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ALUMNO:

Curso : BACTERIOLOGIA
GUA DE PRCTICAS
SILVIA LILIANA ARA ROJAS

2009

ESBI FACI - UNJBG

[CURSO : BACTERIOLOGIA]

2009

BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
Las reglas bsicas aqu indicadas son un conjunto de prcticas de sentido comn realizadas en forma rutinaria. El elemento clave es la actitud proactiva hacia la seguridad y la informacin, que permitan reconocer y combatir los riesgos presentes en el laboratorio. Ser fundamental la realizacin meticulosa de cada tcnica, pues ninguna medida, ni siquiera un equipo excelente puede sustituir el orden y el cuidado con que se trabaja. 1. Se deber conocer la ubicacin de los elementos de seguridad en el lugar de trabajo, tales como: salidas de emergencia, lavaojos, gabinete para contener derrames, accionamiento de alarmas, etc. 2. No se permitir comer, beber, fumar o maquillarse. 3. No se debern guardar alimentos en el laboratorio, ni en las heladeras que contengan drogas. 4. Se deber utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio y cabello recogido (guardapolvo preferentemente de algodn y de mangas largas, zapatos cerrados, evitando el uso de accesorios colgantes). 5. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa de la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes. 6. Las manos deben lavarse cuidadosamente despus de cualquier manipulacin de laboratorio y antes de retirarse del mismo. 7. Se debern utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias qumica o material biolgico. Ninguna persona cuyos guantes se encuentren contaminados deber tocar objetos, ni superficies, tales como: telfono, lapiceras, manijas de cajones o puertas, cuadernos, etc. 8. No se permitir correr en los laboratorios. 9. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos, se utilizarn anteojos de seguridad u otros dispositivos de proteccin. Cuando se manipulen productos qumicos que emitan vapores o puedan provocar proyecciones, se evitar el uso de lentes de contacto. 10. No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con equipos, mquinas u otros elementos que entorpezcan la correcta circulacin. 11. Todo material corrosivo, txico, inflamable, oxidante, radiactivo, explosivo o nocivo deber estar adecuadamente etiquetado. 12. Se requerir el uso de mascarillas descartables cuando exista riesgo de produccin de aerosoles (mezcla de partculas en medio lquido) o polvos, durante operaciones de pesada de sustancias txicas o biopatgenas, apertura de recipientes con cultivos despus de agitacin, etc. 13. Las prcticas que produzcan gases, vapores, humos o partculas, y aquellas que pueden ser riesgosas por inhalacin deben llevarse a cabo bajo campana. 14. Se deber verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender una fuente de ignicin.

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El material de vidrio roto no se depositar con los residuos comunes. Ser conveniente ubicarlo en cajas resistentes, envuelto en papel y dentro de bolsas plsticas. Ser necesario que todo recipiente que hubiera contenido material inflamable, y deba ser descartado, sea vaciado totalmente, escurrido, enjuagado con un solvente apropiado y luego con agua varias veces. Est prohibido descartar lquidos inflamables, txicos, corrosivos o material biolgico por los desages de las piletas, sanitarios o recipientes comunes para residuos. Cuando sea necesario manipular grandes cantidades de materiales inflamables (ms de 5 litros.) deber tenerse a mano un extintor apropiado para el material en cuestin. Al almacenar sustancias qumicas debe considerarse que hay cierto nmero de ellas que son incompatibles, pues almacenadas juntas pueden dar lugar a reacciones peligrosas.

LLENAR La/El alumna/o ...............................................................................de la materia Bacteriologa ha ledo la gua de Normas Mnimas de Seguridad que acompaa esta gua. Fecha: .............................................. Firma: ...............................................

EQUIPOS Incubadora Autoclave Horno Refrigeradora Freezer Agitador magntico Balanza Cmara cuentacolonias Vortex Equipo de filtracin por membrana Espectrofotmetro Lmpara de UV Sistema Gaspack

Ejercicio prctico: Esquematizar cada uno de los equipos e indicar su funcin y manejo

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[CURSO : BACTERIOLOGIA] PRCTICA N 1

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ESTERILIZACIN DE MATERIALES USO DE CALOR SECO Y HMEDO Los materiales de uso en el laboratorio de microbiologa en muchas ocasiones deben tener como caracterstica su esterilidad y por ende inocuidad ya que contendrn muestras biolgicas para su anlisis. Estos materiales suelen esterilizarse mediante el uso de calor en dos variantes principales: calor seco y calor hmedo. La esterilizacin por calor seco produce la destruccin de los microorganismos por oxidacin de sus componentes celulares. ste es un proceso menos eficiente que la esterilizacin por calor hmedo, porque los microorganismos mueren con mayor rapidez cuando se encuentran en presencia de agua, ya que ste permite que se altere con mayor facilidad la configuracin de sus protenas y proporciona un medio para distribuir el calor uniformemente en toda la cmara interna del equipo de esterilizacin. Por esta razn, para lograr la esterilizacin del material empleando el calor seco, se deben aplicar temperaturas ms altas durante mayor tiempo. La esterilizacin por calor seco se puede realizar por varios mtodos: Aire caliente, Llama directa e Incineracin El calor hmedo destruye los microorganismos por coagulacin de sus protenas celulares. El principal mtodo de esterilizacin que emplea calor hmedo es la esterilizacin por vapor a presin. Existen otros mtodos de descontaminacin que emplean este tipo de calor los cuales, aunque no permiten la destruccin total de los microorganismos, disminuyen la carga microbiana que posee un material. Entre estos mtodos podemos citar: _ Tindalizacin (esterilizacin fraccionada), Agua hirviendo, Pasteurizacin y Olla de presin La esterilizacin por vapor a presin se lleva a cabo en autoclave. Estos equipos emplean vapor de agua saturado, a una presin de 15 libras lo que permite que la cmara alcance una temperatura de 121C. El tiempo de esterilizacin usualmente es de 15 minutos, sin embargo, en algunas oportunidades, dadas las caractersticas del material, es necesario variar el tiempo de esterilizacin Cuando se utiliza este mtodo es importante controlar en el autoclave la relacin entre la temperatura, la presin y el tiempo de exposicin, ya que stos son factores crticos en el proceso. Slo cuando el vapor se coloca bajo presin, es cuando su temperatura aumenta por encima de los 100C y esto permite alcanzar las temperaturas de esterilizacin (121C). Los objetivos de esta prctica son aplicar el procedimiento de esterilizacin adecuado a cada tipo de material, garantizando la efectividad y la eficiencia; aplicarlo con seguridad, disminuyendo los riesgos inherentes a los procedimientos de esterilizacin y escogiendo los ms seguros para todos. MATERIALES: Papel Kraft Pavilo Marcador Matraces, balones SILVIA LILIANA ARA ROJAS

Pipetas de vidrio Placas de Petri Mecheros Asas de koll Page 4

[CURSO : BACTERIOLOGIA] Algodn SSF Tapones de jebe Medios de cultivo de descarte

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Autoclave Horno Mechero bunsen

A. ESTERILIZACIN POR CALOR SECO Llevar el material de vidrio preparado al horno Colocar cintas adhesivas (indicadores qumicos) al material a esterilizar. Leer la temperatura del horno y anotar el valor en la planilla de registro. Nota: el horno debe encenderse aproximadamente 30 minutos antes de introducir el material. B. Colocar el material a esterilizar dentro del horno. El material debe colocarse correctamente dentro del horno, ya que la forma como ste se ubica puede interferir con la distribucin del calor, lo cual influye directamente en la eficacia del proceso de esterilizacin. Al colocar el material dentro de los hornos se deben tomar las siguientes precauciones: Distribuir todo el material en forma ordenada en toda la superficie interna disponible. Evitar amontonar el material en un rea especfica. No colocar el material uno sobre otro. Evitar que el material toque las paredes del horno. Colocar en posicin vertical cualquier material, que lleve tapones de algodn. C. Cerrar el horno y comenzar a contar el tiempo del proceso de esterilizacin cuando la temperatura est en 170 C. Anotar la informacin en las planillas de registro. D. Una vez transcurrido el tiempo de esterilizacin apagar el horno y esperar a que se enfre hasta temperatura ambiente para retirar el material. RESULTADOS E. Temperatura inicial del horno: _________________ F. Tiempo de duracin del proceso (desde que se alcanzaron los 170C): _________________ G. Indicador utilizado: _______________________________ H. Caractersticas del indicador antes del proceso de esterilizacin: ______________________ I. Caractersticas del indicador despus del proceso de esterilizacin _____________________ ___________________________________ CONCLUSIONES J. El proceso de esterilizacin fue: SATISFACTORIO NO SATISFACTORIO porque____________________________________________________________________

B. ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO Trasladar los medios de cultivo y colocarlos en la canastilla del autoclave. El material debe colocarse correctamente dentro del equipo para que permita la correcta distribucin del vapor de agua. Para ello se deben tomar las siguientes precauciones: Distribuir el material en forma ordenada en toda la superficie interna disponible. SILVIA LILIANA ARA ROJAS Page 5

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Evitar amontonar el material en un rea especfica. No colocar el material uno sobre otro. Evitar que el material toque las paredes del autoclave. No preparar cestas con tubos donde stos se encuentren demasiado apretados. Colocar la ampolla del indicador biolgico en el lugar que se considere ms difcil que llegue el vapor. Esperar que se alcancen los 121C y comenzar a contar el tiempo de esterilizacin. Cuando termine el tiempo de esterilizacin, apagar el autoclave. Esperar que bajen la presin y la temperatura del equipo para abrirlo y retirar los medios de cultivo. Si alguno de los medios se requiere en forma biselada (inclinado), en este momento se colocan sobre una superficie que permita obtener el grado de inclinacin deseado. Retirar el indicador biolgico e incubarlo bajo las condiciones que seale el fabricante. Esperar que el material alcance la temperatura ambiente antes de almacenarlo. Despus del periodo de incubacin observar las caractersticas del indicador biolgico.

