FROTIS BACTERIANO

Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o

cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen
agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida. Este frotis
debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos
habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la
muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijación de una extensión bacteriana
hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible
la morfología y bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber.

REALIZACIÓN DEL FROTIS

1. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio.

2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad del
cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla
con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante
extendida para facilitar su secado.
3. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el porta a la
llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar
demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse.

FIJACIÓN DE LAS BACTERIAS AL PORTAOBJETOS

4. Por calor: Pasar cinco veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar
enfriar el porta entre los pases.

TINCIÓN DEL FROTIS BACTERIANO

5. Cubrir el frotis con abundante colorante y dejarlos actuar durante el tiempo que indique
el protocolo de cada tinción concreta. Suele oscilar entre 1 y 5 minutos.
6. Lavar la preparación con agua para eliminar el colorante.
7. Secar el porta: en ningún caso se debe frotar el porta.
8. Observar la preparación al microscopio llegando hasta el máximo aumento. Si se quiere
montar de forma definitiva no se debe usar ahora el aceite de inmersión.

MONTAJE DEFINITIVO DE LA PREPARACIÓN

9. Pasar sucesivamente los portaobjetos por las siguientes soluciones manteniéndolos un

mínimo de 5 minutos en cada baño y por último Montar la preparación.

Una vez que hallamos procedido a realizar el frotis con su respectiva tinción, observaremos
los microorganismos bajo el microscopio, pero como todas las bacterias no son fáciles de
observar debido a su estructura química, debemos utilizar las diferentes tinciones existentes
y que hablaremos a continuación.
 La tinción es un proceso por el cual las moléculas de un colorante se absorben a una
superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los
microorganismos y poder realizar la observación en microscopio óptico. Dado que las
bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se encuentran
suspendidas y no pueden observarse claramente sin algún tratamiento previo. De acuerdo a
la reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción:
 Simple: el colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología celular.
 Diferencial: el colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células bacterianas
o entre partes de una misma célula, estas técnicas utilizan más de un colorante o bien
ciertos reactivos complementarios para la tinción.
Los colorantes más usados son: azul de metileno, cristal violeta, safranina, estos son
catiónicos y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente,
como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos.

Tinción negativa
No se trata de una tinción propiamente dicha ya que no se utilizan colorantes con
cromóforos, ni se lleva a cabo ninguna reacción entre estructuras celulares y los colorantes.
En este caso el frotis se hace con una gota de una solución de nigrosina o tinta china, ambos
son productos particulados, insolubles, que formarán una película opaca a la luz. En este
tipo de tinción se prescinde de la fijación por calor, se deja secar la preparación y se
observan los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro.

Tinción simple
La mayoría de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes derivados
de las anilinas, sales orgánicas intensamente pigmentadas que proceden del alquitrán.

TINCIÓN DIFERENCIAL
Las tinciones diferenciales se utilizan ampliamente en microbiología; consisten en la
aplicación de dos colorantes que contrastan en su intensidad o color y un paso intermedio
que provoca una respuesta diferente entre microorganismos distintos o entre determinadas
células dentro de una población.

Tinción de Gram. Esta tinción diferencial fue propuesta por el medico danés Christian
Gram(1884)(TORTORA et al., 2007) que examinando tejido pulmonar de enfermos
fallecidos por neumonía observó que la bacteria Streptococcus pneumoniae, presente en los
pulmones, retenía el colorante conocido como marrón Bismark(sustituido posteriormente
por el cristal violeta),mientras que el tejido pulmonar no era capaz de retener el colorante.
Es la tinción diferencial más utilizada de forma rutinaria y prácticamente la primera prueba
a la que se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio. Proporciona una
información esencial, además de sobre la forma, tamaño y agrupación celular, como es el
tipo y composición de la pared que presentan las bacterias. La tinción de Gram divide a las
bacterias con pared del Dominio Bacteria en dos grandes grupos: bacterias con pared de
tipo gram positiva y bacterias con pared de tipo gram negativa.

Tinción de ácido-alcohol resistencia

Se trata de un procedimiento de tinción diferencial, conocido como método de Ziehl-
Neelsen, que tiene gran relevancia por su aplicación clínica. Permite poder distinguir
aquellos microorganismos cuya coloración resiste la acción de alcoholes y ácidos suaves
(ácido-alcohol resistentes) de otros que no resisten la decoloración (no ácido-alcohol
resistentes).
Dentro de las bacterias ácido alcohol resistentes encontramos dos importantes patógenos:
Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, microorganismos responsables de la
tuberculosis y la lepra respectivamente.

Tinciones específicas
Se utilizan para incrementar el contraste en las células microbianas y revelan estructuras
particulares, entre las que se incluyen en los flagelos y las cápsulas.

Tinción adecuada
En su forma más simple, el verdadero proceso de tinción puede implicar la inmersión de la
muestra en la solución colorante, seguido del aclarado que es un lavado para eliminar el
exceso de colorante y la observación.

Tinción indirecta:
Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso de un mordiente. Un mordiente
habitual es el ácido tánico.

Tinción directa:
Hablamos de tinción directa cuando el colorante interacciona directamente con el sustrato,
sin otro tratamiento previo.

Las bacterias como podemos saber no aparecen en diferentes medios, más si difieren
químicamente, las cuales pueden distinguirse mediante tinción. La tinción, es un colorante que
reacciona con las células bacterianas, pero no reacciona con su medio exterior. Con esto
podemos indicar que la tinción es importante para la microbiología debido a que: Proporciona
contraste entre el microorganismo y el medio que lo rodea, permitiendo diferenciar varios
tipos morfológicos. Permite el estudio de las estructuras internas de la célula bacteriana, tales
como paredes celulares, vacuolas o cuerpos celulares y permite el empleo de mayores
amplificaciones.