MINISTERIO DE AGRICULTURA Instituto de Investigaciones Agropecuarias Centro Regional Intihuasi

MICROPROPAGACIN DE ALCACHOFAS SIN ESPINAS (Cynara scolymus L.)

ESTACIN EXPERIMENTAL DEL INIA, DONOSO HUARAL LIMA PER

Autores:

Claudia Vsquez Romero Tcnico Agrcola Vctor Alfaro Espinoza Ing. Ejec. Agrcola

La Serena, septiembre 7 del 2009.

INDICE

INTRODUCCIN....................................................................1

OBJETIVOS1

MICROPROPAGACIN EN ALCACHOFAS.2

ETAPAS EN LA PROPAGACIN DE PLANTAS DE ALCACHOFA..3

DESINFECCIN DE EXPLANTES.5

MEDI O DE CULTIVO5

FASE DE INICIO.7

FASE DE MULTIPLICACIN.10

FASE DE ENRAIZAMIENTO Y ACLIMATACIN..11

OTRAS ACTIVIDADES REALIZADAS.13

CONTACTOS REALIZADOS..14

INTRODUCCIN

El proyecto Aumento del potencial productivo y comercial de la agroindustria de alcachofa mediante mejoramiento gentico y optimizacin de factores claves en la cadena de produccin, financiado por INNOVA CORFO, que est siendo ejecutado por INIA, CRI Intihuasi, tiene como objetivo principal la seleccin y multiplicacin masiva de uno o ms clones mejorados de alcachofa tipo Argentina de alto rendimiento agroindustrial. Estos materiales seleccionados de diferentes sectores de la regin de Coquimbo, por su productividad y uniformidad, deben ser masificados a un nmero tal, que permitan hacer pruebas de su comportamiento en terreno, para una superficie media hectrea, lo que significa un nmero de plantas superior a 5.000.

La tcnica de micropropagacin permite contar con ese nmero de plantas de similares caractersticas, lo que sera imposible a travs del mtodo de propagacin tradicional, otra gran ventaja que presenta este mtodo de multiplicacin es que el material propagado se encuentra libre de patgenos. Para realizar esta labor, el proyecto contempla la capacitacin en esta tcnica, a los Investigadores y Ayudantes de Investigacin que participan en la ejecucin del proyecto.

Entre los das 10 y 21 de agosto del ao en curso se realiz el curso taller de Micropropagacin de Alcachofas sin Espinas (Cynara scolymus L.) en el Laboratorio de Biotecnologa de la Estacin Experimental Agraria Donoso-Huaral del Instituto Nacional de Innovacin Agraria de Per por el Programa Nacional de Investigacin en Hortalizas. OBJETIVOS

1. Produccin de Material vegetal de alcachofa con adecuadas garantas en aspecto de identidad gentica y condiciones fitosanitarias 2. Generar las condiciones para posible incorporacin de paquetes tecnolgicos en el manejo de material propagado in vitro. 3. Generar las condiciones para que el INIA o las empresas agroindustriales puedan abastecer con plantas sanas a los agricultores que entreguen su produccin a la industria procesadora de alcachofines o fondo de alcachofa.

MICROPROPAGACIN EN ALCACHOFA

La alcachofa en la mayora de los pases donde se cultiva, se propaga casi exclusivamente en forma vegetativa. El material de propagacin se obtiene directamente de plantas adultas en el mismo campo, con lo que se corre el riesgo de propagacin de plantas deficientes sanitariamente. Esto ha despertado el inters de los investigadores en desarrollar tcnicas de propagacin in vitro para esta especie. Sin embargo, para el caso de alcachofas precoces, como es el caso de Blanca de Tudela y, por aadidura de la alcachofa tipo Argentina, la micropropagacin no se ha desarrollado como herramienta por una prdida de precocidad de los materiales propagados y por una tasa muy baja de multiplicacin. A pesar de ello, la propagacin in vitro, se convierte en la nica alternativa para propagar masiva y rpidamente clones elite de alcachofa dentro de un programa de mejoramiento.

Alta concentracin de hormonas en los medios de cultivo, y el uso de antioxidantes han permitido el desarrollo de protocolos de propagacin in vitro de alcachofa.

ETAPAS EN LA PROPAGACIN DE PLANTAS DE ALCACHOFA

1.- Seleccin y acondicionamiento de explantes El material vegetal a utilizar provendr de plantas madres con hijuelos idealmente juveniles (4 semanas) y entre 25 a 30 centmetros de longitud promedio, los cuales deben ser colectados el mismo da que se van a preparar, ya que se ha visto disminuciones en el porcentaje de prendimiento cuando se colectan el da anterior a la siembra. El procedimiento resumido es el siguiente:

A.- Colecta de hijuelos desde terreno: estos son seleccionados en el campo, descartando todo el material vegetal que presente dao visible causado por hongos, bacterias o dao mecnico, ya que un hijuelo enfermo va a producir una gran cantidad de explantes contaminados.

