ya sea la toxina o el cultivo, se observara la aparicin de un cuadro de tipo espstico en el tren posterior del animal. La antitoxina evita o neutraliza este cuadro.
Esquema de la prctica: a) Observar lminas coloreadas del germen esporulado.
b)
Observar cultivos del germen en agar semislido glucosado y caldo Thioglicolato. Hacer coloraciones a partir de dichos cultivos.
c)
Conocer las placas de Brewer y los frascos de anaerobiosis.
CUESTIONARIO
a) b) c) d) Cmo objetivara en un medio slido la produccin de toxina tetnica? Cmo se comportara el CL. tetani en un supuesto medio blando y anaerobio? Qu efecto producira la ingestin de un cultivo virulento de Cl. tetani? Qu valor tendra un examen directo y en cultivo negativo para Cl. tetani, en un paciente con un cuadro clnico tpico de ttanos?
PRACTICA N 21
GENERO CORYNEBABACTERIUM
C. diphteriae (Bacilo diftrico o bacilo de Loeffler) COMPETENCIAS:
Los de orden general
La obtencin de la muestra deber hacerse a partir de las placas seudomenbranosas, que se forman en la zona de localizacin del microbio que generalmente es la faringe. Examen directo: Se observa en caso positivo, bacilos Gram positivos, ligeramente incursados y adoptando la disposicin en letras(v,L)o empalizada. Los bacilos pueden tener ensanchamientos en uno o ambos extremos en forma de masas. Un hecho de importancia en el examen directo es la observaron de los corpsculos metacromticos los que se muestran como grnulos de coloracin intensa
a lo largo del germen y de preferencia e los extremos. Para poner de manifiesto los corpsculos se emplea la tcnica de Epstein, que consiste n lo siguiente: a) b) c) d) e) f) g) Extensin Fijacin Coloracin durante 3 a 5 minutos con colorante de loeffler (azul de metilno) Lavado Lugol o voluntad, hasta conseguir un viraje del color azul a un marrn claro. Lavado Secar y observar en inmersin
Desde el punto vista morfolgico es difcil distinguir el C. diphteriae de otros bacilo seudo diftricos, puesto que estos presenta igualmente corpsculos metacromticos. Aislamiento: Se basa e el empleo de medios selectivos como el de Tellurito. Formula del medio base: Proteosa peptona N 3........... 20 grs Dextrosa................................ 2 grs Cloruro de sodio..................... 5 grs Agar...................................... 13 grs
Se diluye en un litro de agua (tambin se puede hacer reducciones proporcionales. Se hierve hasta completar disolucin y se distribuye en frascos y se lleva al autoclave 15 minutos a 15 libras de presin (121). A 500 ml, de la base (a 50C) agregar 12.5 ml del suero Telurito de Moeller, repartir en tubos. Las colonias de Corynebacterium toman una coloracin negra por reduccin del telurito). Tambin puede prepararse el medio partiendo de agar simple: a 100 ml se adiciona 10 ml de sangre o 10 cc. De telurito de potasio al 1% en solucin acuosa. Prueba de virulencia: Para completar la identificacin de Corynebacterium diphteriae, es conveniente realizar pruebas que pueden ser realizadas in vivo o in vitro. Las pruebas in vivo se realizan en cobayos por inoculacin subcutnea o intradrmica de un caldo filtrado en el que ha sido cultivo el germen y en el que se sospecha exista la toxina. El animal muere en caso positivo en un promedio de 3 das y presenta lesiones hemorrgicas en suprarrenales. La proteccin mediante antitoxina de animales testigo de mayor validez a la prueba. Ntese que el material inoculado debe ser libre de grmenes. La prueba de toxigenicidad in vitro se realiza en el medio Elec.. Formula: Protesta peptona n 3.................. 20 grs Acido lactico (50-60 p. 100)...... 0.7 ml. Maltosa....................................... 3 grs Cloruro de sodio......................... 5 grs Agar............................................ 15 grs Agua destilada............................ 1000 ml. pH ............................................. 7.8
Esterilizar a 115C durante 10 minutos. A 15 ml. Del medio (a 50C) aadir 3 ml. de suero normal (estril) de caballo. Se vierte en placas de Petri y antes que solidifique se coloca una tira de papel de filtro humedecida con antitoxina difterica de buen titulo.
Los cultivos a probar se siembran perpendicularmente a la tira de papel, sembrando tambin un cultivo virulento y otro no virulento como testigos. Incubar y a partir de las 24 horas, observar las lneas de precipitacin, si los cultivos problemas son toxigenitos sus lneas de precipitacin tienden a unirse con las lneas del cultivo testigo virulento. Esquema de la prctica. a) b) c) Observar coloraciones de lminas obtenidas en casos de difteria. Observar cultivos de C. diphteriae en telurio. Observar las placas en las que se demuestra la precipitacin entre toxina y antitoxina, usando con fuente de aquella el germen sembrado en la placa. d) Colorear extensiones de cultivos mediante a tcnica de Epstein.
CUESTIONARIO
a) Cmo se llamara la reaccin en tubo entre una toxina y una antitoxina difterica y qu papel tendra en ella el electrolito y el complemento? b) c) Qu pensara en el caso de un animal que inoculado con toxoide diftrico muere en 3 a 5 das? Cul es el fundamento de la prueba de virulencia in vitro descrita en esta gua?
PRACTICA N 22
GENERO MYCOBACTERIUM
Especie: M. tuberculosis (Bacilo de Koch) M. leprae (Bacilo de la lepra o bacilo de Hansen)
COMPETENCIA: Los de orden general. De la muestra y su procedencia: El Mycobacterium tuberculosis puede aislarse de los ms diversos productos patolgicos: esputo, lavado gstrico, orina, liquido cfalo raqudeo, secrecin de fstulas, heces, lquido asctico, lesiones de piel y huesos, y en general en todo rgano que haya sido afectado.
Examen directo: (Obtencin de la muestra) La forma de obtener la muestra varia segn el cuadro clnico si se rata de esputo (en una localizacin pulmonar), de utilizarse como recipiente en frasco estril de boca ancha. Si se trata de orina, del liquido asctico o de liquido cfalo
raqudeo, la preparacin de laminas debe ser precedida de centrifugacin, si las muestras son muy densas como es el caso de las secreciones, el frontis debe hacerse directamente. Para obtener el contenido gstrico, se recurre a un sonda, laque debe llegar hasta el estomago. La muestra se recoge succionando con jeringa, sea cual fuere el sistema de be manipularse n condiciones aspticas y con material estril. LAS LMINAS DEBE SER NUEVAS (SIN USO ANTERIOR) PARA EVITAR LOS FALSOS POSITIVOS. La coloracin indicada es la de ZHIEL NEELSEN en la que intervienen. a) b) c) Fucsina fenicada en Zhiel Alcohol clorhdrico o el cido ntrico diluido al tercio. Azul de metileno como colorante de fondo.
Algunos autores prefieren utilizar como fondo el cido pcrico en solucin saturada. El alcohol clorhdrico o sea el decolorante, lleva 100 ml. De alcohol y 3% de cido clorhdrico.
Tcnica de coloracin: a) b) c) d) e) f) Preparar el frotis Cubrir ntegramente con colorante de Zhiel Neelsen. Calentar a la llama hasta desprendimiento de vapores, por tres veces consecutivas, sin llegar a ebullicin. Lavar intensamente a chorro. Decolorar con alcohol cido Colorear con azul de metileno o cido pcrico.
Los grmenes que retienen el color rojo a pesar de la decoloracin con el alcohol cido son los llamados cido alcohol residentes y destacan en un fondo de color azul si se usa el Loeffler. Aquellos grmenes no cido resistentes ceden al color bajo la accin del alcohol cido y al quedar desprovistos de colorante tienen aptitud para tomar el colorante de fondo (azul) o amarillo.
Tcnica de Homogenizacin: En aquellos casos en os cuales el examen directo simple es negativo se procede el enriquecimiento, son numerosos los mtodos que se ponen en practica, destacando entre ellos el que emplea el hidrato de sodio y el cido clorhdrico y por otra parte el de Corper y Stoner, que emplea fosfato trisodico y cido oxlico.
Tcnica: Al recipiente de boca ancha que contienen el esputo o el lavado gstrico que son los elementos usualmente sujetos a la homogenizacin, se adiciona cantidad suficiente de hidrato de sodio al 4% o fosfato trisdico al 20% y se deja reposar por media hora en la estufa de 37C.
Si se utiliza el hidrato de sodio, se neutraliza con cido clorhdrico al 8% hasta un pH 7. si el reactivo usado es el fosfato trisdico, se neutraliza con cido oxlico al 3%. Tanto el hidrato de sodio como l fosfato trisdico deben llevar un indicador (rojo de fenol) a fin de que sea as sencilla la neutralizacin, la que se controla por el cambio de color que sufre la mezcla de la base con el producto patolgico bajo, la accin del cido. Tanto mas purulento es el esputo, tanto mas fcil la homogenizacin.
Centrifugar de preferencia e el mismo recipiente en el que se obtienen el producto patolgico, para lo que se utiliza centrfugas con cabezales que pueden portar hasta volmenes de un cuarto de litro por copa. Finalmente se decanta y el sedimento se colorea, se siembra o se inocula, Corper et al. Recomiendan que el fosfato acte toda la noche.
100X
PRACTICA N 23
Genero TREPONEMA- Genero BORRILLA- Genero LEPTOSPIRA

