6.

- Modalidades de las reacciones de Aglutinación

6a.- Aglutinación (Activa) Directa

La reacción se fundenta en la interacción producida entre los determinantes antigénicis de una célula o
bacteria con sus aglutininas correspondientes, formándose grumos característicos.

Utilidad Clínica de la Aglutinación (Activa) Directa

·Detección de aglutininas en el suero de pacientes con: salmonelosis, brucelosis, leptospirosis, Fiebres

tíficas, etc.

6b.- Hemaglutinación (Activa) Directa

Se fundamenta en la reacción producida entre antígenos propios del glóbulos rojos con sus
respectivas aglutininas.

Utilidad Clínica se la Hemaglutinación (activa) Directa

·Tipificación ABO y Factor Rh

6c.- Aglutinación y Hemaglutinación (Pasiva) Indirecta

En esta reacción se utilizan partículas inertes (por ejemplo látex, en el caso de la aglutinación) o
glóbulos rojos (en el caso de la hemaglutinación) que sirven como transportadores de Ags solubles. La
aglutinación se produce cuando el Ag reacciona con Acs específicos presentes en una muestra biológica.
Muchos antígenos se acoplan espontáneamente o químicamente a los eritrocitos u otras partículas
inertes.

Las reacciones de aglutinación (pasiva) indirecta se realizan en láminas portaobjetos y tubos de ensayo,
mientras que las de hemaglutinación se realizan en tubos de ensayo o microplacas. En láminas
portaobjetos, las reacciones positivas de aglutinación se visualizan a través de la formación de grumos y
en las reacciones negativas la suspensión queda homogénea, mientras que en tubos de ensayo y
microplacas las reacciones de hamglutinación, en caso positivo, se visualizan a través de la formación de
un manto o tapiz de glóbulos rojos y en caso de que la reacción sea negativa, la reacción se viaualiza a
través de la formación de un botón de glóbulos rojos.

Utilidad Clínica de Aglutinación (Pasiva) Indirecta

·Determinación del Factor Reumatoideo en la Artritis Reumatoide

Utilidad Clínica Hemaglutinación (Pasiva) Indirecta

·Determinación de Acs anti-Toxoplasma gondii, Trioanosoma cruzi.

6d.- Aglutinación (Pasiva) Indirecta Reserva

En esta reacción, los Acs están absorbidos a las partículas de látex. Si los Acs son específicos para los Ags
presentes en una muestra biológica, al mezclarse las partículas o glóbulos rojos y la muestra, se
producirá la aglutinación.

Utilidad Clínica Aglutinación (Pasiva) Indirecta Reserva

·Determinación en suero de Proteína C Reactiva (PCR) en procesos inflamatorios.

6e.-Inhibición de la Aglutinación y Hemaglutinación

La inhibición de la aglutinación de partículas de látex recubiertas de Ag o inhibición de la

hemaglutinación de eritrocitos recubiertos de Ag es un método muy sensible para detectar pequeñas
cantidades de Ag soluble en suero u otros líquidos tisulares. La prueba se realiza en dos etapas:

·Primera Etapa

El Ac de especificidad conocida (comercial), se infuba con el Ag presente en una muestra biológica de

cantidad desconocida. Si está presente el Ag específico para el Ac, se producirá la reacción Ag/Ac.

·Segunda Etapa

En la segunda etapa se añaden partículas de látex o eritrocitos recubiertos del mismo Ag que deseamos
detectar en la muestra biológica. Si en la primera etapa ocurrió la reacción Ag/AC no habrán Acs que
reaccionen con los Ags absorbidos en las las partículas de látex o en los eritrocitos, por lo tanto, no
ocurrirá la reacción de aglutinación, observándose una suspensión homogénea o se inhibirá la
hemaglutinación visualizándose un botón de glóbulos rojos y se interpreta que en la muestra biológica
hay la presencia del Ag en estudio (resultado positivo). Si en la muestra biológica no hay el Ag qué
estamos investigando, en la primera etapa no ocurrirá la reacción Ag/Ac y el Ac estará libre sin
reaccionar. Al añadirle las partículas de látex o eritrocitos recubiertos con Ag, los Acs libres reaccionarán
con el Ag de las partículas de látex o de los eritrocitos (manto o tapiz, en el caso de la hemaglutinación),
produciéndose la reacción de aglutinación o hemaglutinación (resultado negativo).

Utilidad Clínica Inhibición de la Hemaglutinación

•Detección de Acs virales.

•Identificación de Ags virales.

7. Prueba de la Anti-Inmunoglobulina Humana (Prueba de Coombs)

Este es un método ingenioso para detectar Acs incompletos o bloqueantes. Estos Acá probablemente
son moléculas bivalentes que forman un enlace monógamo (a grupos antigénicos de repetición de la
superficie celular), por lo que no se produce la reacción de aglutinación. Otros autores explican esta
observación, basándose en el hecho de que en la superficie celular no hay suficientes determinantes
antigénicos para que los Acs superen la repulsión electrostática normal que existe entre los Ags.
Para obtener la Anti-Inmunoglobulina Humana, se debe obtener por diversos métodos inmuno químicos
la fracción de Igs humanas (por ejemplo, precipitación de las IGs del suero con sulfato de amonio).
Luego esta fracción se inyecta a una especie animal heteróloga (conejo, carnero). El animal empezará a
producir Acs (anti-IgA, anti-IgG, anti-IgM, anti-IgE, anti-IgD) contra las IGs humanas (Reactivo de Coombs
polivalente). Si se hace reaccionar el suero humano con el suero del animal o Reactivo de Coombs,
ocurrirá la reacción Ag/Ac, donde las Igs humanas actúan como Ags. Pueden obtenerse Reactivos de
Coombs más específicos. Así si se logra purificar una sola clase de Ig, por ejemplo IgG humana y luego se
inmhniza una especie animal heteróloga, el animal producirá Acs qnti-IgG humana únicamente.