Seleccin de plantas con buena cantidad y tamao de hijuelos.

Planta con dao causado por agentes patgenos, no apta para propagacin.

B.- Preparacin del hijuelo en el campo: Los hijuelos seleccionados son preparados al igual que para plantacin, se eliminan las hojas exteriores, tierra o barro que puedan contener en sus races o tallos, y el follaje es cortado a un largo aproximado de 30 cm de longitud.

Hijuelos deshojados y cortados a 30 cm aproximadamente.

Extraccin de tierra y barro en el campo

C.- Lavado del material vegetativo: los hijuelos son llevados a laboratorio, donde son lavados con agua potable y chorro continuo, para eliminar toda impureza orgnica o mineral que puedan traer desde el campo.

Lavado de hijuelos en laboratorio.

Lavado de hijuelos en laboratorio.

D.- Preparacin de explantes: Una vez listo el material colectado, se comienza a deshojar hasta llegar a un tamao de 2 a 5 cm de longitud, la base de las yemas es cortada con cuchillo dndole una forma cuadrangular con la finalidad de facilitar la manipulacin.

Explantes deshojados.

Preparacin de las bases de las yemas.

Yema preparada para trabajar en cmara.

Yema e instrumental necesario.

2.- Desinfeccin de explantes Todo el proceso de desinfeccin y manejo de las yemas se realiza con las mejores condiciones de asepsia y materiales completamente esterilizados, para evitar contaminacin del medio de cultivo y/o muerte del meristema: Una vez realizado el triple enjuague con agua destilada, son llevadas a la cmara de flujo laminar para su preparacin., Luego en la cmara de flujo las yemas se sumergen en alcohol al 70% por 1 minuto, agitando constantemente ya que este elimina las burbujas de aire y permite una mejor penetracin del desinfectante. La desinfeccin se realiza con hipoclorito de sodio al 2% por 12 minutos agitando de vez en cuando, posteriormente se enjuaga tres veces con agua destilada esterilizada. Para evitar la fenolizacin de los tejidos, se prepara una solucin de cido ascrbico (100 mg. en 250 cc. de agua destilada) el que es esterilizado con filtro de 0,22 m de porosidad, luego las yemas son introducidas en la solucin antioxidante y se mantienen en ella hasta el momento de la diseccin del meristema.

Traslado de yemas a la cmara de flujo laminar.

Desinfeccin de yemas con hipoclorito de sodio.

Filtro para esterilizar solucin antioxidante.

3.- Medio de cultivo Se utiliza el medio MS (Murashige y Skoog), el cual adems de las sales orgnicas e inorgnicas que se utilizan en la preparacin, lleva azcar blanca refinada al 3% o sacarosa, ajustando el pH a 5.7, utilizando HCl 1.0 N o NaOH 1.0 N dependiendo si se requiere bajar o subir, la solucin resultante se calienta a fuego lento para disolver el

agar agar, que se agrega como solidificante. Finalmente se agregan los reguladores de crecimiento, los cuales van a depender del medio de cultivo a preparar (fase inicio, multiplicacin, enraizante, etc.), posteriormente y antes que el medio se enfre, es dispensado a tubos o contenedores donde se realizaran las siembras o propagacin.

Todos los materiales utilizados y que ingresen a la sala de siembra incluido el medio, deben ser esterilizados en autoclave a 121 C y 1,2 k cm-2 de presin por 20 minutos.

Preparacin del medio de cultivo.

Aplicar nutrientes al medio de cultivo.

Preparacin del medio de cultivo a fuego lento.

Distribucin del medio de cultivo en tubos de ensayos para siembra.

Esterilizacin del medio de cultivo en autoclave.

Preparacin de los materiales a esterilizar en autoclave y que sern usados en cmara de flujo laminar para siembra de meristemas.

Empaque con papel y polipropileno de placas petri.

Vasos precipitados.

Empaque de bisturs y pinzas.

Materiales listas para ingresar a esterilizacin.