Treponema pallidum.
COMPETENCIA: Los de orden general
El Treponema pallidum se puede obtener de la linfa de las lesiones primarias y en las lesiones secundarias. Para obtener la linfa, seguir los siguientes pasos: a) b) c) d) Tener en cuenta que, la lesin debe estar completamente limpia. Raspar con la punta de una pipeta la superficie de la lesin hasta que sangre. Secar la sangre cuantas veces aparezca. Despus de esperar unos minutos recoger la linfa, con pipeta capilar, lo as exenta posible de hemates.
Es aconsejable realizar un frotis del exudado que cubre la lesin, antes del lavado con el in de buscar bacilo de Ducrey. Agente del chancro blando o chancroide. Iguales indicaciones se seguirn para obtener secrecin linftica en lesiones no genitales.
Examen directo: Parte de la muestra de la linfa as obtenida, se coloca entre porta y cubre objeto para su observacin en campo oscuro (ultramicroscopio). La morfologa y movilidad del treponema son tiles en el diagnostico, el que sin embargo requiere apreciable experiencia. Tambin se harn frotases para impregnacin a la plata (fontana Tribondeau) y para colorear con Leishman.
Impregnacin argntica segn Fontana tribondeau: a) Reactivos: Solucin de Ruge: (para lisar glbulos rojos). Acido actico glacial............ 1 ml Formol Comercial................ 20 ml. Agua destilada......................100 ml.
b)
Solucin mordiente: Acido tnico..................... 5 grs Fenol................................ 1 grs Agua destilada................. 100 grs
c)
Solucin argntica: Nitrato de plata al 1%.......... 1 ml Agua destilada..................... 20 ml.
PROCEDIMIENTO: a) b) c) d) e) Cubrir la extensin con la solucin A, previa fijacin con alcohol ter. Lavar con agua destilada Cubrir la preparacin con solucin B y calentar hasta producir tres vapores (tres veces) Lavar con agua destilada. Cubrir con solucin C esta solucin argntica debe combinarse previamente con amoniaco, hasta la aparicin de ligera nubosidad, antes de emplearla. La solucin es, al final, un nitrato de plata amoniacal. Debe mantenerse sobre la lmina hasta impregnacin de color marrn claro.
El treponema se ve con su morfologa caracterizada en un color marrn oscuro. Cultivos NO ha sido posible cultivar este germen.
Esquema de la prctica. a) b) c) Practicar la coloracin de Fontana Tribondeau y la Leishman. Observar laminas de Treponema pallidum (de lesiones humanas). Colorear paralelamente las lminas de frotis bucal con Gram y comentar los resultados.
CUESTIONARIO
a) b) Qu criterios le permitirn afirmar que un germen observado es Treponema pallidum? Qu pensara en u caso en que el examen directo es positivo para Treponema pallidum y las reacciones serolgicas son negativas? c) Qu pensara ante el hallazgo de espirilos en una lesin genital en una coloracin de Gram?.
PRACTICA N 24
GENERO BARTONELLA
Bartonella bacilliformis, Strong, tyzzer y Sellards, 1913
COMPETENCIA: Los de orden general. De la muestra y su procedencia: El diagnostico de la enfermedad se basa fundamentarte, a parte de consideraciones de orden clnico, tiene el hallazgo del germen en sangre. Examen Directo: Extensiones de sangre perifrica y colorearlas por el mtodo de Leishman, Wright o Giemsa. Observa la morfologa bacilar o cocoide del germen, comprendido de dentro de los contornos del hemate. No es fcilmente coloreable por el Gram. Aislamiento:
Emplear hemocultivos y hacer siembras en agar sangre en das sucesivos. Observar mediante coloraciones los acumulo del germen en las muestras obtenidas del hemocultivo. Observar las colonias translucidas y pequeas del germen en el agar sangre. Esquema de la prctica: a) b) Coloracin: c) d) e) Hacer actuar sobre la preparacin no fijada la mezcla b, filtrar sobre la lmina por 3 minutos. Utilizar por 2 o 3 minutos la mezcla B que sirve para diferenciar y colorear al mismo tiempo. Insistir en la tcnica del Hemocultivo. Observar lminas coloreadas y que contengan el germen. Colorear extensiones de sangre con Leishman.
100X
CUESTIONARIO
a)Qu pensara si en un hemocultivo tomado de un paciente con bartonellosis, aisla un germen mvil que desarrolla en agar triptosa?. b) Es posible utilizar en Bartonellosis alguna forma de diagnostico semejante a la de Weil y Felix?. c) Qu tipo de colonias observara en caso de sembrar Bartonellas en agar simple?.
III UNIDAD MICOLOGIA