7a.- Prueba de Coombs Directa

Detecta la presencia de Acs incompletos sobre glóbulos rojos provenientes de individuos sensibilizados.
El ejemplo clásico, es la detección de Acs anti-Rh sobre los glóbulos rojos de un recién nacido Rh+, cuya
madre es Rh- (diagnóstico de Anemia Hemolítica del Recién Nacido).

Cuando una mujer es factor Rh-, queda embarazada y el hijo es factor Rh+, entonces de acuerdo al
estado funcional de la placenta o en el momento del parto los eritrocitos fetales pueden pasar a la
circulación materna. Los glóbulos rojos fetales son antigénicamente extraños a la madre y ella empieza a
producir anticuerpos anti-Rh+. Estos Acs son de la clase de IgG y tienen la capacidad de atravesar la
okacenta, por lo que reaccionan con el factor Rh+ de los glóbulos rojos del feto, quedando recubiertos
de estos Acs.

Estos glóbulos rojos empiezan a ser lisados por el complemento o son destruidos en el brazo y el feto
empieza a sufrir de anemia. Cuando el niño nace y se sospecha de Anemia Hemolítica del Recién Nacido,
el médico ordena un Coombs directo para detectar los Acs anti-Rh+ sobre los glóbulos rojos del recién
nacido. Para ello se le extrae sangre al recién nacido y sus glóbulos rojos se hacen reaccionar con el
Reactivo de Coombs.

7b.- Prueba de Coombs Indirecta

Detecta la presencia de Acs incompletos en el suero, mediante una reacción en dos etapas, que
comprende la incubación de la muestra sérica con glóbulos rojos con el objeto de sensibilizarlos y en una
segunda etapa ocurre la aglutinación de los glóbulos rojos sensibilizados por el Reactivo de Coombs.

En la misma circunstancia del ejemplo anterior, es importante determinar el título de Acs anti-Rh en la
mujer embarazada. Para ello, en una primera etapa se hacen reaccionar glóbulos rojos conocidos (Rh+)
com el suero de la paciente. Luego de un período de incubación, en una segunda etapa se añaden el
Reactivo de Coombs (anti-Ig), y si la mujer tiene Acs anti-Rh+ se observará la aglutinación de los glóbulos
rojos.

Reacciones de Precipitación

1.- Definición
Las reacciones de precipitación, son las más simples de las reacciones antígeno/anticuerpo y en ellas se
viaualiza un precipitado visible, cuando reacciona un antígeno (Ag) soluble (precipitógeno) y su
anticuerpo (Ac) correspondiente (precipitina). Los precipitógenos pueden ser cualquier sustancia
antigénica en solución, cómo proteínas séricas, toxinas, extractos de bacyerias, parásitos, hongos, etc.
Estás pruebas son procedimientos serológicos que demuestran la existencia de anticuerpos capaces de
provocar la precipitación de sus correspondientes antígenos cuando ambos reactivos se encuentran en
solución.

2.- Generalidades de las reacciones de Precipitación

•Estas pruebas pueden detectar el Ag o el Ac en una muestra biológica y se puede realizar en forma
cualitativa, semifuantitativa o cuantitativa.

•Son reacciones poco sensibles, por lo que se necesita de cantidades relativamente altas de Ac para
poder observar la reacción.

•No todos los Acs son precipintantes. Los Acs más eficaces en la precipitación pertenecen a las IgG. Por
consiguiente, la ausencia de precipitación en un sistema dado no indica que no existan Acs en el suero
frente al Ag ensayado, sino que pueden encontrarse en cantidad insuficiente o no ser precipintantes.

•La reacción se produce solo si existen electrolitos en el medi. Muchos factores influyen y son
especialmente importantes el pH delesio y la temperatura. La neutralidad del pH favorece la reacción y
la reacción es más rápida entre 37°C y 45°C, pero es más notable a 4°C.

3.- Mecanismo de reacción

En general, las reacciones de precipitación y aglutinación tienen un mismo mecanismo de rracción, y su

diferencia depende de la naturaleza del Ag. En las reacciones de precipitación, el Ag, además de ser
soluble, debe ser multivalente (es decir, debe contar con varios determinantes antigénicos idénticos que
le permitan combinarse con el Ac específico divalente). Ello conlleva a la formación gradual de un
entrecruzamiento o red entre los Acs divalentes y los determinantes antigénicos, que al alcanzar ciertas
dimensiones, el complejo formado precipita.

Teóricamente se cumplen dos pasos en el proceso. El primero sucede segundos o minutos después de
haber puesto en contacto el antígeno con el anticuerpo ora su combinación (interacción o manifestación
primaria de la reacción antigeno-anticuerpo), el segundo caracterizado por la agregación visible hasta
formar el precipitado (interacción o manifestación secundaria de la reacción antígeno-anticuerpo) el
cual requiere horas y aveces días.