RESULTADOS Temperatura alcanzada en el proceso: _________________ Tiempo de duracin del proceso: _________________ Indicador biolgico utilizado: ________________________________________ Caractersticas del indicador biolgico antes del proceso de esterilizacin. ________________ Caractersticas del indicador biolgico despus del proceso de esterilizacin y el periodo de incubacin _________________________________________________ CONCLUSIONES El proceso de esterilizacin fue: SATISFACTORIO NO SATISFACTORIO porque____________________________________________________________ *-*-*-*-*-*

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[CURSO : BACTERIOLOGIA] PRCTICA N2

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MICROSCOPA MANEJO Y CUIDADOS DEL MICROSCOPIO DE LUZ Una de las herramientas bsicas de un laboratorio de microbiologa es un microscopio de luz. Este tipo de microscopio recibe este nombre ya que permite el paso de luz no alterada a travs de un sistema de lentes de manera de producir un campo brillante donde se pueden observar pequeos objetos. Para poder estudiar microorganismos como bacterias, hongos, algas, parsitos, etc. el microscopio debe estar provisto de un sistema ptico y mecnico sin defectos. Del microscopio es sumamente importante conocer: Sus partes y la funcin de cada una de ellas. Cmo manipular el sistema ptico para obtener el mayor aumento y resolucin. Cmo manipular el sistema de iluminacin ya que la resolucin de la imagen a su mximo aumento, depende de su adecuado manejo. Cuidados y almacenamiento. PARTES DEL MICROSCOPIO El microscopio de luz es un aparato ptico usado para amplificar y resolver detalles finos de un objeto microscpico. Est compuesto de diferentes partes: mecnica, ptica y de iluminacin. PARTE MECNICA 1. Base o pie: sirve de soporte al microscopio y suele tener el peso suficiente para darle estabilidad al aparato. 2. Columna: une la platina a la base y sostiene al condensador y al diafragma. 3. Tubo: sostiene al ocular y al objetivo y los mantiene separados por la distancia de trabajo correcta. 4. Brazo: continuacin de la base o pie que permite movilizar al microscopio con la mano. 5. Platina: sostiene las preparaciones con la muestra colocadas sobre una perforacin central que deja pasar la luz que viene del condensador o del espejo. 6. Pinzas: sostienen a la lmina portaobjeto con firmeza sobre la platina. 7. Revolver: permite colocar en posicin de trabajo, alternativamente, los objetivos que posee el microscopio. 8. Tornillo macromtrico: mueve la platina hacia arriba o hacia abajo, acercando o alejando rpidamente el objetivo a la distancia de trabajo aproximada con respecto a la muestra. 9. Tornillo micromtrico: permite mover lentamente y con precisin el tubo hacia la platina o viceversa. PARTE PTICA 10. Oculares: compuestos por lentes que multiplican el aumento del objetivo. Estn ubicados en la parte superior del tubo. Un buen ocular (10x) puede permitir un aumento total de 1000x. 11. Objetivos: compuesto por lentes de diferente aumento. Se encuentran ubicados en la parte inferior del tubo (sistema de revolver). Normalmente un microscopio de luz dispone de tres lentes objetivo: 10X, 40X y 100X, independientes e intercambiables. Cada uno de ellos tiene un aumento SILVIA LILIANA ARA ROJAS Page 6

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dado, y su propsito es magnificar el objeto para producir una imagen real que se proyecta hasta el plano focal del ocular. Esta imagen, a su vez, es magnificada por el ocular para producir la imagen virtual, que es vista por el ojo de observador. El objetivo de 10X es el ms corto de los tres, le sigue el de longitud intermedia con un aumento de 40-45X. El ms largo de todos es el objetivo de inmersin que tiene un aumento de 100X. El nmero del aumento lo tienen inscrito en su parte lateral. La distancia focal de cada uno de ellos es de aproximadamente 16 mm, 4 mm y 1.8 mm respectivamente.

Distancias focales con los tres objetivos ms comnmente utilizados Inmersin, 40 X y 10 X SISTEMA DE ILUMINACIN 12. Fuente de luz: puede utilizarse luz artificial de una lmpara externa o una que se inserta en la base o pie del microscopio. Cuando se utiliza la lmpara externa se requiere de un espejo. 13. Espejo: lo requieren aquellos microscopios que trabajan con lmparas externas y permite reflejar hacia arriba la luz que debe atravesar el diafragma, la platina, la preparacin y el sistema ptico. El espejo plano se utiliza cuando hay bastante luz y el cncavo cuando hay poca luz. 14. Condensador: concentra el haz luminoso en la preparacin. 15. Diafragma: regula la cantidad de luz que pasar a travs de la preparacin. EJERCICIO TERICO Ubique en la figura que se presenta a continuacin las partes del microscopio discutidas.

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PODER DE RESOLUCIN La amplificacin total de un microscopio de luz es el producto de la amplificacin de dos sistemas de lentes (ocular y objetivo). La amplificacin podra aumentarse indefinidamente empleando lentes adicionales, pero ello no se puede lograr en la prctica debido a una propiedad que tiene las lentes conocida como poder de resolucin. El poder de resolucin se define como la capacidad de un lente para presentar dos puntos cercanos como puntos diferentes y separados. El poder de resolucin puede calcularse dividiendo la longitud de onda de la luz empleada, entre otra caracterstica de las lentes conocida como apertura numrica, esta ltima es funcin del dimetro real del objetivo en relacin con su distancia focal y el poder de desviar el rayo luminoso o ndice de refraccin del medio que hay entre la muestra y el objetivo. Poder de resolucin = Longitud de onda/Apertura numrica De la frmula anterior se puede concluir que mientras ms corta es la longitud de onda empleada, ms pequea ser la estructura visible. Debido a que normalmente se utiliza una fuente de luz visible, la longitud de onda promedio es constante y por lo tanto el poder de resolucin depender de la apertura numrica. Segn su definicin la apertura numrica est relacionada con el ndice de refraccin del medio que hay entre la muestra y el objetivo. Debido a que el ndice de refraccin del aire es menor que el del vidrio, los rayos luminosos se refractan o se desvan cuando pasan de la lmina portaobjeto al aire. Si la mayora de los rayos luminosos se refractan en un ngulo muy grande, se pierden para el objetivo. Si colocamos entre la lmina y el objetivo de 100 X un aceite de inmersin que tenga un ndice de refraccin aproximadamente igual al del vidrio, disminuye la SILVIA LILIANA ARA ROJAS Page 8

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desviacin y un porcentaje mayor de rayos luminosos procedentes de la muestra pasarn directamente al objetivo, consiguindose una mayor resolucin y una imagen ms clara.

Efecto del aceite de inmersin para aumentar el poder de resolucin En conclusin para obtener la imagen de mayor aumento, ms ntida y con mayor poder de resolucin se debe: Disponer de lentes de ptima calidad. Disponer de oculares de gran aumento. Trabajar con el objetivo de inmersin. Utilizar aceite de inmersin de buena calidad. USO DEL MICROSCOPIO Para el buen uso del microscopio en el laboratorio de microbiologa se deben tener en cuenta los siguientes aspectos. Los microscopios estn numerados y se guardan en gabinetes con cerraduras. A cada estudiante del grupo se le asigna un microscopio por el cual ser responsable. La mesa donde se colocar el microscopio para hacer la observacin debe ser estable para evitar vibraciones de la muestra durante el examen. La posicin del observador ante el microscopio debe ser cmoda y a una altura correcta. El mesn de trabajo debe estar limpio y libre de libros, cuadernos, bandejas y reactivos. Cuando se transfiera el microscopio del gabinete al mesn de trabajo, se agarra fuertemente el brazo del microscopio con la mano derecha y se coloca la mano izquierda por debajo del instrumento. Si no se realiza de esta manera, las probabilidades de golpear contra el mesn o dejarlo caer se elevan. Bajo ninguna circunstancia se debe tomar el microscopio con una sola mano y menos an, dos microscopios con dos manos. Una vez finalizada la observacin, se limpian las lentes y se guarda siguiendo las mismas instrucciones de transporte. OBJETIVO Al finalizar el estudiante estar en capacidad de: SILVIA LILIANA ARA ROJAS Page 9

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Reconocer las partes de un microscopio de luz y su funcin respectiva. Utilizar correctamente un microscopio de luz para observar lminas. PROCEDIMIENTO Con las lminas portaobjeto que le suministre el profesor observe la muestra con el microscopio de luz utilizando el objetivo adecuado. Para ello se procede de la siguiente manera: 1. Colocar sobre la platina la lmina portaobjeto con la muestra colocada en la parte superior. 2. Situar cuidadosamente la parte que va a examinar sobre el agujero central de la platina. 3. Ajustar la fuente de iluminacin hasta que pase la mayor cantidad de luz a travs de la muestra. El diafragma y el condensador, se deben ajustar hasta que la luz cubra todo el campo visual. 4. Seleccionar el objetivo adecuado y con el tornillo macromtrico aproximar a la lmina el tubo del microscopio hasta que los separe aproximadamente la distancia focal adecuada. 5. Observar por el ocular, con ambos ojos abiertos, aproximando lentamente el objetivo, con ayuda del tornillo macromtrico. 6. Enfocar totalmente la muestra con el tornillo micromtrico y ajustar el diafragma y el condensador hasta lograr una buena iluminacin, es decir, ni demasiado brillante ni demasiado oscuro. ENFOQUE CON EL OBJETIVO DE INMERSIN El enfoque con el objetivo de inmersin se debe realizar con mayor cuidado, pero el procedimiento es esencialmente el mismo. 1. Enfocar primero con el objetivo de mediano aumento (40 X) un rea conveniente. 2. Levantar el tubo y colocar el objetivo de inmersin girando el revolver hasta que ste encaje. 3. Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la muestra. 4. Bajar cuidadosamente el objetivo de inmersin, observando lateralmente, hasta que el objetivo quede sumergido en el aceite. 5. Enfocar la imagen con el tornillo micromtrico. Este enfoque debe lograrse casi inmediatamente, puesto que la distancia de trabajo del objetivo de inmersin es relativamente corta. 6. Ajustar el condensador y diafragma hasta lograr la iluminacin adecuada. Una vez realizadas las observaciones: 1. Anotar lo observado. 2. Remover todo el aceite de inmersin que queda sobre el objetivo con un papel especial que le suministrar el profesor. 3. Guardar el microscopio. RESULTADOS Dibujar en los crculos lo observado, anotando el objetivo utilizado y el aumento final.

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Lmina No. 1 Lmina No. 2 Objetivo: _______ Objetivo: ______ Ocular: ________ Ocular: ________ Aumento: ______ Aumento: ______ Descripcin de lo observado: Descripcin de lo observado: _________________________ _________________________ _________________________ _________________________ _________________________ _________________________ _________________________ _________________________ _________________________ _________________________

Lmina No. 3 Lmina No. 4 Objetivo: _______ Objetivo: ______ Ocular: ________ Ocular: ________ Aumento: ______ Aumento: ______ Descripcin de lo observado: Descripcin de lo observado: _________________________ _________________________ _________________________ _________________________ _________________________ _________________________

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CUIDADOS Y ALMACENAMIENTO DEL MICROSCOPIO Un microscopio puede tener una vida media larga, siempre y cuando se tomen precauciones en el cuidado de lentes y se cumplan normas para su transporte y almacenamiento. Cuidado de lentes Para utilizar efectivamente la mayor cantidad de luz, que entra al microscopio, es importante que el espejo (si lo tiene), el condensador, y las lentes se mantengan limpios. Para limpiarlos se deben utilizar papeles y soluciones de limpieza apropiados para evitar el dao de las lentes. Papeles de limpieza: nicamente se deben utilizar papeles pticamente limpios. Lo que se utiliza con ms frecuencia en los laboratorios son unas pequeas libretas que contienen este tipo de papel las cuales se deben proteger del polvo. Est prohibido utilizar pauelos, servilletas o cualquier otro tipo de material para limpiar las lentes aunque stos estn limpios. Objetivos: Las lentes objetivos frecuentemente se ensucian con material proveniente de las lminas y los dedos. Los papeles descritos anteriormente pueden eliminar la grasa y otros materiales que se depositan sobre el objetivo, pero la limpieza final usualmente se lleva a cabo con solventes orgnicos, preferiblemente con xilol. Es importante utilizar la cantidad adecuada de solvente, ya que un exceso puede daar el cemento que mantiene unido el lente a la base. El pequeo flujo de aire que se obtiene con una jeringa tambin puede ser adecuado para remover la pelusa remanente. Ocular: Para comprobar la limpieza del ocular, ste se debe rotar entre los dedos y al mismo tiempo se debe observar a travs del microscopio. Una imagen que rota constituye una evidencia de la presencia de suciedad. Proceda a limpiar ambos lentes con el papel adecuado y remueva la pelusa restante con un pequeo chorro del aire. Sugerencias adicionales 1. Revisar el aceite de inmersin para asegurarse que no est turbio. Un buen aceite de inmersin debe ser claro. Un aceite en mal estado daa las lentes. 2. Mantener los oculares limpios. 3. Mantener el condensador en su posicin ms alta. 4. Si el microscopio dispone de espejo, utilizar la superficie plana. 5. Mantener el diafragma completamente abierto. 6. No intercambiar los objetivos o los oculares de microscopios distintos, y, bajo ninguna circunstancia separar las lentes frontales de los objetivos. Almacenamiento El microscopio debe almacenarse en ptimas condiciones. Antes de guardarlo es necesario: Remover la lmina portaobjeto de la platina. Limpiar el objetivo de inmersin, si ste fue utilizado. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de uso. Desconectar la lmpara (si el microscopio lo requiere) y guardarla dentro de la caja del Transferir el microscopio del mesn al gabinete, previamente abierto, tomandocon una mano, el brazo del microscopio y la base con la otra.