PRACTICA N 25
ESTUDIO DE LOS HONGOS

COMPETENCIAS:
Estudia la morfologa de los principales grupos de hongos. Estudia la morfologa de las principales micosis del hombre. Reconoce los medios de cultivo y las tcnicas para observar a los hongos.
MATERIALES:
Lminas y laminillas. Muestras patolgicas: escamas de piel, tejidos vegetales , etc Medios de cultivo: Agar Sabouraud
Reactivos: Hidrxido de potasio al 10% Colorantes Azul de algodn lactofenol. Bistur, pinzas, asa micolgica mechero, Microscopio.
METODOS
A. ESTUDIO DE LA MORFOLOGA CELULAR DE LOS HONGOS Observacin de lminas fijas al microscopio utilizando lentes objetivos de inmersin. Esquematizar.
B .ESTUDIO MACROSCOPICO DE LAS COLONIAS DE HONGOS Observar y describir las caractersticas de las colonias de hongos cultivados en placas y tubos de agar Sabouraud. C. EXAMEN MICROSCOPICO DE MUESTRAS PATOLGICAS Las muestras patolgicas como escamas de piel, pelo, secreciones de tejido vegetal, se colocan sobre una lmina y se agrega una a dos gotas de KOH al 10%. Se cubre con una laminilla y se calienta ligeramente. Cuando las muestras son gruesas como las uas se deber usar KOH al 40%. Puede emplearse azul de algodn lactofenol para la observacin de hongos en lugar de KOH; este cumple 2 funciones como aclarante y la de colorante, que permite teir las estructuras de hongos. Observar al microscopio con objetivo seco de mayor aumento. Esquematizar.
OBSERVACIONES:
1. Estructuras de hongos: 2. Mohos: hifas, micelio, estructuras reproductivas. 3. Clulas levaduriformes. 4. Hongos que producen micosis y hongos oportunistas.
IV UNIDAD
PRACTICA N 26
EXAMEN PARASITOSCOPICO DE HECES