4.- Modalidades de las reacciones de precipitación

Las reacciones de precipitación se pueden realizar en medios líquidos y en medios semisólidos (geles).
En los primeros, la interacción antígeno-anticuerpo resulta a menudo perturbada por la formación de
Corrientes y otros disturbios debidos a cambios de temperatura y/o de pH. Los geles, por el contrario,
forman mallas que estabilizan la solución, facilitando la revelación de la reacción antígeno-anticuerpo.
4a.- Reacciones de precipitación en medio líquido:

Las reacciones de precipitación en medio líquido fueron las primeras en utilizarse, cuando en 1897 se
demostró que los filtrados de cultivos bacterianos del vibrión col3rico, producían precipitados al
mezclarse con suero anticolérico.

Dentro de este tipo de reacciones figura la denominada Prueba del Anillo (también conocida como
"Prueba Interfacial" ó "Ring Test"). Este ensayo es un método cualitativo, útil para la rápida detección
bien sea del antígeno soluble o de los anticuerpos antígeno específicos. La prueba se basa en la
cuidadosa superposición del suero (que contiene el anticuerpo) con el antígeno en un tubo capilar ó en
tubos de ensayo de diámetro muy pequeño, en forma tal que en la interfase se forma un anillo de
precipitación como consecuencia de los inmunocomplejos o mallas que se forman como producto de la
reacción antígeno-anticuerpo. Es recomendable poner el antígeno encima y dejarlo resbalar lentamente
por las paredes del tubo a fin de que (en la interfase) se forme lo más nítidamente el anillo de
precipitación.

La prueba en referencia es capaz de detectar concentraciones bajas del elemento de interés (antígeno o
anticuerpo). Debe tenerse cuidado de que ambas soluciones reactantes sean lo más transparente
posible, pues la opalescencia entre una o ambas interfiere produciendo resultados confusos. Este
ensayo se utiliza para detectar e identificar proteínas y otros materiales antigénicos y en la actualidad su
uso es poco frecuente y limitado a estudios experimentales.

Si bien la precipitación en medio líquido es útil para la identificación de antígenos y anticuerpos,

teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto, la misma puede usarse para demostrar que las
concentraciones relativas de Ag y AC desempeñan un papel importante tanto en el mecanismo de
reacción como en la formación de un precipitado óptimo.

En base a lo citado, si se mezclan cantidades crecientes de antígeno soluble con una cantidad constante
de anticuerpos específicos en medio líquido, y se mide cuantitativamente el precipitado resultante, se
observa una relación dosis-respuesta semejante a la que aparece en la Figura 2.

Poner figura 2 página 32

Hay reacciones de precipitación anómalas, llamadas de floculación, en las que la precipitación se

observa solamente en un intérvalo muy estrecho de concentraciones de Ag en relación a las
concentraciones de Acs; los agregados insolubles no se forman hasta que se ha añadido una cantidad
relativamente grande de Ag, por lo que los inmunocomplejos formados (producto de la reacción Ag-Ac),
en su mayor parte quedan en el medio líquido de la reacción sin precipitar al fondo de tubo de ensayo o
pocillo de la placa donde se realizó la prueba (Figura 3). Estás reacciones son producidas solamente por
ciertos antisueros, como por ejemplo: antisueros de caballo contra la toxina diftérica y contra algunas
toxinas estreptocócicas, algunos antisueros humanos contra la tiroglobulina, antisueros humano no
treponémico contra la cardiolipina del corazón de buey, utilizado en el diagnóstico de sífilis, Venereal
Disease Research Laboratory (V.D.R.L.).
Poner Figura 3 página 34

4b.- Reacciones de precipitación en medio semisólido (Inmunodifusión)

Definición.

Las reacciones de inmunodifusión, son técnicas de precipitación que utilizan un gel semisólido como
medio de soporte, en donde el Ag y/o el Ac can a difundir y en el sitio donde se encuentren en sus
proporciones óptimas, aparecerá una línea, un anillo o un arco de precipitación.

Esta técnica fue introducida por Pudín en 1946, con su método de difusión simple en tubo, el cual
consistió en preparar un medio semisólido (celosa) en el que se incorporó un suero que contenía
anticuerpos. Esta mezcla, se colocó en un tubo de ensayo de diámetro pequeño y se dejó solidificar.
Seguidamente se agregó la solución antigénica, la cual difundió lentamente a través del gel que contenía
el suero provocándose la reacción Ag-Ac y como consecuencia de la misma, la aparición de una o varias
líneas de precipitación dependiendo del número de sistemas Ag-Ac presentes en la reacción.

Entre las sustancias utilizadas para efectuar pruebas de inmunodifusión en medio semisólido figura el
agar y la agarosa. El primero de los mencionados (agar), es una mezcla de los polisacáridos agarosa y
acropectina, que se obtienen mediante hidrólisis parcial de un alga marina. Tiene carga eléctrica
marcadamente negativa, inactiva algunos antígenos y posee afinidad por algunos compuestos como las
lipoproteínas y la hemoglobina, debido a que sus grupos sulfatos tienden a reaccionar con ellos.

La agarosa se obtiene eliminando la acropectina, no posee carga eléctrica, no inactiva antígenos y no

muestra afinidad por ninguna macromolécula. En consecuencia, éstas difunden en los geles de Agarosa
con mayor libertad y los diagramas obtenidos con este soporte exhiben mayor poder resolutivo. Estás
características permiten recomendar a los geles de Agarosa para las pruebas de inmunodifusión.

Los medios de soporte antes mencionados, vienen en forma granulada y se disuelven en agua destilada
o amortiguador (buffet) caliente. La solución al alcanzar la temperatura ambiente queda en estado
semisólido.