4.- Fase de inicio Como explante se usan yemas con 3 a 4 primordios foliares. La diseccin se realiza bajo lupa estereoscpica en cmara de flujo laminar. La eliminacin de los primordios externos y los cortes inducen a la acumulacin de fenoles en el explante que impiden el desarrollo y reducen drsticamente el porcentaje de prendimiento, por lo que el corte debe ser muy rpido. Inmediatamente debe sembrase en el medio de inicio que corresponde a medio MS suplementado con ANA (cido Naftaleno Actico, 0,5 ppm) y BAP (Bencil Amino Purin, 0,2 ppm). Los tubos sembrados deben ir inmediatamente a oscuridad por 4 das y posteriormente aclimatar los explantes a la luz hasta llegar a los 3.000 lux. Cada 7 a 10 das se debe ir subcultivando con el mismo medio de cultivo para evitar la oxidacin. Esta fase dura aproximadamente 10 semanas y las

condiciones de trabajo corresponden a temperaturas de 23 C y fotoperiodos de 16 horas luz.

Importante es tener los materiales e implementos a utilizar en cmara de flujo laminar listos y a la mano, ya que una vez instalados el proceso de limpiesa de tejido y siembra debe ser lo ms rapido posible para evitar fenolizacin.

Preparacin de material a usar en cmara.

Preparacin de material a usar en cmara.

Preparacin de tejidos meristematico en cmara de flujo laminar, el trabajo en esta etapa debe ser rpido y cuidadoso y con optimas condiciones de asepsia.

Eliminacin de primordios externos

Eliminacin de primordios cercanos al meristema.

Tamao de meristema ptimo para siembra, con un par de primordios foliares.

Meristema protegido por un par de primordios.

Yema de buen tamao para siembra.

Yema extraida antes de la siembra

Yema fenolizada, no apto para sembrar.

Yema en condiciones para siembra.

Siembra en medio inicio

Tipo de tubo utilizado para siembra de yema en medio de inicio.

Siembra de yema en tubo con medio de cultivo.

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Inmediatamente sembrados los tubos tienen que ser pustos en oscuridad para evitar que continue la fenolizacin del tejido meristematico, bajo la cmara de flujo se van ubicando en un vaso presipitado oscurecido con papel roneo y tapa de palel aluminio, posteriormete se dejan en cmara oscura por 4 das.

Baso precipitado, protegido internamente con papel para oscurecer.

Caja de cartn negro para mantener en oscuridad los tubos sembrados.

Microplantas despus de 10 semanas en medio de iniciacin.

Microplantas despus de 10 semanas en medio de iniciacin.

5.- Fase de multiplicacin Cuando las microplantas alcanzan el tamao de 2 cm, se transfieren a un medio MS suplementado con BAP (1 ppm). Luego de 6 semanas en promedio se obtienen de 3 a 8 brotes por microplanta, los pequeos se pueden sembrar en los mismos tubos con medio de inicio para que se desarrollen. Los brotes ms grandes se pasan nuevamente a multiplicacin en contenedores ms grande, los ciclos de propagacin es conveniente que no superen los 8 o 9 ya que las plantas van perdiendo vigor.

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Las microplantas se extraen del medio, se limpian multiplicacin.

y se llevan a medios de

Microplantas en medio de propagacin, listas para multiplicacin.

Divisin de brotes en la multiplicacin.

Microplantas de mayor tamao, pasan a medio de multiplicacin.

Microplantas ms pequeas, pasan a medio de inicio, para continuar desarrollo.

6.- Fase de enraizamiento y aclimatacin Se debe promover la diferenciacin de los tejidos para inducir la formacin de races, ya que algunas especies por sus caractersticas fisiolgicas no pueden enraizar directamente in Vitro, para ello se usa medio MS suplementado con ANA (1 ppm). Luego de 4 semanas cuando se observa la formacin de sistema radical, las plantas se traspasan a un medio MS suplementado con IBA (1 ppm), para proliferacin de raices. Cuando las plantas alcanzan 2 cm de raz pueden adaptarse a condiciones ambientales externas, en un invernadero con temperatura controlada de 23 C. La aclimatacin ocurre aproximadamente en 6 semanas.

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Tamao de planta optimo para llevar a enraizamiento.

Siembra en medio de enraizamiento.

Una vez terminada la etapa de enraizamiento, las plantas son extradas de sus contenedores, se retiran los restos de agar con ayuda de pinzas y se lavan las races en agua destilada, sujetando las plntulas delicadamente para no quebrarlas ya que esta no son muy flexibles.

El sustrato utilizado puede ser arena de ro lavada y esterilizada tambin se puede usar sustrato comercial a base de musgo, que ya viene desinfectado, este proceso de aclimatacin toma alrededor de 5 semanas, por lo tanto el tiempo mnimo para obtener plntulas a partir de microplantas in vitro es de 6 meses hasta 8 a 10 meses.

Invernadero utilizado para aclimatacin de plantas.

Invernadero utilizado para aclimatacin de plantas.

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