COMPETENCIA
Familiariza al estudiante con las tcnicas coprolgicas mas usuales, en la investigacin de parasitosis intestinales demostrar la conveniencia de la utilizacin de los diferentes mtodos, comparados entre si. y
MATERIALES:
Frascos de boca ancha con muestras. Embudos, gradillas, baguetas, pipetas Pasteur, azas de platino, gasa, algodn. Lminas y laminillas. Centrfugas y tubos de centrifugas. Suero fisiolgico, lugol, ter sulfrico, sulfato de zinc, MIFC.
METODOS
Concentracin de: Faust, MIFC y Baermann.
PRECEDIMIENTO:
Examen microscpico:
Observar color, consistencia, presencia de moco, sangre elementos agregados (progltides, etc.) Examen microscpico:
A) Directo: Con suero fisiolgico y con lugol. B) Mtodos de concentracin: Mtodo de centrifugacin y flotacin de MIFC. Mtodo de sedimentacin de Baermann.
METODO DE FAUST:
Es un mtodo destinado a la demostracin de quistes de protozoarios, huevos y larvas de helmintos en las heces. Se basa en un proceso de concentracin por centrifugacin y flotacin con sulfato de zinc de densidad 1,180. -Procedimiento: a) Se prepara una suspensin de materia fecal mezclando una parte de la muestra ( como del tamao de un frijol) con diez parte de agua corriente. b) Unos 10 ml. De la suspensin se pasan a travs de una capa de gasa hmeda a un tubo de los que se utilizan para la reaccin de Wasserman. c) La suspensin colocada en el tubo se centrifuga durante 45 a 60 segundos a la velocidad mxima(2,500 rpm.,
aproximadamente). El liquido que sobrenada se decanta; se agregan 2 o 3 ml. De agua; el sedimento es emulsionado mediante agitacin y luego se aade agua hasta llenar el tubo. d) Se repite el punto c (3 o 4 veces)hasta que el lquido que sobrenada aparezca claro. e) El ltimo lquido sobrenadante se decanta; se agregan 3 a 4 ml. De solucin de sulfato de zinc, 1,180 de densidad (sol. Al 33%);el sedimento es emulsionado mediante sacudidas del tubo y despus de agrega solucin de sulfato de zinc hasta unos 13 mm. Del borde del tubo. F) Se centrifuga durante 45 a 60 segundos a toda velocidad. g) Se toma varias veces una aza bacteriolgica del material que flota en la superficie y se coloca en un portaobjeto limpio; se aade una gota de lugol y la preparacin se agita a mano a fin de que tia uniformemente. h) La preparacin, con su correspondiente cubreobjetos, esta ya lista para su examen. Este mtodo se recomienda para la concentracin de quistes de protozoarios y huevos de helmintos. o METODO MIFC (Modififado por Coutinho).
Es un mtodo utilizado para la demostracin de quistes de protozoarias y huevos de helmimintos. Se fundamenta en la sedimentacin por centrifugacin de las heces, previo lavado y eliminacin de grasa y otros detritus. -Procedimiento:
a) Colocar en un vaso de boca ancha pequea cantidad de heces y mezclar con ayuda de una baqueta con la solucin MIFC. Lograr una buena homogenizacin del preparado. b) Utilizar tubos de centrfuga de 15 ml. Para tamizar a travs de una gasa doblada en cuatro, 2 ml. De esta suspensin. c) Adicionar 5 cc. De ter sulfrico y agitar vigorosamente el tubo de centrifuga. Tener cuidado al destapar el tubo. d) Llevar a centrifugar a 1,500 rpm. Por 2.- Como resultado de la centrifugacin se formaran cuatro capas que corresponden la primera al sedimento a examinarse, la segunda a la solucin MIFC, la tercera una capa de grasa y otros detritus adherida a las paredes del tubo y la cuarta el ter sulfrico empleado. e) Eliminar el sobrenadarte y limpiar con una torunda de algodn las paredes internas del tubo. f) Agregar 2-3 gotas de agua corriente sobre el sedimento y agitar para lograr una suspensin. g) Tomar la muestra con pipeta Pasteur y observar. o METODO DE BAERMANN: Este mtodo constituye el ms eficiente recurso para la obtencin de larvas de nemtodos en las heces y se fundamenta en el termo e hidrotropismo positivo que presentan dichas larvas.
PROCEDIMIENTOS:
A) Usar un embutido de vidrio, cuya punta este en comunicacin con un tubo de goma, este se mantiene cerrado con una pinza de Hoffman. B) C) Colocar el embudo en una gradilla. Sobre el embudo colocar una tela metlica y encima de esta depositar de 8-10 grs. de heces protegidas por un pedazo de gasa doblado en cuatro. D) E) Llenar el embudo con agua 40-42C., de modo que las heces, queden parcialmente sumergidas. Al cabo de 30-60, las larvas existentes en las heces, pasan para el agua estimuladas por su termo e hidrotropismo positivos y se acumulan en el tubo de jebe. F) G) Abrir la pinza y colectar parte del lquido (3-5 ml.)en vidrio de reloj. Examinar al estereoscopio, teniendo cuidado en identificar la especie de larva encontrada.
ESQUEMA DE LA PRACTICA: Emplear una muestra fresca de heces y preparar con suero fisiolgico y lugol. Concentracin segn Faust, Baremann y MIFC y volver a observar, comparando la concentracin de observaciones microscpicas y otros aspectos que crea de inters. quistes, huevos y larvas. Dibuje las
CUESTIONARIO
a) Indicar dos tcnicas aparte de las ya estudiadas que utilizan en el examen parasitolgico de la heces . b) Cmo determinara la densidad del sulfato de zinc utilizado en el mtodo de Faust, y cual es el fundamento de su empleo?
PRACTICA N 27
TECNICA DE COLORACION PARA PROTOZOARIOS