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[CURSO : BACTERIOLOGIA] PRCTICA N3

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OBSERVACIN DE FORMAS Y ESTRUCTURAS BACTERIANAS POR MICROSCOPA DE CAMPO CLARO En el laboratorio de bacteriologa, la morfologa de los procariotas (forma y estructura) pueden ser examinadas por medio de dos tcnicas: por observacin de organismos vivos no coloreados o por observacin de organismos muertos y teidos. Sin embargo, la mayora de bacterias son incoloras y por lo tanto no hacen contraste con el medio en el cual estan suspendidas, esto dificulta la observacin cuando no son teidas. La coloracin o teido de los microorganismos permite lo siguiente: Establece un contraste entre el organismos y el medio circulante Permite diferenciar varios tipos morfolgicos por su forma, arreglo, reaccin gram, etc. Permite observar ciertas estructuras como flagelos, cpsulas, endosporas, etc. Para colorear bacterias pueden emplearse tanto colorantes bsicos como cidos, obteniendo por lo tanto, coloraciones directas e indirectas de los organismos que permites observar y diferenciar formas y estructuras de los mismos. MATERIALES:

Muestras: cepas bacterianas Colorantes: violeta de genciana, azul de metileno, safranina de Gram, safranina para esporas, verde de malaquita, fucsina fenicada de Ziehl, colorante de maneval, rojo congo, colorantes de Fontana y de Leifson Decolorantes: alcohol acetona, alcohol cido. Mordientes: lugol, mordiente de Fontana Solucin salina fisiolgica

Ron de quemar Etanol Mezcla sulfocrmica Mecheros (06) Asas de Koll (06) Lminas portaobjeto (18) Pinzas (04) Rejilla de coloracin (04) Microscopios (08) Xilol y aceite de cedro. Tela Nans

A.

PREPARACIN DE LAMINAS PORTAOBJETO: Lavar las lminas portaobjeto nuevas con una solucin de detergente y una esponja suave. Enjuague varias veces, hasta la eliminacin total del detergente. Secar ligeramente a temperatura ambiente y colocar las lminas en un beacker que contenga mezcla sulfocrmica recin preparada o una solucin de HCl al 10%. Dejar por toda una noche y luego tomar cada lmina con una pinza y lavarla pasndola por una serie de 05 vasos de precipitacin con agua destilada. Dejar secar a temperatura ambiente y guardarlas en un recipiente limpio y entre papel de filtro nuevo. Page 14

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NOTA: en ningn momento tomar las lminas con los dedos de la mano, desde que salen de la mezcla sulfocrmica o la solucin de HCl, siempre manejarlas sujetas por pinzas para lminas. B.

PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO: Desinfectar con alcohol yodado el rea de trabajo. Encender un mechero. En la llama del mismo, flamear el lado del portaobjeto donde se trabajar el frotis y dejar enfriar sin posar los dedos en dicho lado. Tomar el asa de Koll y esterilizarla llevndola al rojo vivo en la flama del mechero, empezando por el extremo distal y luego ascendiendo hacia el mango. Enfriarla y colocar una gota de SSF en el centro del portaobjeto. Volver a flamear el asa de Koll Con la otra mano tomar el vial con la cepa, retirarle el tapn e introducir el asa de Koll para tomar una pequea porcin de crecimiento. Retirar el asa, flamear la boca del vial y colocarle el tapn. La porcin de crecimiento colocarla en el borde de la gota de SSF y disolverla. Una vez disuelta homogenizar con el resto de SSF. Secar a temperatura ambiente o al calor del mechero segn sea el caso. Esterilizar el asa de Koll al terminar. OBSERVACION DE FORMAS BACTERIANAS

C. 1.

Coloracin de Gram Preparar un frotis bacteriano en SSF y fijar al calor del mechero. Colorear con violeta de genciana o cristal violeta por 2-3 minutos. Descartar el exceso de colorante y cubrir con lugol por 3 minutos, luego decantar el exceso de mordiente. Decolorar con alcohol acetona, enjuagar suavemente con agua destilada y contrastar con safranina para Gram o Fucsina diluida por 1 minuto. Decantar el exceso de colorante, enjuagar, secar y observar a objetivo de inmersin. Resultados: Bacterias Gram positivas: cocos o bacilos de color violeta intenso Bacterias Gram negativas: cocos o bacilos de color rojo o rosado 2. Coloracin de Bacilos cido Alcohol Resistentes: Mtodo de Ziehl Neelsen En condiciones aspticas y empleando una mascarilla, tomar con un asa de koll estril, una porcin de una muestra de esputo. Colocar en el centro del portaobjeto y expandir la muestra, realizando circulos desde dentro hacia fuera del centro de la lmina. Fijar la muestra al calor de la llama del mechero y esterilizar el asa de koll. Colocar la lmina sobre una rejilla y cubrir el frotis con el colorante Fucsina Fenicada de Ziehl. Calentar con el mechero hasta la emisin de vapor. Dejar enfriar y repetir este paso por tres veces. Decantar y decolorar con alcohol cido hasta el no desprendimiento de colorante. Enjuagar suavemente. Contrastar con azul de metileno por 1 minuto. Decantar, enjuagar, dejar secar y observar con objetivo de inmersin. Page 15

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[CURSO : BACTERIOLOGIA] Resultados: Bastones delgados de color rojo 3.

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= BAAR (bacilo cido alcohol resistente)

Coloracin de Fontana para espiroquetas: (Sarro dentario) Preparar un frotis de sarro dentario en el centro de una lmina portaobjeto y en una gota de agua de cao. Secar a temperatura ambiente. Cubrir la preparacin con fijador de Fontana por 1-2 minutos; luego lavar con alcohol etlico. Cubrir con mordiente de Fontana y calentar en forma lenta hasta la emisin de vapor. Dejar reposar y enfriar por 30 segundos. Lavar con agua destilada y cubrir con solucin argntica de Fontana por 30 segundos, agregar nueva sol. Argntica y calentar hasta emisin de vapor por 15 segundos. Lavar con agua destilada, secar a temperatura ambiente y observar con objetivo de inmersin. Resultado: Espiroquetas de color marrn intenso

D. 1.

OBSERVACION DE ESTRUCTURAS BACTERIANAS

Observacin de Cpsula por el Mtodo de Maneval: Frente a la llama de un mechero, colocar 1-2 gotas de sol. Rojo de congo al 1% en un extremo de la lmina portaobjeto, en ella suspender el germen y realizar un extendido (tipo frotis sanguneo), con ayuda de un segundo portaobjeto. Secar a temperatura ambiente y cubrir con colorante de Maneval por 1-2 minutos. Decantar el exceso y secar a temperatura ambiente. Observar con objetivo de inmersin. Resultados: Soma bacteriano = color rojo Cpsula = rea incolora alrededor del soma Fondo de lmina = color azul 2. Coloracin de esporas: Mtodo de Wirtz: Preparar un frotis bacteriano en SSF. Fijarlo al calor de la llama del mechero y cubrirlo con solucin acuosa de verde de malaquita. Calentar hasta la emisin de vapor por 3-5 veces. Dejar enfriar y decantar el exceso de colorante. Contrastar con safranina para esporas por 1 minuto. Lavar, secar y observar a inmersin. Resultado: Espora = color verde brillante Soma bacteriano = color rojo 3. Coloracin de Flagelos por el Mtodo de Leifson: (Cepas A y C) Page 16

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Tomar un asa abundante de un cultivo lquido o de una suspensin bacteriana incubada por 30 minutos; y colocarla en un extremo de la lmina portaobjeto. Inclinar la lmina hasta que el lquido se desplace al centro de la lmina. Dejar secar en esta posicin a temperatura ambiente. Cubrir con colorante de Leifson por 15 minutos, enjuagar suavemente con agua destilada y cubrir con azul de metileno por 5-10 minutos. Decantar suavemente el exceso de colorante, secar a temperatura ambiente y observar a inmersin. Soma y flagelos Fondo de lmina = = color rojo grosella azul

Resultado:

Trabajo Prctico: Esquematizar cada una de las observaciones realizadas *-*-*-*-*-*

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[CURSO : BACTERIOLOGIA] PRCTICA N 4

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PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DE MEDIOS DE CULTIVO La nutricin es el proceso por el que los seres vivos toman del medio donde habitan las sustancias qumicas que necesitan para crecer. Dichas sustancias se denominan nutrientes y se requieren para fines energticos y para fines biosintticos. El estudio de la nutricin bacteriana se puede desglosar en varios apartados: as, podemos considerar los tipos de nutrientes requeridos, los aspectos cuantitativos de los mismos, e incluso abordar aspectos ambientales( en cuyo caso entramos en el campo de la Ecofisiologa). Igualmente podemos estudiar la aplicacin prctica de la nutricin bacteriana, que se plasma sobretodo en el diseo y preparacin de medios de cultivo para manejar a las bacterias en el laboratorio. Un medio de cultivo es una solucin acuosa, bien como tal o bien incorporada a un coloide en estado gel, en la que estn presentes todas las sustancias necesarias para el crecimiento de un(as) determinada(s) bacteria(s). Estos medios pueden clasificarse en slidos, semislidos o lquidos de acuerdo a su contenido en gel. Tambin pueden clasificarse en medios definidos, indefinidos o medios mezcla de acuerdo ala naturaleza qumica de sus componentes. O en medios selectivos, diferenciales o de enriquecimiento segn el efecto causante sobre los microorganismos. En la presente prctica el alumno se familiarizar con la composicin de los medios de cultivo de uso muy comn en el laboratorio de microbiologa, adquirir destreza en la tcnica de preparacin y distribucin de medios de cultivo y fundamentar los tipos de medio que se prepararon. MATERIALES:

Agar agar Peptona Extracto de carne Extracto de levadura Cloruro de sodio Medio LIA o TSI Agar base sangre Agua destilada NaOH y HCl 0,1N

Tubos 15x125mm (16) Tubos 13x100mm (16) Placas de Petri estriles (12) Matraces (08) Balones(04) Baguetas (04) Probetas (04) Pipetas 10, 5 y 1ml (04 de c/u) Mecheros (04)

Balanza (02) Esptula (04) Pizeta (04) Franela Cinta de pH Papel kraff Pabilo Algodn Marcador de vidrio

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO:

Los ingredientes de un medio de cultivo debern ser medidos o pesados en forma exacta, en recipientes limpios y adecuados. Teniendo cuidado de utilizar esptulas perfectamente limpias. Siempre comenzar pesando los ingredientes menos higroscpicos. El volumen de agua o diluyente a emplear, agregarlo en dos partes: primero agregar la mitad para disolver los ingredientes (ayudndose con una bagueta de vidrio). Luego agregar el resto. nicamente emplear agua destilada o desmineralizada. Si el medio contiene agar, calentar en bao mara, vapor de agua o sobre una rejilla de asbesto; hasta su total disolucin (ausencia de grnulos de agar en las paredes del recipiente). Debe Page 19

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evitarse la formacin de espuma que conduzca a un derrame de medio de cultivo. Dejar enfriar y comprobar el pH final retirando con la bagueta, una pequea cantidad de medio y colocndolo en una cinta de pH. De ser necesario corregir dicho pH, utilizando NaOH o HCl 0,1N segn sea el caso. Los medios de cultivo lquidos cuya formulacin est completa; es decir, que no requieren de otros aditivos. Dispensarlos en tubos de ensayo limpios, taponarlos y prepararlos para esterilizacin. Realizar lo mismo para medios slidos a ser contenidos en tubos de ensayo o viales de antibiticos. Los medios de cultivo slidos a ser empleados en placas de Petri y aquellos lquidos que requieren aditivos, llevar a esterilizacin en el matraz o baln en que fueron preparados, colocndoles tapn de algodn y cubierta de papel kraff. En todo material a esterilizar indicar: medio de cultivo, cantidad contenida, fecha de preparacin. Esterilizar en autoclave: 121 C, 15 lb de presin por 15 minutos. Salvo aquellos medios cuya especificacin indica lo contrario u otro mtodo de esterilizacin. Los medios dispensados en tubos, debern ingresar al autoclave dentro de recipientes metlicos forrados, cubiertos con papel kraff y rotulados. Enfriar los medios ya estriles a 45 o 50 C. Aquellos medios que requieran aditivos, agregar los mismos, en condiciones aspticas. Servir o dispensar en tubos de ensayo o placas Petri segn la necesidad. Observando siempre las reglas de asepsia. Seguir el siguiente cuadro de volmenes a colocar en los recipientes finales: Placas de Petri de 12x100mm = 20ml por placa Placas de Petri de 10x100mm = 15ml por placa Placas de Petri de 10x70mm = 10ml por placa Tubos de 13x100mm = 5ml por tubo de medio lquido o semislido Tubos de 13x100mm = 3,5 a 4ml por tubo de medio slido. Tubos de 15x125mm = 10 a 15ml por tubo. Dejar enfriar y/o solidificar. Los tubos con medio slido dejar enfriar en forma perpendicular o con una ligera inclinacin para aquellos que se requieren con superficie inclinada. Una vez solidificados, guardar en recipientes. Las placas de Petri conteniendo medio de cultivo guardarlas en posicin invertida y forradas con papel kraff. Todo bien rotulado; indicando: medio de cultivo contenido, cantidad de placas o tubos y fecha de preparacin. Conservar en refrigeracin hasta su uso.

NOTA: Algunos medios de cultivo, la industria los provee con todos sus componentes, nicamente para hidratar. En este caso, siempre leer bien las especificaciones manufactureras y proceder segn las mismas.

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[CURSO : BACTERIOLOGIA] COMPOSICION DE LOS MEDIOS A PREPARAR: A)Agua Peptonada Peptona 1g NaCl 0,5g Agua dest. 100ml pH final= 7,1 +- 0,1 B)Caldo Nutritivo Peptona 0,5g NaCl 0,5g Ext.carne 0,3g Agua dest. 100ml pH final =7,0 +- 0,2

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C Agar nutritivo Peptona 0,5g NaCl 0,5g Ext.carne 0,3g Agar 1,5g Agua dest. 100ml pH final = 7,0 +- 0,2

D) )Medio Movilidad Peptona 1g Ext.levadura 0,3g NaCl 0,5g Agar 0,3g Agua dest. 100ml pH final = 6,5 +- 0,2

H) Agar Chocolate TSA Sangre desf.de conejo

E) Medio LIA F) Agar sangre TSA (*) 90ml Pept.de carne 0,5g Ext.levadura 0,3g Sangre desfibrinada. de conejo L-lisina-HCl 1,0g 10ml Tiosulfato Na 0,004g Adicionar en condiciones Citrato Amonio aspticas la sangre de conejo, al Y Hierro(III) 0,005 agar previamente esterilizado y Purpura de enfriado a 50 C. Homogenizar bromocresol0,002g y vertir en tubos y/o placas Agar agar 1,5g estriles pH final = 6,70,1 I)Agar Lecitina de huevo Agar nutritivo 90ml 90ml Emulsin yema de huevo 10ml 10ml La emulsin de yema de huevo prepararla al 50% en SSF y adicionar en forma estril. Para ello, limpiar y desinfectar el cascarn del huevo, partirlo y verter la yema en un beacker que contenga SSF estril Emulsionar con una bagueta estril. Servir en placas de Petri estriles

Adicionar en condiciones aspticas la sangre de conejo, al agar previamente esterilizado y enfriado a 50 C Homogenizar y someter a calor suave de menos de 80C, hasta obtener un color chocolate. Enfriar y vertir en tubos y/o placas estriles.

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TRANSFERENCIAS ASPTICAS DE BACTERIAS En los diferentes hbitats, las bacterias se encuentran formando comunidades de diferentes especies, entre las cuales, adems de las especies bacterianas tambin se encuentran especies de otros organismos como mohos y levaduras. Es debido a esto que para el estudio a nivel del laboratorio de las diversas especies de bacterias se hace necesario el empleo de una serie de mtodos y tcnicas de cultivo, que permitan su aislamiento, purificacin, propagacin e identificacin en gneros y/o especies segn sea el caso. En la presente prctica se familiarizar al estudiante con los mtodos de siembra de mayor uso en un laboratorio de Bacteriologa, promovindose el aprendizaje y perfeccionamiento en el desarrollo de las mismas. Dichas tcnicas sern empleadas con frecuencia en el transcurso de las siguientes prcticas del curso. MATERIALES

Cepas bacterianas Medios de cultivo Reguladores de pH Cinta de pH Agua destilada Probetas (04) Esptulas (04)

Tubos de ensayo (16) Placas de Petri estriles Pipetas serolgicas (08) Matraces y balones (08) Baguetas (04) Gradillas (04) Asa de Koll (04)

(16)

Aguja de Koll (04) Alcohol yodado Algodn Balanza (02) Ron Plumn marcador Franela

MEDIOS DE CULTIVO EN TUBOS DE ENSAYO a. Siembra en Medios lquidos (por suspensin): Materiales: Tubos de 13x100mm estriles con caldo nutritivo o agua peptonada. Asa de Kolle Mechero Cepa a sembrar Procedimiento: Esterilizar el asa de inoculacin con la llama del mechero. Enfriar En forma asptica tomar una gota de la muestra, luego retirar el tapn de algodn del tubo a inocular, introducir la muestra en el tubo con caldo de cultivo estril, hasta de profundidad, agitar ligeramente el asa dentro del medio lquido. Retirar el asa de inoculacin, esterilizar la boca del tubo y colocar el tapn de algodn. Esterilizar el asa de inoculacin. Rotular en el tubo la muestra inoculada. Llevar a incubar. Nota: Si la muestra es una cepa desarrollada en agar nutritivo proceder de la siguiente manera: si est en un tubo tomar con el asa de Koll una pequea porcin y si est en placa tomar una

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de las colonias. Disolver la muestra tomada en las paredes del tubo, baando continuamente las paredes del mismo con el caldo de cultivo. b. Siembra en Medios Semislidos ( por picadura profunda): Materiales: Tubos 13x100mm con agar nutritivo o medio movilidad. Muestra a inocular Aguja de Koll Mechero Procedimiento: Esterilizar y luego enfriar la aguja de Koll. En forma asptica obtener una pequea cantidad de la muestra en el extremo final de la aguja. Aspticamente retirar el tapn de un tubo con medio de cultivo e introducir la aguja de Koll en la parte media y en posicin vertical, hasta partes de profundidad del medio de cultivo. Retirar el aguja de inoculacin por el mismo lugar de ingreso. Esterilizar la boca del tubo de cultivo y colocarle el tapn de algodn. Esterilizar el aguja de inoculacin. Rotular en el tubo sembrado e incubar. Nota: Siembra utilizada para determinar movilidad de un germen o utilizacin anaerbica de nutrientes en medios diferenciales. c. Siembra en Medios slidos (por estra en superficie): Materiales: Tubos de 13x100mm con agar nutritivo inclinado y estril Muestra a inocular Asa de Koll Mechero Procedimiento: Esterilizar y enfriar el asa de Koll. Aspticamente obtener una porcin de la muestra a inocular. Retirar el tapn de algodn del tubo con medio de cultivo, introducir el asa con la muestra hasta el fondo de la superficie inclinada y depositarla all. Partiendo del fondo, avanzar por la superficie inclinada formando estras en forma de zigzag. Retirar el asa de inoculacin, flamear la boca del tubo y colocar el tapn de algodn. Esterilizar el asa de inoculacin. Rotular en el tubo inoculado la muestra y la fecha. Llevar a incubacin. Nota: tcnica empleada para la obtencin de una mayor cantidad de cepa o para preservarla. d. Siembra en Medios slidos inclinados en Pico de Flauta: Materiales: Tubos de 13x100mm con medio de cultivo slido inclinado en pico de flauta. Muestra a inocular Aguja de Koll SILVIA LILIANA ARA ROJAS Page 23