La concentración del medio de soporte determina en parte, el diámetro de los poros del gel, por lo
tanto, hay que tomarla en cuenta al efectuar pruebas de inmunodifusión, la experiencia ha demostrado
que la inmunodifusión se realiza sin dificultad en un rango de concentraciones del gel que oscila entre
0,3 y 1,5%.

La inmunodifusión se usa para el análisis cualitativo, semicuantitativo y cuantitativo de antígenos y

anticuerpos en el suero y otros líquidos corporales. La interpretación del análisis es el desarrollo de una
reacción de precipitación (la formación de un complejo antígeno-anticuerpo insoluble a partir de un
antígeno y anticuerpo soluble).

Aunque la formación de complejos Ag-Ac en un medio semisólido como el agar depende de los
electrolitos, el amortiguador, el pH y la temperatura, los determinantes más importantes de la reacción
son las concentraciones relativas de antígeno y anticuerpo.
Las reacciones de inmunodifusión pueden ser:

a) Simple

b) Doble

c) Pasiva

d) Activa

a) Inmunodifusión Simple

Son reacciones en donde se incorpora uno de los elementos de la reacción Ag-Ac al gel de Agarosa, por
lo tanto, el Ag o el Ac permanece fijo, mientras que el otro elemento difunde y reacciona, formándose
anillos de precipitación.

Ejemplo: el gel difundido se mezcla con Acs específicos para un determinado Ag. Este se distribuye en
una lámina portaobjetos, de manera que la lámina queda cubierta por una pequeña capa de agarosa.
Una vez gelificado el medio de soporte, se perfora un pozo, en donde se coloca el Ag. Transcurrido un
período de tiempo, el Ag difunde y al cabo de algunas horas se forma un anillo de precipitación, cuyo
límite es la zona de equivalencia del Ag y el Ac. También se puede hacer lo contrario, es decir, se
incorpora el Ag al gel y en el pozo se coloca el Ac.

Primer dibujo página 36

b) Inmunodifusión Doble.

Son reacciones en donde tanto el Ag como el Ac están libres para difundir uno hacia el otro y al
encontrarse en sus proporciones óptimas precipitan.

Segundo dibujo pag 36

c) Inmunodifusión Pasiva.

En esta inmunodifusión, tanto el Ag como el Ac en el gel se forma espontánea, hasta encontrarse y

formar bandas visibles de precipitación. En estás reacciones no interviene ningún factor físico externo
que favorezca la unión Ag-Ac, por lo que estas son reacciones que para evidenciarlas se necesita de un
período de tiempo entre 18 a 24 horas, inclusive pueden durar de 36 a 48 horas.

d) Inmunodifusión Activa.

En esta inmunodifusión, se aprovecha la propiedad que tienen las proteínas de migrar en un campo
eléctrico, es decir, se aplica un factor físico externo para acelerar el acercamiento del Ag y el Ac, por lo
que estás pruebas se ejecutan en menos tipo que las pruebas de inmunodifusión pasiva.

Dibujo página 37
Modalidades de las reacciones de inmunodifusión.

a) Inmunodifusión Doble de Ouchterlony (Pasiva y Doble)

b) Inmunodifusión radial de Mancini (Simple y Pasiva)

c) Inmunoelectroforesis (Activa)

d) Contrainmunoelectroforesis (Activa y Doble)

a) Inmunodifusión Doble de Ouchterlony (Pasiva y Doble).

Es una de las técnicas más utilizadas para evaluar en forma cualitativa o semicuantitativa la presencia de
Ags o Acs en una muestra biológica. Se fundamenta en el principio de que el Ag difunden a través
delesio semisólido formando líneas de precipitación que representan complejos inmunes, los cuales
pueden analizarse visualmente. Esta prueba permite relacionar varios Ags o Acs a través de tres tipos de
patrones: patrón de identidad, de no identidad y de identidad parcial. Esta inmunodifusión es pasiva y
doble.

a.1. Patrón de Identidad

Patrón caracterizado por la formación de dos líneas de precipitación que confluyen en un punto y
significa que en dos muestras biológicas existe la presencia del mismo anticuerpo específico para un
determinado antígeno.

Primer dibujo página 38

En caso de comprobar la presencia de Acs en el suero para un determinado Ag, se puede obtener el
título de Acs, colocando en el centro el Ag y alrededor varias diluciones del suero.

Segundo dibujo página 38

También se pueden ensayar dos antígenos diferentes contra un mismo antisuero.

Primer dibujo página 39

a.2. Patrón de No Identidad

Patrón caracterizado por la formación de dos líneas de precipitación que se cruzan por completo y
significa que en una muestra biológica existe la presencia de dos anticuerpos diferentes, específicos para
dos antígenos.

Segundo dibujo página 39

a.3. Patrón de Identidad Parcial

Patrón caracterizado por la formación de dos líneas de precipitación que no se cruzan por completo,
debido a que los antígenos comparten un determinante antigénico, con la consecuente formación de un
espolón.

Dibujo página 40

Utilidad Clínica de la Inmunodifusión de Ouchterlony:

•Diagnóstico y evolución de enfermedades infecciosas producidas por bacteriaa, virus, hongos y

parásitos.

b) Inmunodifusión Radial de Mancini (Simple y Pasiva)

Esta es una prueba de inmunodifusión simple pasiva. Se fundamenta en el principio de que existe una
relación cuantitativa entre la cantidad de Ag colocado en un pozo horadado en una lámina de agarosa-
Ac y el diámetro del anillo de precipitación resultante.