COMPETENCIAS:
1.- Conoce la utilizacin de los colorantes en el estudio de los protozoarios parsitos. 2.- Realiza tcnicas de coloracin propuesta.
MATERIAL:
1.-Laminas, laminillas, papel indicador de PH. 2.-Azas de platino, tapas de jebe, pinzas, petris beakers. 3.-Reactivos y suero fisiolgico, lugol soluc. Schaudinn, alcohol Iodado, alcoholes absoluto, 95,70, alumbre de fierro creosota, balsamo del Canada, solucion buffer.
COLORANTES:
May-Grunwald-Giemsa, Hematoxilina.
PROCEDIMIENTO:
METODO DE COLORACION DE PROTOZOARIOS POR LA HEMATOXILINA FERRICA. (Por VICENTE AMATO NETO, R.CAMPOSY C. SANTOA FERREIRA: Diagnostico das parasitoses intestinais pelo exame das fezes. Eit. Fundo Editorial Procienx-Sao Paulo, Brasil- 1961.) 1.- Fijar las extensiones con Schaudinn. 2.- Alcohol yodado: un minuto. 3.- Alcohol de 95% un minuto. 4.- Lavar en agua corriente: un minuto. 5.- Mordiente:Alumbre de fiero: (2%) 3 minutos. 6.- Lavar en agua corriente: 1 minuto. 7.- Solucin de Hematoxilina: 2 minutos. 8.- Lavar en agua corriente: 1 minuto. 9.- Diferenciar en alumbre de fierro, tiempo variable. 10.- Lavar en agua corriente: 2 minutos. 11.- Alcohol de 95% 2 minutos. 12.- Alcohol absoluto: 2 minutos. 13.-Alcohol creosota: 2 minutos. 14.-Creosota de faia pura: 2 miutos. 15.- Montaje en Blsamo de Canad.
COLORACION MAY GRUNWALD-GRIEMSA (Metodo panoptico). 1.- Sobre el frotis de sangre no fijado, se colocan 15 gotas de soluci162n May-Grunwald y se dejan actuar durante 5 minutos. 2.- Colocar sobre la lamina teniendo el cuidado de mezclar bien con el May- Grunwald el miso numero de gotas de agua destilada (PH = 7 7.2) DEJANDO A LA MEZCLA ACDTUAR 1 MINUTO. 3.- Botar la mezcla anterior y sin lavar, colocar sobre el frotis el colorante de Giemsa, diluido a razn 3 gotas para cada 2 cc. De agua destilada tamponada. Dejar actuar de 10-30 minutos. 4.-Lavar, secar y examinar.
CUESTIONARIO
1.- Indicar que aspecto toman los protozoarios coloreados por el mtodo de May-Grunwald-Giemsa. R.2.- Que aplicaciones pueden darse a los colorantes derivados del Romanoesky? R.3.- Que funcin cumple el alumbre de hierro en la tcnica de coloracin por Hematoxilina-frrica?
PRACTICA N 28
AMEBAS
COMPETENCIAS:
1.- Familiariza al estudiante en el conocimiento de la estructura, y la fisiologa de una ameba. 2.- Conoce la accin patgena de la Amebas parsitas del hombre.
ESTUDIO DE LOS PARASITOS:

Phyllum: Protozoo. Clase : Sarcodina. Orden : Amoebina.- Familia Endamoebidae. Genero : Entamoeba.
ENTAMOEBA HISTOLYCA: 1.- Trofozoito o forma vegetativa: Observe con lente de inmersin las preparaciones con trofozoitos teidos con Hematoxiliba frrica. Ponga atencin en el aspecto del ncleo y las estructuras que pueden distinguirse en el citoplasma. Haga un dibujo esquemtico. Observacin macroscpica las piezas anatmicas de Amebiasis intestinal.- Su aspecto general.- caractersticas externas. En observaciones microscpicas mayores, tratar de ubicar los trofoziotos en las lesiones observadas y los caracteres morfolgicos que permiten su identificacin. Entamoeba coli: Observe preparaciones al fresco y teidas con lugol de deposiciones con quiste de E. coli. Indique: su forma, numero de ncleos, tamao relativo.- Dibuje esquemticamente.
CUESTIONARIO
1.- Cmo interpretara la presencia de quistes tetranucleados de E. histolytica en la heces de una persona aparentemente sana? 2.- Qu le hace pensar una deposicin sanguinolenta con mucosidad? 3.-Podra usted diferenciar E. histolytica de E. coli, por las formas vegetativas sin colorear?
PRACTICA N 29
FLAGELADOS DEL INTESTINO Y DE LOS GENITALES

COMPETENCIAS
a) b) Compara la morfologa de los flagelados que se presentan en el intestino y en vagina. Da una nocin de las caractersticas biolgicas de estos parsitos.
MATERIAL:
Trofozoito de Giardia lamblia en laminas coloreadas por la Himatoxilina frrica y Giemsa. Haces con quistes de Giardia lamblia. Exudado vaginal con trofozoitos de Trichomonas vaginalis.
Ratas blancas parasitadas con Trichomonas muris.
Estudios de los parsitos: Phylum Protozoo. Clase: Mastigophora. Orden: Polimastigina. Genero: Giardia. Genero: Trichomonas. Giardia lamblia: A).- Trofozoitos: Observar los trofozoitos con inmersin, estudiando su aspecto anteroposterior. Poner atencin en la forma y estructuras visuales. Esquematizar. B).- Quistes: Identificar los quistes del parsito en las deposiciones. Informar lo siguiente: a) Tamao. b) Forma. c) Numero de ncleos. D) Dibujar. TRICHOMONAS VAGINALES a) Trofozoitos. Observar en secrecin vaginal a pequeo aumento, los trofozoitos. Poner atencin en el movimiento, tratando de reconocer la presencia de membrana ondulante y flagelos. b) Estudiar el aspecto y ponga atencin en la forma y estructuras visibles en trofozoitos de Tricomonas muris, aisladas de intestino de rata blanca.(compare dichas estructuras con las de T. vaginalis.)
CUESTIONARIO
a) Sobre la epidemiologa de la Giardiasis indique: La forma infectante de Giardia va de infeccin mecanismo de infeccin.
b)Cules son los mecanismos de transmisin de la tricominiasis vaginal?. Antelos por orden de importancia.
PRACTICA N 30
FLAGELADOS TISULARES: LEISHMANIA

