Taller 4 Biología Celular.

Departamento de Biología Celular e Histología

1° Unidad Académica, FMED, UBA

TALLER 4 DE BIOLOGÍA CELULAR

Atención: Este documento contiene hipervínculos (fuente azul, subrayados) que les permitirán
acceder a fuentes de información adicionales.

Los contenidos del TALLER 4 están asociados a las Unidades 6, 7 y 8 del Programa de Contenidos

Objetivos del Taller 4:

• Comprender los mecanismos moleculares que regulan la localización de proteínas.
• Identificar los compartimientos y modalidades de transporte intracelular que se producen en
el contexto de la vía secretora, y estimar la importancia biológica de esa vía.
• Conocer los fundamentos de los procedimientos y técnicas de biología celular y molecular, e
interpretar sus resultados en el contexto de un problema biológico.

PARTE A

Mecanismos de distribución de proteínas

Contexto fisiológico: Mecanismos celulares y moleculares de la distribución del colesterol

El colesterol es una molécula lipídica indispensable para la vida: forma parte de las membranas
celulares, regulando su fluidez, y es el precursor de las hormonas esteroideas, de los ácidos biliares y
de la vitamina D.
El colesterol presente en nuestro organismo se obtiene principalmente de dos fuentes: de la dieta
(colesterol exógeno) y la síntesis endógena (colesterol endógeno). El colesterol es sintetizado
principalmente en el hígado a través de una amplia serie de reacciones, y es secretado formando parte
de lipoproteínas. Las lipoproteínas son complejos de lípidos y proteínas específicas, que se denominan
apolipoproteínas, y que tienen como función el transporte de lípidos en un medio acuoso como es el
plasma sanguíneo. Las lipoproteínas se clasifican en función de su densidad, ya que en base a este
criterio pueden ser aisladas por ultracentrifugación. La densidad de las diferentes lipoproteínas viene
en buena parte condicionada por su tamaño y por su relación lípido-proteína. En particular, las
lipoproteínas de baja densidad, o LDL (d<1,063g/ml, >1,019g/ml), -conocidas usualmente como
‘colesterol malo’- se caracterizan por su contenido en la apolipoproteína apoB-100 y tienen como
componente lipídico mayoritario los ésteres de colesterol. La función de las LDL es el transporte y
entrega de colesterol a las células, incluyendo tejidos periféricos e hígado.
La incorporación del LDL al interior celular se produce por el proceso de endocitosis mediada por
receptor: las partículas de LDL son reconocidas por los receptores de LDL (LDLR) situados en la
membrana plasmática, que reconocen específicamente la apoB-100 de la partícula de LDL.
El receptor de LDL es sintetizado por múltiples estirpes celulares y viaja hacia la membrana plasmática
quedando fijado por una proteína, denominada clatrina, en unas zonas específicas que se denominan
hoyos revestidos (coated pits, término también traducido como ‘cavidades recubiertas’).
Aproximadamente cada 5min, hayan unido o no LDL, estos hoyos revestidos experimentan endocitosis
y son transportados hacia el citoplasma en forma de endosomas. Posteriormente en los lisosomas, el
contenido proteico y lipídico de las partículas de LDL es hidrolizado hasta formar aminoácidos y
colesterol no esterificado.

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Para comprender los mecanismos fisiológicos, celulares y moleculares que subyacen a la distribución
del colesterol se sugiere analizar las siguientes fuentes de información:

1- El metabolismo del colesterol (subtítulos en español disponibles):

https://www.youtube.com/watch?v=9dghtf7Z7fw

2- El mecanismo de endocitosis del LDL mediada por receptores celulares:

https://www.youtube.com/watch?v=e8FNhATCstE

Actividades

1- Considere el proceso que se inicia con la traducción del ARN mensajero del receptor de LDL
(LDLR) hasta la localización del receptor en la membrana plasmática
- ¿Cuáles son los compartimientos intracelulares por los que transita la proteína?
- ¿Qué modificaciones postraduccionales se producen en el tránsito de LDLR por los
compartimientos intracelulares?
- ¿Se han identificado señales moleculares que posibilitan los distintos pasos del transporte?
Y, en forma complementaria ¿hay pasos del transporte que sean una vía por defecto?