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Mechero Procedimiento: En forma asptica tomar una porcin de la muestra en el extremo final de la aguja de Koll. Retirar el tapn del tubo a inocular e introducir la aguja de Koll ,en su parte central y hasta aproximadamente un 1/2cm del fondo del tubo. Retirar la aguja por el mismo lugar de ingreso y luego estriar en la superficie inclinada. Flamear la boca del tubo y colocarle el tapn de algodn. Esterilizar la aguja de Koll. Rotular el tubo inoculado con la muestra y fecha de inoculacin. Llevar a incubacin. Nota: Mtodo de siembra empleado en la determinacin de fermentacin de azcares por enterobacterias (medios TSI, KIA y LIA). MEDIOS DE CULTIVO EN PLACAS DE PETRI a. Siembra por Estra: Materiales: Placas de Petri con medios de cultivo estril Muestra a inocular Asa de Koll Mechero Procedimiento: En esterilidad, verificar que la superficie del medios est seca. Con asepsia tomar con el asa de Koll una pequea porcin de muestra, si est en forma slida, o una gota de muestra si est en forma lquida. Tomar en una mano la placa a inocular, descubrir parcialmente y depositar la muestra en una seccin del medio de cultivo. Estriar, llevando de un extremo a otro y en zigzag con el asa de inoculacin la muestra depositada. Cubrir de esta forma un cuadrante de la superficie. Por ser el primer cuadrante estriar en forma ajustada y continua. Retirar el asa, cerrar la placa y girarla en la mano 45. Volver a abrir parcialmente y estriar en este segundo cuadrante en forma ligeramente ms espaciada que en el anterior. Cubrir la placa, girarla y volver a estriar. Repetir hasta completar los cuatro cuadrantes. Tapar la placa. Esterilizar el asa de inoculacin. Rotular la placa con muestra y fecha. Llevar a incubacin en posicin invertida. Nota: tcnica empleada para el aislamiento de colonias bacterianas a partir de una mezcla heterognea. Puede tambin estriarse dividiendo la superficie del medio en 3, 2 o 1 cuadrante; lo importante es agotar por estra la muestra inoculada y lograr colonias aisladas. b. Siembra por Diseminacin Materiales: Placas de Petri con medio de cultivo (estril) Muestra a inocular en medio lquido o en dilucin Asa de Drigalski estril SILVIA LILIANA ARA ROJAS Page 24

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Pipeta de 1ml (1/10) estril .Mechero Procedimiento: Verificar que la superficie del medio de cultivo est bien seca. En asepsia, tomar con la pipeta 0,1ml de la muestra o dilucin de la misma a trabajar y depositarla en el centro del medio de cultivo. Con el asa de Drigalsky, extender la muestra por toda la superficie del medio; Para ello, ir rotando la placa y desplazar el asa por toda la superficie del medio. Tapar la placa. Colocar a desinfectar el asa utilizada, en una solucin de leja o en mezcla sulfocrmica. Rotular en la placa, muestra y fecha. Llevar a secar la superficie inoculada, en una estufa regulada a 37C por 20 a 30 minutos. Tapar y dejar incubar en posicin invertida. Nota: tcnica empleada para el aislamiento de colonias de muestras lquidas y para el recuento de colonias. As como tambin para la obtencin de un mayor inculo. c. Siembra por Incorporacin: Materiales: Placas de Petri de 10x100mm estriles Mechero Matrz con 15ml de Agar para recuento estril , enfriado y mantenido a 50 C Muestra lquida a inocular o dilucin de la misma Pipeta de 1 ml estril Procedimiento: Aspticamente tomar 1 ml de la muestra o dilucin a trabajar y depositarla en el centro de la placa de Petri . Incorporar el contenido del matrz a la placa de Petri. Taparla y mezclar los aditivos con movimientos suaves hacia delante y atrs, derecha e izquierda en una superficie plana. Dejar gelificar y llevar a incubacin en posicin invertida. Nota: una variacin de esta tcnica, consiste en adicionar 1 ml de la muestra al matrz con medio de cultivo, homogenizar y verter en la placa de Petri. Est tcnica se emplea para el recuento de bacterias de una muestra. d. Siembra por Puntura Muestra: Placa de Petri con medio de cultivo Muestra a inocular Aguja de Koll Mechero Procedimiento: Aspticamente verificar que la superficie del medio est seca. Con el extremo de la aguja de Koll tomar una pequea porcin de muestra e inocularla en el medio de cultivo, formando un pequeo punto sin introducir a la aguja en el medio de cultivo. Tapar la placa. Esterilizar la aguja de Koll. Rotular la placa con muestra y fecha. Llevar a incubacin en posicin invertida SILVIA LILIANA ARA ROJAS Page 25

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Nota: por este mtodo pueden inocularse en una sola placa varias muestras, de preferencia consistentes en cepas o colonias aislada, para visualizar alguna reaccin bioqumica sobre el medio de cultivo. Cada vez que se cambia de cepa, esterilizar la aguja de inoculacin antes de tomar la muestra. CUALIFICACIN DE RESULTADOS TCNICA CUALIFICACIN COMENTARIO

Criterios de cualificacin: A tcnica bien desarrollada con crecimiento ptimo y adecuado B tcnica bien desarrollada, pero falla en la distribucin del crecimiento C tcnica desarrollada con algunos errores pero buen crecimiento y adecuado D tcnica mal desarrollada pero con crecimiento rescatable E tcnica mal desarrollada, ausencia de crecimiento *-*-*-*-*-*

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[CURSO : BACTERIOLOGIA] PRCTICA N 6

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TCNICAS MOLECULARES CON ADN BACTERIANO: EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN DE ADN BACTERIANO La extraccin de ADN es una de los primeros pasos en los procedimientos biotecnolgicos y requiere una serie de etapas bsicas. En primer lugar tienen que romperse la pared celular y la membrana plasmtica para poder acceder al ncleo de la clula. A continuacin debe romperse tambin la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por ltimo hay que proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol. El material que se necesita es fcil de encontrar y el procedimiento es sencillo Los jabones utilizados como lavavajillas emulsionan los lpidos de las membranas celulares y las rompen. La sal evita la unin de las protenas al ADN. Para aislar el ADN hay que hacer que precipite en alcohol. El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua. Adems de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solucin acuosa. MATERIALES Cultivo en fase logartmica de una bacteria Gram negativa Agarosa Buffer TAE 1x Microtubos de centrfuga estriles Micropipetas de 1000, 200 y 5 l Microcentrfuga Balanza Bao de agua termostatizado Extraccin de ADN 1. 2. Concentrar las clulas (max. 2x109cel) en una microcentrfuga a 7 500 rpm por 10 minutos. Descartar el sobrenadante Resuspender las clulas en 180 l de buffer ATL. Adicionar 20 l de proteinasa K, mezclar en un vortex e incubar a 55C hasta que observe que todas las clulas han lisado (solucin transparente- 1 a 3 h). Opcionalmente , luego de la incubacin se puede agregar 4 l de RNAsa (100mg/ml), mezclar por voretx e incubar a temperatura ambiente por 2 minutos Colocar en vortex por 15 segundos. Adicionar 200 l de buffer AL, mezclar en vortex e incubar a 70C pot 10 minutos Adicionar 200 l de etanol (96-100%) y mezclar fuertemente en el vortex Transfiera la mezcla del paso anterior a una minicolumna provista por el kid. Centrifugar a 8 000 rpm por 1 minutos. Descartar lo colectado en el tubo de coleccin de la minicolumna Page 27

Luna de reloj Matraz de 500 mL Probeta Bandejas de plstico oscuro y con tapa Vortex Kid de extraccin de Qiagen Guantes quirrgicos Hipoclorito de sodio al 10%

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Adicione 500 l de buffer AW1, centrifugue a 8 000 rpm por un minuto y descartar los colectado Adicionar 500 l de buffer AW2, centrifugar a 14 000 por 3 minutos para secar la membrana de la minicolumna. Descartar lo colectado Colocar la minicolumna en un microtubo limpio y agregue 200 l de buffer AE. Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto y luego centrifugue 1 minuto a 8 000 rpm. Lo colectado en esta oportunidad contiene el ADN bacteriano Conservar la muestra a -20C

Electroforesis en gel de Agarosa 1. 2. Descongelar la muestra (s) de ADN obtenidas en la etapa anterior de manera espontnea Preparar un gel de agarosa al 1,2% en solucin amortiguadora de Tris cido Actico EDTA (TAE). Tener la precaucin de preparar el gel en un matraz cuya capacidad sea el triple o ms del volumen a preparar. Disolver en calor hasta la total transparencia y homogeneidad del gel Preparar la base de la cmara de electroforesis limpindola con etanol y nans y cubriendo los extremos abiertos con cinta Masking tape. Durante esta etapa usar guantes para evitar contaminacin con DNA forneo. Colocarle la peinilla Enfriar la agarosa a 45C y verterla en la base, cuidando de que no se formen burbujas. Dejar gelificar en una superficie recta Una ves gelificada la agarosa, retirar el Masking tape y colocar la base en la cmara de electroforesis Verter TAE en los compartimentos de la cmara hasta que este cubra la superficie del gel de agarosa Con cuidado retirar la peinilla. Evite la ruptura de las fositas En una luna de reloj muy limpia preparar las muestras de ADN y del patrn de peso molcular (DNA cortado con la enzima HindIII) de la siguiente manera 9. 10. 11. Colocar 3 l de Loading Dye 6x Agregar 8 l de DNA Mezclar y cargar en la micropipeta dicha mezcla

3.

4. 5. 6. 7. 8.

Llenar una de las fositas con la mezcla contenida en la micropipeta. No formar burbujas de aire y descargar suavemente y sin entrar en la fosita pero dentro del TAE que la cubre Preparar de igual modo el patrn de peso molecular. Usar 1 l de Loading Dye y 1 l de marcador. Realizar el corrido electrofortico a 100 mvolt por 30 min. Terminada la electroforesis, apagar el equipo, dejar enfriar el gel y proceder a sacarlo Page 27

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Pasarlo a una fuente que contenga una solucin de bromuro de etidio (0.5 g/ml) por 30 minutos, enjuagar pasando a una fuente con agua destilada y llevarlo a un transiluminador de radiacin UV para visualizar las bandas y confirmar la extraccin Esquematizar el resultado obtenido (de ser posible generar una foto)

13.

Cuantificacin 1. 2. Preparar un gel de agarosa al 1.5% (disuelta en TAE) y verterla en la base de la cmara de electroforesis, usando una peinilla de 8 dientes Colocar el gel en la cmara y cubrir con TAE 1x. Retirar la peinilla y cargar las muestras de ADN ya mezcladas con loading dye a. Preparar 3 soluciones del patrn de peso molecular a cargar en 3 fositas diferentes. Usar 1, 2 y 3 l b. Preparar las muestras de ADN usando un volumen acorde con la intensidad de banda obtenida en la etapa anterior Correr la electroforesis a 75 mv por 1 hora. Retirar el gel y teir en solucin de bromuro de etidio por 30 minutos y enjuagar Observar el DNA colocando el gel bajo luz UV. Captar la imagen fotogrficamente y en una impresin de la misma y por comparacin con la migracin del patrn, establecer la concentracin de las muestras de la siguiente manera a. Establecer la cantidad de ADN presente en cada banda del marcador de peso molecular b. Por comparacin visual, establecer la banda del marcador que tenga una misma intensidad de fluorescencia que la muestra c. Determinar la cantidad de ADN presente en cada muestra de ADN trabajada Reportar los resultados obtenidos en ng/L

3. 4.

5.