COMPETENCIA:
a) b) Familiarizar a los alumnos en el conocimiento de los principales parsitos hemticos y titulares. Tratar de establecer las formas evolutivas de parsito en el hospedador vertebrado y en cultivos.
MATERIALES:
-Reactivos: Alcohol metlico, suero humano o de conejo, suero fisiolgico. - Colorantes:Giemsa.
- Formas de Leptomonas en cultivo de N.N.N. - Mtodo de coloracin de leptomonas de cultivo de Leishmania braziliensis. Procedimiento de coloracion del parsito cultivado: A) a) Coloracion Giemsa: En una lmina colocar una gota de suero humano o de animal de laboratorio (conejo o cobayo). Enseguida colocar una gota de cultivo. (sedimento de un lavado de cultivo) y mezclar bien, haciendo despus un frotis delgado b) c) d) Dejar secar bien y fijar despus, por el alcohol metlico. Preparar el Giemsa(una gota del colorante por cada ml de agua destilada tamponada). Adicionar el colorante a las preparaciones fijadas y dejar actuar por 30 a 45. Lavar en agua corriente y dejar secar. e) Observar a inmersin.
Estudio del parsito: Phylum Protozoa Clase: Mastigophora Orden: Protomonadina Genero: Leishmania. Especie: Leishmaia braziliensis A.- Observe las formas en Leishmania que aparecen generalmente fuera de la clulas que las contienen. Realice el siguiente ejercicio de observacin y presentan los parsitos por la coloracin Giemsa. dibuje: Tamao, forma, estructura interna, aspecto que
B.- Leptomonas de cultivo: Trate de observar los desplazamientos que caracterizan al flagelado. Ubicar la posicin del flagelo en relacin al movimiento. De las coloraciones practicadas con este mismo material establezca lo siguiente: tamao, posicin del ncleo, posicin del cinetoplasto y origen del flagelo. Dibuje la leptomona.
CUESTIONARIO
a) b) Es la leishmaniasis tegumentaria una zoonosis? En caso afirmativo explique porque. Cmo preparara usted un antgeno para la intradermorreaccin de leishmaniasis cutnea?
PRACTICA N 31
FLAGELADOS HEMATICOS Y TISULARES: TRIPANOSOMAS

COMPETENCIA:
a) b) Fija la estructura morfolgica de los tripanosomas y algunos aspectos de su biologa. Establecerla presencia de forma Leishmania como fase evolutiva del tripanosoma cruzi en vertebrados.
MATERIAL:
Fortines de Tripaosomas en sangre perifrica, coloreados con Giemsa (T. cruzi). Cortes histolgicos de miocarditis chagsica humana (Hematoxilina eosina).
Forma de crithidia de cultivo de T. cruzi. Fortines coloreados de crithidia de cultivo de T. cruzil. Erotices de sangre de rata gris (Rattus alexandrinus) demostrando T. lewisi. Practica del xenodiagnstico.
ESTUDIO DEL PARSITO: Phylum Protozoo. Clase: Mastigophora. Clase: Proyomonadina. Genero: Trypanosnoma. Tripanosoma cruzi (Schizotripanu cruzi). Examine T. cruzi en frotis tejido de sangre perifrica (o animales de laboratorio). Obseerve: Forma, tamao aproximado, ncleo, posicin y tamao del cinetoplasto, membrana ondulante. Dibuje. Examine cortes histolgicos de miocarditis chagasica humana: trate de identificar los nidos de Leishmania y el aspecto que presenta la fibra miocrdica por accin del parasitismo. Observe cultivos al fresco con formas de crithidias, note el aspecto morfolgico sin teir, movilidad y desplazamiento. Dibuje las Crthidias coloreadas estableciendo las principales diferencias morfolgicas con la forma tripanosomita. Tcnica del xenodiagnstico: Se usan ninfasLimpias, esto es, criadas en laboratorio desde huevos. Se colocan en cajitas de cartn (cajas de fsforos) a las que previamente se les ha hecho una abertura la que es revestida de gasa. Aplicar la cajita en la l cara interna del antebrazo de algn voluntario y fijarla con un elstico, cubrir todo con la manga del mandil. Al cabo de 20, retirar la caja y observar si los insectos picaron. Llenar con los datos correspondientes al xenodiagnstico (nmero, fecha y el formulario respectivo). Efectuar la lectura del xenodiagnstico a la 30-90 das. Observar en un frotis, tenido de T. lewisi y establecer: forma, tamao aproximado, ncleo, posicin y tamao del cineoplasto y membrana ondulante, estableciendo las principales diferencias morfolgicas con T. cruzi. Dibuje.
CUESTIONARIO
a) Explique el fundamento biolgico del xenodiagnstico. b) Por qu la enfermedad de chagas se presenta preferentemente en forma endmica en reas rurales y suburbanas?
PRACTICA N 32
ESPOROZOARIOS
I.- Coccidias : Eimeria etiedae
COMPETENCIAS:
A.- Obtiene una nocin bsica del rol patgeno que cumplen las coccidias en la avicultura y la ganadera. B.- Contribuye al conocimiento de las caractersticas biolgicas de los Esporozoarios no agentes de malaria.
MATERIALES:
Muestras de heces de conejo y aves de corral. Cultivos de heces de conejo en Bicrometo de K al 2%.
Cortes histolgicos de hgado de conejo coloreados por la hematoxilina frrica y hematoxilina eosina. Aplicacin del mtodo de Faust: Centrifugacin y flotacin.
Estudio de los parsitos: Clase: Familia: Genero: Sporozoa. Eimeriidae. Eimeria
Especie (Sp): E. stiedae.
PROCEDIMIENTO: a) Morfologa:
1.- Examinar heces de conejo al microscopio y tratar de observar quistes inmaduros (no esporulados)de E. etiedae. Estudiar sus caractersticas morfolgicas: Tamao aproximado.- Forma.- Refringencia.-Membrana qustica.- Aspecto del huevo o zigote. Dibujar. 1.1.-Examinar heces cultivadas de conejo y observar quistes maduros (esporulados). Estudiar sus caracteristicas morfologicas: Tamao.- Forma.- Membrana qustica.- Aspecto de los esporoblastos.- Aspecto de los esporocistos.Nmero de esporozoitos. Dibujar.
b) Biologa:
1.- En cortes histolgicos de hgado de conejo observar comprar los diferentes estadios evolutivos de E. estiedae (Fase esquizgonica). 2.- Realizar con las heces de animales una concentracin por el mtodo de Faust. Comparar el nmero de quistes del parsito, al obtenido por el Mtodo Directo. Cuestionario: A .- Establezca las diferencias morfolgicas y biolgicas de Eimeria stiedae y Eimeria tenella. B .-Qu medidas profilcticas recomendara a una avicultor para evitar la coccidiosis?.-
PRACTICA N 33
ESPOROZOARIOS
Plasmidum vivax,Plasmodium falciparum,Plasmodium malarie.
COMPETENCIAS:
Observa algunas caractersticas diferenciales de las tres especies mas comunes del Genero Plasmodium, Conoce sus aspectos evolutivos su relacin con la patologa humana.
MATERIAL:
Frotices de sangre con Pl vivax, P. malarie y P. falciparun, en diversos estadios evolutivos (teidos con May Grunwald-Griemsa).
Frotices de sangre perifrica de ratones con Plasmodium berghei en la cual se presentan todos los estados evolutivos de la fase esquizognica eritrocitaria.
Estudio de los parsitos: Clase: Toxoplasmea. Familia: Toxoplasmatidae. Genero: Toxoplasma. Sp.: T. gondii.
PROCEDIMIENTO:
A) Morfologa a) Visualizar (a inmersin)formas libres de T. gondii en exudado peritoneal de ratn. Dibujar el aspecto y estructuras que presentan. b) En extendido peritoneal de ratn observa las formas proliferativas o de multiplicaciones del parsito dentro de las clulas; comparar con las formas libres. B) Patologa: a a Observar cortes histolgicos de cerebro de ratn n (inoculacin experimental) y trata de ubicar los quistes parasitarios.
CUESTIONARIO
a) es posible de encontrar formas libres de T. gondii en un frontis de sangre perifrica de un paciente con toxoplasmosis? b) Qu tipos de lquidos orgnicos pueden ser utilizados para el diagnostico microscpico de toxoplasmosis.
PRACTICA N 34
CILIADOS: Balantidium coli