2- Respecto de la endocitosis de LDL mediada por LDLR

- ¿Qué función cumplen los hoyos revestidos (coated pits) de clatrina?
- Teniendo en cuenta la abundancia de vesículas membranosas intracelulares ¿Qué
mecanismos moleculares contribuyen a darle especificidad al transporte vesicular?

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PARTE B

Mecanismos de distribución de proteínas, regulación de la expresión génica y técnicas de Biología

Celular y Molecular para el estudio de la función de las proteínas.

Hipercolesterolemia Familiar: Aportes de la clínica y la investigación básica

El hipercolesterolemia familiar (HF) es una enfermedad muy frecuente, de origen genético, que
provoca un severo incremento de los niveles sanguíneos de LDL (lipoproteínas de baja densidad) desde
el nacimiento. Cuando no es tratada, la HF incrementa significativamente la probabilidad de un
desarrollo temprano de aterosclerosis, asociado a su vez, a ataques cardíacos, infartos y muerte.

La HF desde la experiencia de los pacientes:

https://www.youtube.com/watch?v=8cBeMgztU0I

El receptor de LDL (LDLR) y sus variantes genéticas

La causa más frecuente de la HF (80-85% de los casos) se debe a mutaciones en el gen del receptor de
LDL (LDLR, por sus siglas en inglés), un componente molecular necesario para la endocitosis de las
partículas de LDL al interior celular.
El gen de LDLR se localiza en el brazo corto del cromosoma 19, posee una longitud aproximada de 45
kb, y posee 18 exones. La proteína codificada, LDLR, posee 860 aminoácidos: los aminoácidos 1 a 21
contienen la secuencia señal y son removidos de la proteína durante su procesamiento, de modo tal
que la proteína madura posee los restantes 839 aminoácidos, con un peso molecular es de 160 KDa.
La estructura de LDLR presenta cinco dominios funcionales: el extremo N- terminal de unión al ligando,
el dominio con homología al precursor del factor de crecimiento epidérmico, el dominio con azúcares
O-glicosilados, el dominio transmembrana, y el dominio citosólico C-terminal (Figura 1). El receptor
posee alta afinidad por la apolipoproteína B (apo B) presente en la superficie de las moléculas de LDL.
Se han identificado más de 2600 variantes genéticas diferentes en el gen de LDLR. Sin embargo, para
muchas de ellas aún se desconoce su impacto en la actividad biológica del receptor.
El estudio funcional de las variantes de LDLR es importante desde un punto de vista clínico para poder
predecir cuáles de ellas tendrán un impacto negativo en la funcionalidad del receptor. Esta
información tiene un valor importante para el paciente portador de la misma, permitiendo una
adecuación del tratamiento (inicio temprano o intensificación) destinada a reducir el riesgo
cardiovascular asociado a la HF.

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Figura 1. Estructura de LDLR

(Adaptada de Al-Allaf FA. et al. Int Arch Med 3, 36, 2010).

3- Artículo científico de revisión (usualmente llamados ‘reviews’) sobre la HF (en español):

https://drive.google.com/file/d/1h9Rh2XP3ssBRqhe22jSYg3Vq-FhHaSLB/view?usp=sharing

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Investigación básica sobre la funcionalidad de las variantes genéticas de LDLR:

Un grupo de investigación desarrolló el siguiente trabajo experimental que tiene por objetivo evaluar
la funcionalidad de dos variantes genéticas del LDLR (ver tabla), reportadas previamente en pacientes,
mediante su comparación con la variante no patogénica más frecuente en la población (variante
genética de referencia o wild type).

Nombre de la mutación Cambio respecto de la estructura primaria de la proteína codificada por la variante wild type

p.Ser648Pro La variante cambia una serina en posición 648 por una prolina.

p.Val859Met La variante cambia una valina en posición 859 por una metionina.