Determinacin del tamao 1. 2. 3. 4. 5. 6. Usar la fotografa obtenida anteriormente y trabajar con las bandas que corresponden a 1 L de Marcador de PM Calcular y tabular los datos en la tabla adjunta: Graficar el Log del peso molecular vs la distancia de migracin electrofortica de cada una de las bandas del marcador Establecer el valor en el eje de las abscisas que corresponda a la distancia de migracin de la muestra problema Con el dato obtenido, establecer el tamao de la muestra de ADN en pares de bases determinando la inversa del logaritmo Reportar el resultado (incluir la grfica generada)

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[CURSO : BACTERIOLOGIA] RESULTADOS A) Electroforesis

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B) Cuantificacin

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[CURSO : BACTERIOLOGIA] C) Tamao Elemento BANDA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Distancia migrada (mm)

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Peso molecular

Log PM

MARCADOR MOLECULAR

MUESTRA 1 MUESTRA 2 MUESTRA 3

TAMAO: _______________________

PRECUACIONES El bromuro de etidio es cancergeno y agente de mutacin, evitar en todo momento el contacto con la piel. USAR GUANTES Asimismo, este compuesto es sensible a la luz visible por lo que hay que evitar su exposicin a la misma cuando se desea observar su fluorescencia en luz UV. EVITAR LA INCIDENCIA DE LUZ VISIBLE EN LOS GELES TEIDOS CON BROMURO DE ETIDIO Todo material o gel que haya tenido contacto con el bromuro de etidio, antes de ser descartado o lavado, deber de inactivarse sumergindolo y dejndolo por unos minutos en solucin de hipoclorito de sodio al 10% Los geles que salen del hipoclorito, envolverlos en papel platino, y colocarlos en una bolsa antes de su descarte. MARCAR COMO TXICO La luz UV tambin es agente mutagnico, por ello usar lentes protectores cada vez que se use esta luz. USAR GAFAS DE PROTECCIN CON LA LUZ UV SILVIA LILIANA ARA ROJAS Page 30

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Realizar todo el proceso de manera asptica en referencia a contaminacin con ADN forneo

ANEXOS TAE (50X) 242 g Tris base 57.1 mL cido actico glacial 100 mL EDTA 0.5M (pH 8,0) DNA CORTADO CON HindIII (500 ng/L) Banda N 1 2 3 4 5 6 7 8 Tamao: PM (pb) 23 130 9 416 6 557 4 361 2 322 2 027 564 125 48 502 pb

Loading Dye 6X PROMEGA 4% Anaranjado G [~ 50pb] 0.03% Azul de bromofenol [~ 300pb] 0.03% Cianol FF de xileno [~ 4kb] 15% Ficoll 400 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) 50 mM EDTA (pH 8.0)

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[CURSO : BACTERIOLOGIA] PRCTICA N7 DETECCIN DE MUTANTES

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Determinados agentes ambientales fsicos o qumicos pueden daar el ADN o interferir con la maquinaria replicativa, de modo que provocan una mayor frecuencia de aparicin de mutaciones (en este sentido hablamos de "mutaciones inducidas"). A dichos agentes se les llama mutgenos o agentes mutagnicos. As, en ltima instancia, los mutgenos causan alguna alteracin en el ADN que o bien no puede ser reparada convenientemente, o bien es un dao tan extenso que sobrepasa la capacidad de los mecanismos celulares normales de reparacin Una de las tcnicas para detectar mutantes, es el mtodo de la replica o estampado en placa. El cual es utilizado principalmente para mutantes de tipo nutricional. En la presente prctica, emplearemos un cultivo bacteriano silvestre previamente expuesto a un agente mutgeno, la radiacin ultravioleta (UV) y luego mediante este mtodo determinaremos tiene o no mutaciones. MATERIALES Cultivo en fase log de Escherichia coli Cilindro de madera de 9,0 cm de dimetro y 12 cm de altura. Estril Rectngulos de tela de gamuza de 15 x 15 cm, estriles Un sujetador o tira elstica de 30 cm de longitud Pinzas Placas de Petri de 15x120 mm, estriles Lmpara de UV (260 nm) Tres pliegos de papel lustre color negro Medios de cultivo: Agar sangre, Medio EMB, Medio Minimal, Medio completo (HNB) y medio ENB con estreptomicina. PROCEDIMIENTO 1. 2. Prepare una placa de Petri de 15x120 mm con medio cada uno de los medios de cultivo indicados En la placa con medio completo (HNB), siembre por puntura un cultivo de E. coli, en un total de 10 puntos y expongala a rayos UV de 260 nm de longitud de onda por 15 minutos. Tapar y envolver en papel lustre dejando el lado de color negro hacia adentro. Llevar a incubar a 37C por 24 horas. Al da siguiente, en condiciones aspticas y con ayuda de una pinza, cubrir el cilindro de madera con una tela de gamuza, colocando el lado velloso hacia el exterior. Sujetar la tela al cilindro por medio de la tira elstica o sujetador (ver esquema). Marcar con nmeros cada colonia desarrollada en la placa irradiada. y en el borde de la placa marcar una lnea vertical y una flecha de direccin de lectura. Aspticamente, descubrir la placa irradiada, invertirla y colocarla sobre el cilindro, teniendo la precaucin de poner en contacto el crecimiento bacteriano con la tela (estampado). Retirar y tapar.

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4.

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Terciopelo Sujetador

Cilindro de madera

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A cada una de las placas de 10x120 mm preparadas con medios de prueba, marcarlas igual como se hizo con la placa irradiada A continuacin, una por una retirarle la tapa, invertirla y haciendo coincidir las marcas efectuadas con las del estampado, poner en contacto la superficie del medio de cultivo que se impregn en la tela. Presionar levemente, retirar, tapar la placa y envolverla en papel lustre. Llevar a incubacin, las placas estampadas, a 37C por 24 horas, Realice la determinacin de mutantes, colonia a colonia, de la siguiente manera: Agar sangre: colonias hemolticas mutantes enzimticos Medio EMB: colonias incoloras o rosadas = mutantes metablicas Medio Minimal: Ausencia de crecimiento en este medio, y crecimiento en medio completo = mutante auxotrofo Medio ENB con estreptomicina: crecimiento de colonias = mutante resistente al antibitico de prueba.

11. Informe los resultados en la siguiente tabla:

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[CURSO : BACTERIOLOGIA] RESULTADOS: MEDIO DE N DE CULTIVO MUTANTES TIPO DE MUTANTE

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CARACTERIZACIN

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[CURSO : BACTERIOLOGIA] PRCTICA N 8

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CULTIVO DE BACTERIAS AEROBIAS Y ANAEROBIAS Los gases principales que afectan al desarrollo microbiano son el oxgeno y el dixido de carbono. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al oxgeno libre clasificndose en cinco grupos: Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de oxgeno libre. Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de oxgeno libre. Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia como en ausencia de oxgeno libre. Aerotolerantes: son microorganismos que pueden tolerar o soportar el oxgeno y crecer en su presencia an cuando no lo utilizan. Microaerfilas: bacterias que crecen en presencia de pequeas cantidades de oxgeno libre. La respuesta de un organismo al O2 depende de la presencia de varias enzimas que reaccionan con l y con varios radicales generados por las celulas. Po ejemplo, la oxidacin de las flavoprotenas d origen a la formacin de H2 O2 como el producto mayoritario y pequeas cantidades del radical superxido que es an ms txico. Por lo tanto, todos los organismos que pueden vivir en presencia del O2 (ya sea que lo utilicen o no), contienen superoxido dismutasa.Adems la mayora de estos organismos contienen la enzima catalasa capaz de descomponer el perxido. Los anaerobios obligados han perdido la superoxido dismutasa y catalasa y/o peroxidasa por lo que la presencia del oxigeno es letal.

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Los microorganismos aerobios estrictos respiran usando al oxigeno como aceptor final de electrones en su cadena respiratoria; los anaerobios facultativos pueden obtener su energa tanto por procesos respiratorios como fermentativos, es decir, pueden tener como aceptores finales de electrones al oxgeno o compuestos orgnicos. Los microorganismos microaeroflicos requieren oxgeno pero a tensiones menores del 15%. MATERIALES: Muestra de 10 g de suelo de jardn. 4 Tubos de 22 x 175 mm, c/u con 20 mL Mechero Bunsen. de agar Infusin de Cerebro Corazn Cerillos encendedor. Agar Anaerbico. (Apndice A) Bao de agua a temperatura controlada, 4 Cajas Petri estriles. a 85 C y a 45 C. Pipetas serolgicas estriles de 1 mL. Balanza. 2 Pipetas Pasteur de 12 cm estriles. Vidrio de reloj estril. Gradilla para tubos de 18 x 150 mm y de Esptulas estriles. 22 x 175 mm. 1 Matraz Erlenmeyer con 99 mL Colorantes y reactivos para tincin de exactos de solucin salina estril. Gram. 4 tubos de 18 x 150mm, c/u con 9 mL Jarra de anaerobiosis y sobre generador de SSF estril de H2 y CO2 (GasPak). 2 Tubos de 18 x 150 mm, c/u con 9 mL Indicador de anaerobiosis (GasPak). exactos de medio fluido de Tioglicolato Papel filtro 1 Tubo de 18 x 150 mm con 8 mL de Microscopio. parafina estril. Aceite de inmersin

OBJETIVO Conocer las tcnicas ms comnmente empleadas en el aislamiento de bacterias Aerobias y Anaerobias SILVIA LILIANA ARA ROJAS Page 36

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TECNICA 1. A partir de la muestra de suelo y en condiciones aspticas, pesar 1 g y transferirlo al matraz con solucin salina estril. 2. Transferir 1 mL a un 2 tubos con 9 mL de SSF para obtener una dilucin 1/10 000. Sembrar esta dilucin por diseminacin en 02 placas Petri con TSA. Una de las placas incubar a 37C y en aerobiosis; la otra placa, incubarla a igual temperatura pero en una Jarra de anaerobiosis. Marcar ambas placas como sin calentar 3. Calentar la mezcla del matraz en bao de agua a 85 C durante 10 minutos con objeto de eliminar las formas vegetativas. 4. A partir del matraz calentado, preparar dos diluciones decimales usando los otros 2 tubos con solucin salina estril y homogeneizar. 5. Inocular por diseminacin y por duplicado 02 placas Petri con TSA cada una de las diluciones. Marcar las placas como con claentamiento 6. Incubar en aerobiosis una placa de cada dilucin y la otra colocarla en forma invertida n en la jarra de anaerobiosis, abrir el sobre generador de Hidrgeno y Dixido de Carbono, colocarlo en el interior de la jarra y agregarle el agua de acuerdo con las instrucciones del fabricante; colocar la tapa con el catalizador, cerrarla perfectamente e incubar a 28 C durante 24-48 horas. 7. Contar el nmero de UFC/mL de cada muestra. Reportar los resultados en la siguiente tabla.