Para ello, se añade AC a un gel de Agarosa que, a continuación se vierte sobre una lámina de vidrio y se
deja solidificar. Cuando el gel ya está sólido, se excavan en el mismo, unos pocillos y se añade a cada
uno un volumen estándar del Ag problema a diferentes concentraciones. Las placas se incuban durante
un período mínimo de 24 horaa, durante el cual el Ag se difunden hacia el exterior de los pocillos y
forma complejos con el Ac. Éstos se siguen difundiendo hacia el exterior, uniéndose cada vez a más
cantidad de Ac, hasta que se alcanza el punto de equivalencia y los inmunocomplejos precipitan
formando un anillo. La superficie que abarca el anillo, que es función del cuadrado de su diámetro, es
proporcional a la concentración del Ag. La concentración de la muestra problema se determina
mediante interpolación a partir de una curva de calibración. El proceso también se puede llevar a la
inversa, utilizando un gel con Ag para determinar concentraciones desconocidas de Ac.

Dibujo página 41

Utilidad Clínica de la Inmunodifusión Radial de Mancini:

• Determinación cuantitativa de Igs: IgA, IgG e IgM.

•Determinación cuantitativa de C3 y C4 (componentes del complemento)

Inmunoensayo Enzimático (E.L.I.S.A)

1.- Fundamento Metodológico, enzimas utilizadas y sistemas de revelación

Las pruebas inmunoenzimáticas conocidas como pruebas E.L.I.S.A. (del inglés: Enzima Linked
InmunoSorbent Assays) se basan en la detección de la reacción Ag-Ac mediante el empleo de enzimas
unidas al Ag ó al AC específico (conjugado enzimático), las cuales actúan sobre determinados sustratos
para dar origen a productos solubles coloreados que pueden ser medidos espectrofotométricamente a
una determinada longitud de onda. La intensidad de color (Densidad Óptica ó Absorbancia) será
directamente proporcional a la cantidad de complejos Ag-Ac que se ha formado y por tanto
directamente proporcional a la concentración del Ac o Ag investigado en la muestra analizada (En:
suero) (Figura 1a y 1b).

Dibujo página 47

Figura 1a: Principio en el que se fundamenta el inmunoensayo enzimático (E.L.I.S.A). En primer lugar una
enzima se une a un Ac (ó a un Ag) dando origen a un conjugado enzimático. El Ac conjugado reacciona
específicamente con el Ag. La reacción Ag-Ac se revela mediante la actividad catalítica de la enzima
sobre el sustrato, dado que se forma un producto soluble coloreado que se mide por
espectrofotometría.

Dibujo página 48

Figura 1b: Representación gráfica del principio en el que se fundamentan las pruebas de E.L.I.S.A.

Por lo general y dependiendo de lo que se quiera detectar, en las pruebas de E.L.I.S.A. el anticuerpo (en
caso que se quiera detectar el Ag en la muestra analizada) (ó el Ag, en caso que se quiera detectar el Ac
específico en la muestra bajo estudio) se fija a una superficie inerte (En: una placa de poliestireno para
microtitulación), luego se agrega la muestra a analizar y después de un período de incubación
determinado y posterior lavado a fin de eliminar todo aquello que no se haya combinado, el material
adherido (en este caso es el Ag) se detecta y caracteriza a través de un anticuerpo secundario específico
para el Ag qué se investiga conjugado a una enzima.

Las pruebas inmunoenzimáticas, constituyen una de las herramientas actuales más útiles en el
laboratorio de inmunodiagnóstico, debido a que las mismas presentan una serie de ventajas, entre las
que figuran:

✓Alta sensibilidad y especificidad

✓Altos valores de predicción positivos y negativos

✓Som pruebas de gran aplicabilidad clínica

✓Son de fácil realización y lecturas o objetivas de densidad óptica (espectrofotometría)

✓Permite identificar la clase de inmunoglobulina involucrada (IgG ó IgM)

✓Sus resultados se obtienen en un tiempo relativamente corto (12-24 horas)

✓Son pruebas seguras ya que los reactivos empleados por lo general no representan riesgos para la
salud

✓Los reactivos empleados son bastante estables

✓Es un método que puede automatizarse, lo que permite el procesamiento de un gran número de
muestras, tanto para su uso en encuestas y pesquisas seroepidemiológicas de personas pertenecientes a
diferentes comunidades como de pacientes referidos al laboratorio por los médicos tratantes.

Existen una serie de requisitos o requerimientos que deben reunir las enzimas para ser utilizadas en
estos ensayos. En este sentido, las mismas deben ser estables porucho tiempo durante su
almacenamiento (meses, incluso años), bien sean como enzimas libres o conjugadas, deben ser
obtenidas de forma pura y preferiblemente a bajo costo, la actividad enzimatica debe ser alta y
fácilmente detectable, deben ser conjugables a Acs ó Ags con relativa facilidad y el proceso de
conjugación no debe modificar la actividad catalítica de la enzima ni la especificidad de de combinación
antigénica de Ac ó alterar la estructura confirmacional de los determinantes antigénicos del Ag, además
los productos de la reacción deben tener un elevado coeficiente de extinción molar lo cual incrementa la
sensibilidad del ensayo. Las enzimas consideradas hasta ahora más satisfactorias y por tanto las que
comúnmente son empleadas para preparar el conjugado enzimático son la fosfatasa alcalina, la
peroxidasa de rábano picante y la beta-galactosidasa.