COMPETENCIA:
Identifica al mas grande ciliado parsito del hombre y hacer conocer su morfologa y otros aspectos biolgicos.
MATERIALES:
Ciegos intestinales de cerdo con Balantidium coli (formas vegetativas). Cortes histolgicos de balantidiasis intestinal (hematoxilina eosina).
B. coli : lminas coloreadas por la hematoxilina frrica.
Estudio del parsito: Clase: Cilliata. Orden: Spirotricha. Familia: Balantidiidae. Genero: Balantidium. Sp.: coli.
PROCEDIMIENTO:
A) MORFOLOGIA Y BIOLOGIA: a) b) c) d) Observe, con pequeo aumento, una porcin de heces obtenida del ciego intestinal del cerdo y emulsionadas con 1 o 2 gotas del suero fisiolgico. Describa las caractersticas mas importantes de la movilidad del parsito. En esta misma preparacin, trate de localizar el macroncleo, el microncleo, el citostoma, las vacuolas y la disposicin de los cilios en trofozoitos que hayan disminuido sus movimientos de traslacin. Observe con pequeo aumento, las preparaciones teidas. Haga un dibujo esquemtico del parsito, dando nombre a las estructuras mas destacadas que reconoce. Quistes En las mismas preparaciones tratar de ubicar a los quistes del ciliado, de tamao similar a los trofozoitos pero de formas mas redondeada. Observe la membrana qustica. Dibuje el quiste.
B) PATOLOGA: Observe cortes histolgicos con lesiones balantidianas. trate de ubicar a los trofozoitos en la mucosa intestinal.
CUESTIONARIO:
a) b) Cmo se explicara la penetracin del B. coli en la pared intestinal? Es la balantidiasis una zoonosis? .- explique la razn de su respuesta.-
PRACTICA N 35
HELMINTOLOGIA
INTRODUCCION AL CONOCIMIENTO DE LAS TECNICAS PARA ELTRABAJO CON HELMINTOS RECOLECCION, FIJACION Y CONSERVACION DE HELMINTOS
COMPETENCIA:
Proporciona un conocimiento bsico de las tcnicas de recoleccin, fijacin, coloracin, conservacin y catalogacin de helmintos.
MATERIAL:
Ratas grises: Rattus norvegicus; murcilagos: Tadarida brasiliensis; lagartijas de cabeza roja: Dicrodon heterolepis; saps bufo Spinulosus limensis; chucluyes o guarda caballo: Crotopha sulcirrostris. Cloroformo, algodn, cajas petri, estiletes, tijeras, pinzas , bisturies, tubos de 13 x 100; suero fisiolgico, formolactico y tabla de diseccin.
PROCEDIMIENTO:
a) b) c) d) e) f) Anestesiar con cloroformo los animales para la diseccin. Asegurar con piolas al animal en la tabla de diseccin. Cortar con tijera y con la ayuda de una pinza, desde la base del cuello hasta el ano, centralmente. Examinar la sangre, colocando una gota con suero fisiolgico entre lmina y laminilla para detectar parsitos hemticos. Aislar los rganos en petris que contengan un poco de suero fisiolgico. Fragmentar esos rganos en el mismo petri.
Fijacin y conservacin:
Nemtodos: a) b) c) Lavar los parsitos en suero fisiolgico. Matarlos con formol-actico caliente. Conservarlos en formol-actico fro y etiquetar.
Tremtodos: a) b) c) Lavar con suero fisiolgico. Prensar entre dos lminas porta-objeto. Conservar en formol-actico fri y etiquetar.
Cstodos:
a.- Lavar en suero fisiolgico. b.- Lavar en suero fisiolgico. c.- Matar en formol neutro caliente.
A.- Para cstodes menores:

a) procurar extraerlos ntegros (con sclex) y colocar en la nevera observndolos hasta que no tengan ningn movimiento para finalmente sumergirlos en formol-actico fri y etiquetar. Formato de la etiqueta: Para todo parsito que se colecte, debe consignarse los siguientes datos:
a) b) c) d) e)
el nmero de la muestra. El nombre cientfico del hospedador. El rgano parasitado. Procedencia del hospedador. El nombre del colector y la fecha.
CUESTIONARIO
a) b) c) Con que objeto se hace la fijacin de los nematodos con formol actico caliente? para que se prensa a los tremtodos? Qu importancia tiene la obtencin del parsito con su sclex?

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DOCENTES:

Dra. GRACIELA ALBINO CORNEJO (Coordinadora) Med. LILIANA TORRES SAMAME

IV.- NORMAS ADICIONALES V.- NORMAS DE BIOSEGURIDAD. I.- PRESENTACIN

III.- INSTRUCCIONES GENERALES

IV.- NORMAS ADICIONALES

V.- NORMAS DE BIOSEGURIDAD

INSTRUMENTAL BSICO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

EXPERIENCIA 1: MANEJO DE MICROSCOPIO Y PREPARADO EN FRESCO PARA EXAMEN DIRECTO

TINCIN DE LOS MICROORGANISMOS

PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

II. FUNDAMENTO TERICO

- Cloruro de sodio: 0.5 g. - Agua destilada: 100 ml

- Cloruro de sodio: 0.5g - Agar: 1.5g

- Agua destilada: 100ml

Agar Nutritivo - Peptona: 1.0g

- Cloruro de sodio: 0.5g - Extracto carne: - Agar: 0.3g 1.5g

MEDIOS SELECTIVOS DIFERENCIALES:

- Rojo de fenol - Agar:

Disolver en 100 ml de agua destilada. PH : 7.4

Disolver a bao mara en 100 mL de agua destilada PH: 7.1

TCNICAS DE SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

II. FUNDAMENTO TEORICO:

PRUEBAS BIOQUMICAS PARA LA IDENTIFICACIN DE BACTERIAS

Medio de cultivo: Agar TS1: Extracto de carne.................... 0.3 g.

Extracto de levadura ............... 0.3 g.

pH: 7.3 0.1

Cultivos Bacterianos: Cepas de Proteus vulagris, Salmonella tiphi y Escherichia coli.

PRUEBA DE PRODUCCIN DE INDOL

2. Medio de cultivo: Medio Agar Lisina Hierro (LIA):

Cultivos Bacterianos: Cepas de Proteus vulagris, Salmonella tiphi y Escherichia coli.

REALIZAR EL SIGUIENTE ESQUEMA DE SIEMBRA:

Se pica en el fondo y luego se realiza un zig-zag en la superficie

Se pica en el centro del medio

MTODOS DE DIFUSIN: En medio slido (MUELLER HINTON), en el que la sensibilidad es

MEDIDA DEL HALO

PRACTICA N 8 CONTENIDO TEMATICO PROCEDIMENTAL:

ACCIN DE LOS AGENTES FSICOS Y QUMICOS SOBRE EL DESARROLLO BACTERIANO

c) Qu explicacin dara usted a la accin de los agentes qumicos?

FASES DEL ESTUDIO BACTERIOLGICO DE UN PRODUCTO

EXAMEN MACROSCPICO: Aspecto macroscpico (Caracteres organolpticos)

EXAMEN MICROSCPICO: En fresco. Coloraciones: comunes Espaciales.

MEDIO DE CHAPMAN: Extracto de carne .............. 1 grs

PLACA DE AGAR CHAPMAN

SEGUNDA PARTE PRUEBA DE LA CATALASA:

CATALASA (+)= Burbujas. CATALASA (-)= No Burbujas. B.-RESULTADO:

COAGULASA (+)= Coagulo. COAGULASA (-)= No Coagulo.

GENERO STREPTOCOCCUS - Streptococcus pyogenes

Aislamiento: Emplear agar sangre en placas y caldo Thioglicolao.

Caldo Thioglicolato: Casitone ......................... 15 grs

Exracto de levadura ..............5 grs Dextrosa ......................... 5.5 grs

Agua destilada ................... 1,000 ml

STREPTOCOCCUS Colonias pequeas puntiformes Si Hemlisis

Escaso crecimiento o nulo.

KH2 PO4................ Na HPO4...............

Diplococcus pneumoniae (NEUMOCOCO)

L. acidophillus (B. de doderrlein), L. bifidus

Bacto agar ..........................

B.- Qu significacin tiene la presencia de Lactobacillus en tracto intestinal y en vagina?

GENERO NEISSERIA, MORAXELLA

COMPETENCIAS Los de orden general .

Los medios de aislamiento son selectivos e indicadores:

en los medios de aislamiento y composicin de estos: Los

medios ms usuales son el S.S. el MacConkey, el Desoxycholato Citrato y el Sulfito de Bismuto.