Tratamiento Sin calentamiento Con calentamiento

Placa 1 2 3 4

Incubacin Aerobia Anaerobia Aerobia Anaerobia

UFC/mL

8. Interpretar sus resultados __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ MEDIO FLUIDO DE TIOGLICOLATO 1. Calentar el medio de cultivo en bao de agua a punto de ebullicin durante 10 minutos, o hasta que el indicador se reduzca (pierda color). 2. Dejar enfriar a temperatura ambiente. 3. Con la pipeta Pasteur estril, tomar una muestra del matraz o de los tubos con las diluciones, introducir la pipeta hasta la zona profunda de los tubos que contienen el medio. 4. Si se usan tubos de 16 x 150 mm, despus de inocular, se agregan 2 mL de parafina estril para formar un sello exactamente en la superficie del medio. SILVIA LILIANA ARA ROJAS Page 37

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5. Incubar a 28 C durante 24-48 horas. PRUEBA DE PUREZA 1. Revisar cuidadosamente las cajas Petri y sealar con lpiz graso o marcador las colonias aisladas. 2. Preparar extensiones a partir de las colonias seleccionadas y teir con tcnica de Gram. 3. Observar al microscopio con objetivo de inmersin y determinar la pureza de las colonias, considerando puras a las que muestren un slo tipo de bacteria. 4. Obtener cultivos puros resembrando en tubos conteniendo medio de conservacin a partir de cada colonia pura. 5. Incubar los tubos a 37 C durante 24-48 horas. 6. Despus del perodo de incubacin conservar los cultivos puros en el refrigerador. CUESTIONARIO 1. Describir otra tcnica til en el aislamiento de bacterias anaerobias.

2. Basndose en los resultados obtenidos, indicar Cul de los mtodos empleados fue el ms eficiente?

3. Cul fue el objetivo de calentar los tubos que contenan medio fluido de tioglicolato?

4. Mencionar 5 ejemplos de bacterias anaerobias. a. . b. . c. . d. . e. .

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CUANTIFICACIN DE POBLACIONES BACTERIANAS Una parte de la rutina diaria de un laboratorio de microbiologa est dada por la determinacin del nmero de bacterias que se encuentran presentes en una muestra. Estas determinaciones son de utilidad para conocer la carga microbiana de algunos alimentos y tambin para realizar recuentos comparativos del crecimiento de las bacterias bajo determinadas condiciones. Esto debido a que, el crecimiento de cualquier sistema biolgico es el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicacin celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicacin se traduce en un aumento del tamao del individuo, mientras que en unicelulares lo que ocurre es un aumento de la poblacin. El crecimiento bacteriano puede ser estudiado tanto a escala individual, como a escala poblacional, mediante determinacin del nmero de bacterias presentes en dos o ms tiempos de crecimiento. Existen diferentes mtodos para determinar el nmero de bacterias, que pueden ser clasificados de la siguiente manera: 1. MTODOS DE DETERMINACIN DE MASA BACTERIANA Directos: en estos mtodos se requieren preparaciones limpias, sin partculas extraas. Entre los cuales est la determinacin del peso hmedo, determinacin del peso seco, determinacin del nitrgeno total: por la tcnica de micro-Kjeldahl. Y la determinacin de un componente caracterstico: peptidoglucano, ADN, ARN, protenas, etc. Indirectos: que puede ser por medio de la determinacin del consumo de nutrientes o de la produccin de algn metabolito por unidad de tiempo, o por Mtodos turbidimtricos (pticos) como aquellos que permiten la Medicin de luz transmitida, tales como la Escala de MacFarland, el Espectrofotmetro y el Nefelmetro 2. MTODOS DE DETERMINACIN DEL NMERO DE INDIVIDUOS Mtodos directos: miden el nmero de bacterias totales, entre los cuales estn la Cmara de recuento de Petroff-Hauser, el Recuento en preparaciones teidas, Recuento proporcional de Wright y los Contadores electrnicos de partculas tipo Coulter. Mtodos indirectos: son mtodos que miden el nmero de bacterias viables entre los cuales tenemos, el Mtodo del nmero ms probable, Recuento de viables en placa, Determinacin de la proporcin clulas viables /clulas totales y Recuento sobre filtros de nitrocelulosa. De todos estos mtodos, realizaremos tres de ellos: Espectrofotometra, Nmero Ms Probable (NMP) y Recuento de viables en placa. Con el objetivo de adiestrarlos y familiarizarlos en la ejecuci162n e interpretacin de las tcnicas de recuento de bacterias de mayor uso en un laboratorio de microbiologa A) DETERMINACIN DEL ESPECTROFOTOMETRA NMERO DE BACTERIAS POR

La base comn de los mtodos pticos consiste en la medicin de la cantidad de luz dispersada o transmitida a travs de un cultivo bacteriano. Recordemos aqu que las suspensiones bacterianas SILVIA LILIANA ARA ROJAS Page 39

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dispersan la luz, al igual que cualquier partcula pequea suspendida en agua. La dispersin de la luz es, dentro de ciertos lmites, proporcional a la masa del cultivo. En la espectrofotometra se emplea un espectrofotmetro para realizar la determinacin. Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiologa o Bioqumica. Mide la densidad ptica (D.O.), es decir la absorbancia. D.O. = A = -logT/100 donde T= transmitancia La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamao de la partcula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la tcnica aumenta a longitudes de onda cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana slo es vlida para >107cls/ ml. Entonces se debe realizar una curva estndar para relacionar los valores de absorbancia (A) con la masa bacteriana. MATERIALES: Muestra biolgica Solucin salina Fisiolgica estril Escala de MacFarland Tubos de ensayo de 15 x 125 mm estriles Pipetas de 1 y 10 ml estriles Espectrofotmetro PROCEDIMIENTO: 1. En el espectrofotmetro establezca la absorbancia a 660 nm de longitud de onda, de cada uno de los tubos de la escala de MacFarland. Con estos datos, teniendo en cuenta las concentraciones celulares correspondientes a cada tubo y mediante el uso de un papel milimetrado semilogartmico o un software de EXCELL, establezca una curva patrn de nmero de bacterias con relacin a la absorbancia. Equivalencia del tubo del Nefelmetro de Mac Farland con el nmero de bacterias y la absorbancia. Tubo N 1 2 3 Nmero de bacterias por ml 3 x 108 6 x 108 9 x 108 Absorbancia (660 nm)

2.

Prepare diluciones seriadas de la muestra biolgica en SSF. Para ello, utilice los tubos de 15x125mm y las pipetas estriles. Realice las siguientes diluciones: 10-1, 10-2,10-3,10-4,y 10-5.

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Establezca la absorbancia de las diluciones y a travs de la curva patrn determine el nmero de bacterias presentes en cada dilucin y teniendo en cuenta el factor de dilucin del tubo trabajado, establezca el nmero de bacterias por mililitro. Promediando estos datos, determine el nmero de bacterias presente en la muestra DILUCIN 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 N BACTERIAS NBACT./ml

. RESULTADO: NOTA: anexe el resultado obtenido en papel milimetrado o en EXCELL (curva patrn establecida). DETERMINACIN DEL NMERO DE BACTERIAS POR EL NMERO MS PROBABLE Para este mtodo, su fundamento estriba en la distribucin de Poisson: una distribucin aleatoria de partculas en una serie de muestras iguales, en funcin del nmero medio de partculas presentes en una suspensin. PX = mX e-m/x! Donde: x = nmero real de partculas en cada muestra m = concentracin (no partculas /volumen) La tcnica consiste en sembrar alcuotas de la suspensin original problema sobre un medio lquido o slido adecuado; tras el tiempo de incubacin adecuado se anota la proporcin obtenida de muestras donde no se haya dado crecimiento, P0 (x = 0). Entonces, segn la distribucin de Poisson: P0= e--m y por lo tanto es fcil calcular el valor de m: m = -lnP0 Sobre la base de este tipo de distribucin, este mtodo ya tiene establecidos valores de lectura (nmero de bacterias) segn el nmero de tubos con reaccin que se pueden ser obtenidos, tal como se muestra en la tabla del ANEXO de esta prctica. MATERIALES: Muestra biolgica en solucin Tres Tubos de ensayo con Caldo Brila 2X (10 ml en c/u) y campanas Durham Seis tubos de ensayo con caldo Brila 1X (10 ml en c/u) y campanas Durham SILVIA LILIANA ARA ROJAS Page 41 B)

[CURSO : BACTERIOLOGIA] Pipetas de 10,1 y 0,1 ml estriles Mecheros de alcohol Gradillas

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PROCEDIMIENTO: 1. En forma asptica inocule cada tubo de caldo Brila 2X con 10 ml de la muestra, tres tubos de caldo Brila 1X cada uno con 1 ml de la muestra; y los otros tres cada uno con 0,1ml de la muestra. 2. Marcar cada tubo indicando el volumen de muestra en l colocado. 3. Lleve a incubacin a 37C por 24 horas. Luego de las cuales revisar los tubos en bsqueda de presencia de gas en la campana Durham. Esquematice y anote la formula resultante.

Vol. De muestra: Formula:

10ml

1ml

0,1ml

4. Con la combinacin obtenida, mediante el uso de la tabla del NMP, establezca el nmero de bacterias presentes en la muestra. RESULTADO: C) DETERMINACIN DEL NMERO DE BACTERIAS POR EL MTODO DE RECUENTO DE VIABLES EN PLACA

Esta es una de las tcnicas de recuento ms utilizada en la rutina del laboratorio de Microbiologa. Para su realizacin se recomienda tener en cuenta las siguientes recomendaciones: Para minimizar los errores estadsticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 placas de cada dilucin; pero por motivos de disponibilidad de medios, slo se trabajarn 3 placas por cada dilucin. Hay que usar pipetas nuevas para cada dilucin; Contar Unidades Formadoras de Colonias (UFC) slo en aquellas placas donde existan entre 50 y 300 colonias. Esta tcnica, como su nombre indica, permite determinar el nmero de bacterias viables presentes en una muestra. Siendo de los tres mtodos que utilizaremos, el de mayor exactitud.

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[CURSO : BACTERIOLOGIA] MATERIALES: Muestra biolgica en diluciones: 10-2, 10-3y 10-4. Placas de Petri de 10x100 mm estriles Pipetas de 1ml estriles. Matraz con 150ml de Agar Cuenta colonias (PCA) estril. Mecheros de alcohol. Cmara cuenta colonias

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PROCEDIMIENTO: 1. Marcar tres placas de Petri por cada dilucin a procesar. 2. En forma asptica transfiera del tubo con la dilucin 10-4,1 ml a cada placa de Petri. Utilizando una pipeta estril diferente, realice lo mismo con la dilucin 10-3 y 10-2. 3. Disuelva el PCA y enfre a 45C. Vierta en cada una de las placas de Petri un aproximado de 15 ml. Homogenice cada placa que haya servido. 4. Lleve a incubar las placas a 37C por 24 horas. Luego de las cuales, utilizando la cmara cuenta colonias, establezca el nmero de UFC por cada placa. Tenga en cuenta las recomendaciones antes dadas. 5. Establezca del nmero de UFC /ml de muestra de la siguiente manera. Coloque la placa de Petri en la cmara cuenta colonias, con el lpiz puntero cuente las UFC en cinco recuadros de 1cm de lado, promedie estos datos para obtener UFC /cm2. Este ltimo dato multiplquelo por el rea de la placa (r2) y por el factor de dilucin respectivo (inversa de dilucin) para determinar UFC /placa y UFC /ml de muestra respectivamente. Obtenga un dato promedio por cada dilucin y un dato promedio de las tres diluciones, el cual reportar como nmero de unidades formadoras de colonias (bacterias) presentes en la muestra. Todos los datos que ha obtenido, transcribirlos en las tablas siguientes. DILUCIN PLACA A B C A B C A B C UFC/cm2 UFC /placa UFC/ ml de muestra PROMEDIO