La elección del sustrato es crítica en las pruebas inmunoenzimáticas. Los mismos deben ser no tóxicos ni
fotosensibles, además de estables y solubles antes y después de la degradación enzimática. Los
sustratos cromogénicos deben ser incoloros inicialmente y fuertemente coloreados después de su
transformación en productos como consecuencia de la actividad catalítica se la enzima. Una gran
variedad de sustratos se pueden incubar con las enzimas antes mencionadas para generar productos de
color susceptibles de cuantificación mediante espectrofotómetros calibrados a una determinada
longitud de onda, llevándose a cabo la reacción en placas de microtitulación.

El sustrato seleccionado va a depender, entre otras cosas, de la enzima utilizada, así cuando se trabaja
con conjugados de peroxidasa de rábano picante, el sustrato seleccionado será el peróxido de hidrógeno
junto con o-fenilendiamina (OPD) ó aviso 2,2' azo bis 3-etil-benzotioasoico (ABTS). La enzima
descompone el peróxido de hidrógeno liberándose oxígeno y este oxida al OPD o ABTS rindiendo
productos coloreados que pueden ser medidos a determinadas longitud de onda (Figura 2a). En el caso
que la enzima seleccionada sea la fosfatasa alcalina se utiliza como sustrato el p-nitrofenolatofosfato (ó
p-nitrofenilfosfato) el cual es desfosforilado por acción de la enzima dando origen al p-nitrofenolato un
producto de color amarillo que puede ser leído a 405 nm (Figura 2b).

Uni de loa sistemas de revelado que con mayor frecuencia utilizan los equipos en nuestro país, incluye
los conjugados se peroxidasa y como sustrato una mezcla de tetrametilbencidina/peróxido de hidrógeno
(TMB/H2O2). En este caso, la enzima degradaría al H2O2, lo cual generaría la formación de agua y la
liberación de oxígeno. Cómo consecuencia de lo citado, se produciría la oxidación de la TMB. Este
compuesto inicialmente es incoloro y después de su oxidación adquiere un color azul. La reacción
enzimática es interrumpida por la adición de ácido sulfúrico, virando el color azul hacia el amarillo.

Dibujo página 50
Figura 2: Sistema de revelación enzimática A= Peroxidasa B=Fosfatasa alcalina

Otra forma de revelar la reacción es utilizando sustratos luxógeno (capaces de emitir luz) en lugar de
sustratos cromógemoa, en otras palabras mediante quimioluminiscencia. Las versiones de ELISA que
usan este tipo de sustratos son mucho más sensibles; en general, el límite de detección puede intentaré
cuando menos 10 veces en comparación con el uso de sustratos cromógenoa. Muchas de las pruebas de
ELISA quimioluminicente usan un compuesto llamado luminol (un luxógeno) el cual se oxida por el
oxígeno generado por la acción de la peroxidasa sobre su sustrato, el H2O2 (Figura 3). Este tipo de
sustrato también se utiliza en las pruebas se Western Blot.

Dibujo página 51

Figura 3: Sistema se revelado utilizado en las pruebas de ELISA quimioluminiscentes.

2.- Modalidades se las pruebas de E.L.I.S.A.

Se cuentan con diversas modalidades o variantes de E.L.I.S.A. las cuáles permiten la detección
cualitativa o la medición cuantitativa de antígeno o anticuerpo. Cada modalidad puede usarse de
manera cualitativa con la finalidad de demostrar la presencia o ausencia de antígeno o anticuerpo. Para
la determinación cuantitativa debe prepararse una curva estándar con base en concentraciones
conocidas de antígeno o anticuerpo a partir de la cual es posible determinar la concentración
desconocida de una muestra.

2a.- Método E.L.I.S.A. Indirecto

El método indirecto es ampliamente utilizado para la determinación de anticuerpos en muestras

biológicas. En este caso el suero o alguna otra muestra a investigar que presuntamente contiene los
anticuerpos de interés es añadido en el pocillo de una placa de microtitulación a la cual previamente se
encuentran adheridos los antígenos. Después de eliminar mediante lavados el material no combinado, la
presencia del anticuerpo unido al antígeno se detecta mediante la adición de un segundo anticuerpo (Ej:
Anti-Inmunoglobulina Humana, anti-IgG humana ó anti-IgM humana o de otra especie según sea el caso)
conjugado a una enzima, el cual se unirá al primer anticuerpo que está formando complejo con el Ag
fijado al soporte sólido. A continuación, se elimina por lavado cualquier exceso de conjugado que se
encuentre libre y finalmente se añade el sustrato para la enzima. La cantidad de producto coloreado que
se forme puede ser medida fácilmente utilizando lectores espectrofotométricos especialmente
diseñados para leer placas, los cuales pueden medir en segundos la Absorbancia de la totalidad de los
pozos en una placa de microtitulación.

Dibujo página 52
Figura 4: Fundamento metodológico de la modalidad indirecta del E.L.I.S.A.

La cantidad de sustrato hidrolizado será proporcional a la cantidad de anticuerpo presente en la

muestra. Esta modalidad del E.L.I.S.A. es el método de elección para detectar la presencia de
anticuerpos séricos contra el virus VIH, el agente causal del SIDA. Asimismo, mediante esta modalidad
pueden detectarse también anticuerpos específicos contra innumerables patógenos responsables de
diversas enfermedades.