Diseño experimental:
El diseño experimental se esquematiza en la figura 2.
Se utilizaron células en cultivo como modelo experimental. En particular, se utilizó una línea celular
deficiente en la expresión de LDLR para no interferir los resultados con la variante endógena de ese
receptor. Se introdujeron plásmidos en las células (proceso denominado 'transfección') que actuaron
como vectores de expresión de distintas variantes genéticas de LDLR: wild type, p.Ser648Pro y
p.Val859Met, respectivamente. En cada tipo de plásmido, el ADN complementario (cADN) de cada
variante se encontraba bajo el control de un promotor viral.
Las células transfectadas se mantuvieron en cultivo por 48h para lograr una expresión máxima de
LDLR.
Posteriormente, las células transfectadas se utilizaron en distintos análisis, descritos en la próxima
sección:
1- Expresión de la variante de LDLR mediante la técnica de Western blot.
2- Localización celular de LDLR mediante inmunofluorescencia.
3- Análisis de la funcionalidad de los receptores mediante la cuantificación de la incorporación de LDL.

Figura 2. Esquema del diseño experimental.

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Resultados:
1- Expresión de la variante de LDLR mediante la técnica de Western blot.
Se utilizó la técnica de Western blot para determinar la expresión proteica de las variantes de LDLR.
Para ello, lisados totales (homogenatos) de las células transfectadas fueron sometidos a una
electroforesis en gel de poliacrilamida y transferidos a una membrana de nitrocelulosa. Se utilizaron
anticuerpos anti-LDLR y anticuerpos anti-GAPDH (una enzima metabólica constitutiva), como control
de carga. Los resultados del Western blot se muestran en la figura 3.

Figura 3. Western blot de LDLR. La forma precursora de LDLR corresponde al estado de la proteína
previo a su modificación por O-glicosilación.

2- Localización celular de LDLR mediante inmunofluorescencia.

Se realizó una inmunofluorescencia en las células transfectadas con anticuerpos primarios anti-LDLR
y anticuerpos secundarios marcados con un fluoróforo verde. Simultáneamente, para determinar la
potencial colocalización con el retículo endoplásmico (RE), se utilizó un anticuerpo anti- calreticulina
(proteína residente del RE) y anticuerpos secundarios marcados con un fluoróforo rojo. Los núcleos
fueron evidenciados con el intercalante de bases DAPI (fluorescencia azul). Las imágenes, obtenidas
con microscopía confocal, se muestran en la figura 4.

Figura 4. Microfotografías confocales de inmunofluorescencia anti-LDLR (verde) y anti- calreticulina

como marcador del RE (rojo). Barra de escala: 10µm.

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3- Análisis de la funcionalidad de los receptores

Se realizó un análisis de la funcionalidad de las variantes genéticas de LDLR mediante la cuantificación
de la incorporación de LDL en las células transfectadas. Los resultados (Figura 5) se expresaron como
porcentaje del nivel de incorporación en las células transfectadas con las variantes analizadas
comparadas con la incorporación mediada por la variante wild type (100%).
Para conocer los detalles técnicos del ensayo de funcionalidad, te sugerimos la siguiente LECTURA
OPTATIVA.

Figura 5. Cuantificación de la incorporación de LDL en las células transfectadas.

CONSIGNAS:

1- Interprete los resultados del análisis y describa brevemente cuál es el efecto de las variantes
genéticas analizadas sobre el receptor de LDL. Compare las variantes genéticas de LDLR respecto del
grado potencial de severidad fenotípica que implican para sus portadores. Fundamente su respuesta.

2- Las variantes genéticas de LDLR que afectan negativamente la actividad de LDLR han sido
clasificadas, dependiendo de su efecto sobre el receptor y el nivel en el que actúan, en cinco clases:
● Clase 1: Ausencia de síntesis proteica.
● Clase 2: Retención total (2a) o parcial (2b) en el retículo endoplasmático.
● Clase 3: Unión defectuosa a la apolipoproteína B (apo B).
● Clase 4: Endocitosis defectuosa del receptor porque no es reclutado en las fosas recubiertas
(coated pits) de clatrina.
● Clase 5: Receptores defectuosos en su reciclado a la membrana plasmática luego de la
endocitosis.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la investigación, determine si es posible clasificar a
las variantes p.Ser648Pro y p.Val859Met en alguna de las clases mencionadas. Fundamente su
respuesta.