10-4

10-5

10-6

RESULTADO: SILVIA LILIANA ARA ROJAS Page 43

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ANEXO

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DETERMINACIN DEL TIEMPO DE GENERACIN DE UNA CEPA BACTERIANA En un tpico proceso batch el nmero de clulas vivas vara con el tiempo. El crecimiento microbiano en estos procesos sigue cuatro fases bien definidas, las cuales son: Fase de Latencia.- Aqu las clulas microbianas tienden a aclimatarse y adaptarse a las condiciones dadas por el medio de cultivo y la temperatura y el pH. No hay incremento de clulas microbianas, durante esta fase las clulas viables del inculo acumulan endoenzimas, coenzimas difusibles e intermediarios esenciales para la sntesis de sustancia celular. Fase de Crecimiento Exponencial.- Este es un periodo de rpido crecimiento, en el cual las clulas crecen exponencialmente con el tiempo, mediante fisin binaria. Durante esta fase se da la sntesis de metabolitos primarios. Fase Estacionaria.- En este punto la poblacin microbiana alcanza su mximo nmero, no hay ni aumento ni disminucin de la biomasa. Esto se debe al agotamiento del nutriente indispensable o porque algn producto fabricado en el medio llega a su nivel inhibidor, cesando el crecimiento exponencial. Es en esta fase en que se acumulan exoenzimas, se sintetizan metabolitos secundarios y se produce la esporulacin y se produce la esporulacin en los gneros formadores de endosporas. Fase de Muerte.- Aqu un decrecimiento exponencial en el nmero de individuos vivientes es a menudo observado. Debido al total agotamiento de los nutrientes y/o a la acumulacin de desechos txicos. Generalmente implica muerte por lisis celular. Cada fase es de potencial importancia en el proceso biolgico. As por ejemplo, la longitud de la fase de latencia depende en gran medida de la composicin del medio de cultivo y su grado de similitud con el medio en el cual se encuentra previamente suspendido el inoculo bacteriano; as como tambin de la edad de las clulas y el tamao del inoculo. Manipulando estos parmetros y los correspondientes a factores ambientales ( condiciones de cultivo) se puede alargar o acortar la duracin de cada fase del crecimiento antes mencionadas. Los parmetros usualmente aplicados para establecer el crecimiento de una poblacin bacteriana son el tiempo de generacin (g) y la constante de crecimiento (). En esta oportunidad slo emplearemos la determinacin del tiempo de generacin para establecer si las condiciones de cultivo fueron o no las adecuadas; as como tambin, mediante espectrofotometra, establecer la cintica de crecimiento de la cepa trabajada.

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[CURSO : BACTERIOLOGIA] MATERIALES Inculo: Cultivo lquido Bacillus subtilis en fase logartmica (60 ml) Medio de Prueba: Caldo Peptona Almidn pH 6,9 (2 litros) Solucin salina fisiolgica estril (50 ml) Kitasato con solucin saturada de NaCl estril (purificador de aire) Bioreactor de 4 litros de capacidad Tubos de ensayo de 13 x 100 mm estriles Tubos de 15x125 mm estriles Pipetas de 1 y 10 ml estriles. Lminas de Petrifilm para recuento de aerobios

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Mecheros Agitador Compresor (uno de acuario); pHmetro, termmetro; Termostato Espectrofotmetro calibrado para N de clulas x 108 Equipo de Venoclisis e hipodrmica de 10 ml para extraccin de muestras. Gradilla Cmara cuentacolonias Estufa regulada a 37C

PROCEDIMIENTO 1. Preparar el medio de cultivo, colocarlo en el bioreactor y esterilizar en autoclave. 2. Instalar los equipos y termmetro de acuerdo al siguiente esquema: Flujo de aire

Agitador Termmetro

Bao de recirculacin termosttico Purificador del aire Serpentn Difusor Biorreactor

Compresor

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3. Colocar una tira de venoclisis para extraccin de muestras: uno de sus extremos dentro del bioreactor y el otro fuera de l conectado a una hipodrmica. 4. Encender los equipos estableciendo una buena aireacin, agitacin de 350 rpm y flujo de agua por el serpentn para lograr una temperatura de 37C 0.5. 5. Una vez alcanzada la temperatura de prueba, extraer una muestra de 5 ml del medio que corresponder al blanco o control. 6. Incorporar el inculo, dejar mezclar e iniciar el conteo del tiempo de prueba que ser de aproximadamente 6 horas. En el tiempo cero (0) y al finalizar (4 horas despus) extraer una muestra de 5 ml del cultivo y establecer pH, concentracin celular por espectrofotometra a 450 nm y temperatura de dicha muestra. Anotar los datos obtenidos. 7. Para determinar el tiempo de generacin, trabajar con 1 ml de los tubos correspondientes al tiempo cero y final (tubo cuya concentracin celular indica ausencia de crecimiento) para establecer UFC / ml en cada uno de ellos empleando Petrifilms. A la muestra correspondiente al tiempo final, previamente realizarle diluciones en SSF estril para inocular en Petrifiml 1 ml de las diluciones 10-5 y 10-6. 8. Incubar los Petrifilm a 37C por 24 a 48 horas y realizar el recuento de clulas viables. Con estos datos establecer el tiempo de generacin mediante la siguiente formula:

g=

log Nt log No log 2

Donde: g= Tiempo de generacin (minutos) No = Poblacin inicial (tiempo cero) Nt= Poblacin final o total. Nota: todos los materiales y medios de cultivo (muestras) a descartar, depositarlos en un recipiente son hipoclorito de sodio por 15 a 20 minutos antes de lavarlos o desecharlos. RESULTADOS: Recuento Inicial (No) Recuento final (Nf) Tiempo de generacin = = =

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[CURSO : BACTERIOLOGIA] PRCTICA N 11

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ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA: DETERMINACIN DEL M.I.C. Y EL M.C.B. DE UN ANTIBITICO Una droga quimioterpica es un compuesto qumico que se utiliza en el tratamiento de una enfermedad. El compuesto puede provenir de fuentes naturales o haber sido sintetizado por un qumico en un laboratorio. La enfermedad puede ser de cualquier tipo, incluyendo procesos infecciosos y neoplsicos. Un antibitico es un agente antimicrobiana derivado de un microorganismo; un agente antimicrobiano es una droga que acta primariamente contra microorganismos infecciosos. Los microbilogos, con relacin al uso de antibiticos pueden asistir e dos maneras: Primero, pueden evaluar las interacciones in vitro entre un microorganismo aislado y los agentes antimicrobianos que podra ser apropiados para el tratamiento de una infeccin in vivo (antibiograma). Segundo, su trabajo en el mbito de laboratorio puede brindar datos que ayuden a definir las dosis adecuadas a seleccionar para un tratamiento. Existen una serie de tcnicas que permiten cumplir con las aseveraciones anteriores, entre las cuales estn: Concentracin Mnima inhibitoria (MIC), Difusin en discos (Antibiogramas), Concentracin bactericida Mnima (MCB), Niveles antimicrobianos srico, Niveles bactericidas del suero y las Pruebas de Sinergia. En esta oportunidad llevaremos a cabo dos de estas pruebas; las cuales permiten establecer la dosis ms efectiva de un antibitico sobre un determinado microorganismo. Determinaremos el MIC y el MCB de un antibitico frente a una especie bacteriana. El MIC es la menor concentracin de un antibitico que inhibe el crecimiento visible del microorganismo de prueba in vitro; el CBM es la mnima concentracin de dicho antibitico que destruye a ms del 99,9% del inculo. Realizaremos una combinacin de los mtodos establecidos para dichas pruebas por separado, a fin de obtener los resultados de ambas en 48 horas. Determinaremos el MIC y MCB del cloranfenicol frente a una cepa de Escherichia coli. MATERIALES

Cepa de E. coli de 06 horas de incubacin en Agar M.H. Cpsulas de cloranfenicol Caldo de cultivo Mueller Hinton Placas de Petri con Agar Mueller Hinton Solucin salina fisiolgica Tubos de ensayo de 13x100 y 15x125 mm estriles Pipetas serolgicas de 0.1, 1 y 10 ml Gradilla Mecheros Cmaras cuentacolonias Estufa regulada a 37C Nefelmetro de MacFarland (tubo N1) Asa de koll Page 48

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Asa de Drigalsky Alcohol y ron de quemar

PROCEDIMIENTO: A) DETERMINACIN DEL MIC 1. Preparar una serie de 10 tubos de 15 x 125 mm, nueve (9) de los cuales deben llevar diferente concentracin del antibitico de prueba establecido en la tabla 1. El dcimo tubo no llevar antibitico pues ser el tubo control de crecimiento. 2. Las diluciones antibiticas hacerlas en caldo de cultivo al que se adiciona solucin antibitica de concentracin conocida, en cantidad suficiente que permita obtener la concentracin preestablecida (g / ml). Tengan en cuenta que el volumen final para cada dilucin deber ser de 9 ml. Entendindose que en el tubo N 10 slo se colocar 9 ml del caldo de cultivo y cero antibitico. 3. Prepare el inculo de la siguiente manera: en un tubo de 15x125mm estril coloque en forma asptica unos 12 ml de SSF estril e inocule y disuelva varias asadas de la cepa de E. coli hasta lograr una turbidez anloga al tubo N 1 del nefelmetro de MacFarland. 4. Inocule cada uno de los diez tubos de prueba, con un mililitro (1ml) del inculo preparado. Lleve a incubar a 37C por 20 horas, finalizadas las cuales establezca el MIC respectivo. Para ello, ubique el ltimo tubo en el cual no se observa crecimiento (turbidez), la concentracin de cloranfenicol que contiene representa el MIC de dicho antibitico para la bacteria de prueba. B) DETERMINACIN DEL CBM 1. A partir del inculo preparado en la prueba anterior realizar diluciones de 10-3, 10-6 y 108 en SSF . 2. Siembre en en placas con agar M.H. por diseminacin las dos ltimas diluciones, incube a 37C por 24 horas y determine el nmero de UFC/ml (recuento del inculo) presente en cada uno. 3. Terminada la prueba del MIC, siembre en Placas de agar M.H. por diseminacin alcuotas del tubo del Mic y de los tres tubos anteriores a este. Incube a 37C por 20 horas, realice el recuento de UFC/ml de cada uno de ellos y establezca aquel en el cual slo estn viables menos del 0,1% de la poblacin inicial. 4. La concentracin de antibitico correspondiente a dicho recuento es el CBM respectivo.

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[CURSO : BACTERIOLOGIA] RESULTADOS:

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Llene cada una de las siguientes tablas. Para la tabla 1 establezca grado de crecimiento con cruces (+) y ausencia de crecimiento con signo menos (-).

TABLA 1. Determinacin de la actividad antibitica del cloranfenicol frente a E. coli TUBO N Antibitico (g/ml) Intensidad de Crecimiento I 32 II 16 III 10 IV 8,0 V 6,0 VI 4,0 VII 2,0 VIII 1,0 IX 0,5 X CONTROL

TABLA 2. Valores obtenidos para el MIC y el MCB del cloranfenicol en E. coli MIC CBM

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