2b.- Método E.L.I.S.A. de captura o de doble anticuerpo ("sándwich")

El objetivo de esta modalidad es la detección de un determinado Ag en la muestra analizada. En esta

técnica, el anticuerpo antígeno específico se inmoviliza a la matriz inerte, seguidamente se añade la
muestra que presuntamente contiene el antígeno y se deja reaccionar con el anticuerpo inmovilizado
durante un período de incubación determinado. Después de lavar el pozo, se añade un segundo
anticuerpo ligado a la enzima, el cual es específico para un epítope distinto del antígeno (puede ser el
mismo epítope en caso de Ags multivalentes) y se permite que reaccione con el antígeno unido al
soporte sólido. Una vez eliminado (mediante lavados), cualquier exceso del segundo anticuerpo
conjugado libre, se añade el sustrato y se mide el producto de la reacción enzimática (Figura 5). Similar a
lo observado en la modalidad antes descrita, la cantidad de sustrato hidrolizado será proporcional a la
cantidad de antígeno presente en la muestra.

Dibujo página 53

Figura 5: Fundamento metodológico de la modalidad de captura o de doble anticuerpo ("sándwich") del

E.L.I.S.A.

2c.- Método E.L.I.S.A. competitivo

Esta variante puede ser empleada para detectar tanto antígenos cómo anticuerpos específicos en
muestras biológicas. En el caso del método competitivo para la detección de antígeno, se agrega la
muestra en estudio (En: suero, el cual presuntamente contiene el antígeno de interés) y el antígeno
conjugado con una enzima, a un pozo de una placa se microtitulación recubierto con anticuerpos
específicos para el anticuerpo en referencia, la mezcla es incubada y seguidamente se realizan los
lavados de rigor. En este punto, cuanto más antígeno se encuentre en la muestra menos antígeno
conjugado se unirá al anticuerpo fijado a la matriz sólida, ya que as establecerá una competencia entre
el antígeno conjugado y el antígeno libre presente en la muestra biológica, donde la competencia es
"ganada" por el elemento que se encuentre en mayor concentración (Figura 6). Posteriormente, se
añade el sustrato enzimático y se produce la reacción de color.

En esta modalidad, la densidad óptica ó Absorbancia medida es inversamente proporcional a la

concentración del antígeno en la muestra examinada. Al incluirse un sistema de referencia l, en el cual
se añade únicamente el antígeno conjugado al pocillo en el cual se encuentra fijado el anticuerpo, es
posible establecer comparativamente diferencias en relación a las densidades ópticas ó absorbancias
con respecto al pocillo descrito anteriormente. En este último caso, cuanto mayor sea la diferencia entre
la densidad óptica y absorbancia (vinculada directamente con la degradación del sustrato) obtenidas
entre el pocillo de referencia (antígeno conjugado solo) y el pocillo donde se agregó el antígeno
conjugado más la muestra ensayada, mayor será la concentración del antígeno en la muestra bajo
estudio (Figura 6).

Dibujo página 54

Figura 6: Fundamento metodológico del E.L.I.S.A. competitivo para la detección de antígeno en una
muestra biológica

En el caso del método competitivo para la detección de anticuerpos, se agrega la muestra en estudio
(Eh: suero, el cual presuntamente contiene el anticuerpo de interés) y el anticuerpo conjugado con una
enzima, a un pozo de una placa de microtitulación recubierto con el antígeno, la mezcla es incubada y
seguidamente se realizan los lavados de rigor. Cuánto más anticuerpo libre se encuentre en la muestra
menos anticuerpo conjugado se unirá al antígeno fijado a la matriz sólida, ya que, al igual que en el caso
anterior, se establecerá una competencia entre el anticuerpo conjugado y el anticuerpo libre presente
en la muestra biológica. Tal y como se mencionó, la competencia es "ganada" por el elemento que se
encuentre en mayor concentración. Posteriormente, se añade el sustrato enzimático y se produce la
reacción de color. Igualmente, la densidad óptica ó absorbancia medida es inversamente proporcional a
la concentración del anticuerpo en la muestra examinada. Asímismo, puede incluirse un sistema de
referencia, en el cual se añade únicamente el anticuerpo conjugado al pocillo en el cual se encuentra
fijado el antígeno específico. Este pocillo de referencia, también permite establecer comparativamente
diferencias en relación a la densidad óptica ó absorbancia con respecto al pocillo descrito
anteriormente. En este sentido, cuanto mayor sea la diferencia en relación a la densidad óptica ó
absorbancia obtenida entre el pocillo de referencia (anticuerpo conjugado solo) y el pocillo donde se
agregó el anticuerpo conjugado más la muestra ensayada, mayor será la concentración del anticuerpo
en la muestra bajo estudio.

2d.- Método E.L.I.S.A. anti-IgM

El objetivo de esta modalidad es la detección de anticuerpos de clase IgM específicos contra una gran
variedad de antígenos derivados de diferentes microorganismos patógenos (En: IgM anti-Toxoplasma
gondii, IgM anti-Tripanasoma cruzi, IgM anti-virus Dengue, entre otros). En este caso, el fondo del pozo
de la placa de microtitulación se encuentra revestido con anticuerpos específicos contra la IgM humana
(anti-IgM humana), luego se añade el suero en estudio, se incuba y una vez finalizado el período de
incubación se lava. En esta etapa de la prueba la IgM total del suero es capturada por los anticuerpos
anti-IgM fijados al soporte sólido. Se añade entonces el antígeno marcado con la enzima. (ó el antígeno
seguido de anticuerpo específico contra el antígeno conjugado con la enzima). Finalmente, se añade el
sustrato enzimático y se produce la reacción de color. La densidad óptica ó absorbancia (producto de la
degradación del sustrato por la enzima) es proporcional a la concentración de anticuerpo IgM antígeno
específico presente en el suero analizado (Figura 7).
Dibujo página 55

Figura 7: Fundamento metodológico del método anti-IgM del E.L.I.S.A. en microplacas para el análisis de
anticuerpo IgM antígeno específico.

Es importante destacar que la presencia de anticuerpos de clase IgM antígeno específica es indicativo
que la infección ocurrió recientemente. En casos de niños recién nacidos se correlaciona con infección
congénita o que la infección ocurrió durante el nacimiento. La detección de anticuerpos de clase IgM es
útil cuando se quiere hacer diagnóstico de infecciones agudas o recientes e infecciones congénitas
debido a que durante el curso de cualquier infección es este isotipo de inmunología la que se sintetiza
primero y su vida media es mucho mejor que la exhibida por los anticuerpos de clase IgG. En particular
el método de anti-IgM es útil en aquellos casos en los cuales el anticuerpo específico IgM constituye una
gran proporción de la IgM total presente en el suero, tal como ocurre durante las infecciones agudas y/o
congénitas. Asimismo, este método es mejor que el método indirecto usando conjugados anti-IgM ya
que en ciertas circunstancias el método indirecto puede causar problemas debido a la interferencia de la
IgG antígeno específica.

3.- Sistema Biotina-Avidina

La avidina es una glucoproteína básica derivada de la albúmina de huevo y tiene una elevada afinidad
por la Biotina. La Biotina es una vitamina hidrosoluble (denominada vitamina H ó vitamina B8), que se
encuentra en la mayoría de los alimentos de procedencia animal o vegetal e interviene en el
metabolismo de los carbohidratos, grasas y aminoácidos. La Biotina puede acoplarse covalentemente a
una proteina; como por ejemplo un anticuerpo y luego hacerla reaccionar con la Avidina conjugada a
una enzima. Lo citado, permite la detección de anticuerpos ó antígenos específicos en muestras
biológicas en variantes de las modalidades de las pruebas inmunoenzimáticas (En: E.L.I.S.A. indirecto).
En tal sentido, una vez que el anticuerpo (presente en una muestra biológica) ha reaccionado con el
antígeno específico, el cual se encuentra fijado a la matriz inerte (En: pocillo de una placa de poliestireno
para microtitulación) se agrega anti-inmunoglobulina humana (anti-Ig humana) a la cual se ha acoplado
Biotina. A continuación se agrega Avidina conjugada a la enzima, finalmente se añade el sustrato del
enzima y se produce la reacción de color (Figura 8).

Debido a que múltiples moléculas de Biotina pueden acoplarse a cada molécula de anticuerpo, la
cantidad de producto obtenido, por cada complejo antígeno-anticuerpo formado, será superior a la
obtenida en los métodos antes descritos. Esto permite detectar cantidades muy pequeñas del elemento
en estudio presentes en la muestra; en otras palabras, el uso del sistema Biotina-Avidina en las
diferentes modalidades del E.L.I.S.A. hace posible que la sensibilidad del método se incremente
considerablemente.

Aplicaciones de las pruebas de E.L.I.S.A.

En principio, las pruebas de E.L.I.S.A. son útiles para el análisis de cualquier anticuerpo, si el antígeno
puede ser inmovilizado convenientemente en una fase sólida. El área de mayor aplicación ha sido la
búsqueda y titulación de anticuerpos en infecciones bacterianas, micóticas, parasitarias y virales (Cuadro
1). En estos casos las pruebas de E.L.I.S.A. han demostrado ser de sencilla ejecución, han dado origen a
altas tasas de sensibilidad e índices de especificidad similares o superiores a los obtenidos con otras
pruebas (En: inmunofluorescencia y radioinmunoensayo). Por otra parte, las pruebas de E.L.I.S.A. son
fácilmente automatizadas por lo que puede procesarse un gran número de muestras.

Durante los últimos años los métodos han sido adaptados para identificar la clase de inmunoglobulina
correspondiente a los anticuerpos en varias afecciones, lo que ha permitido en muchos casos mejorar la
especificidad del diagnóstico y extraer información relevante en relación con la evolución y patogenia
del cuadro patológico (Cuadro 2).

Dibujo página 57

Figura 8: Fundamento metodológico del sistema Avidina-Biotina

Cuadro 1: Aplicaciones de las pruebas de E.L.I.S.A. en la búsqueda de anticuerpos en enfermedades

infecciosas

HACER CUADRO 1 PAGINA 57

Cuadro 2: Ejemplos de aplicaciones de las pruebas de E.L.I.S.A. en la búsqueda de diferentes clase de

inmunoglobulina

HACER CUADRO 2 PAGINA 58

Asimismo, estás pruebas han permitido la detección de diferentes autoanticuerpos involucrados en

patologías autoinmunes (En: Acs anti-ADN, Acs anti-tiroideos, Acs anti-mitocondriales, Acs anti-células
parietales, Acs anti-cardiolipina, Acs anti-esperma, entre otros).

Además las pruebas de E.L.I.S.A. se han diseñado para la detección y cuantificación de antígenos. Dentro
de estás aplicaciones figuran la detección del Ag de superficie del virus de la hepatitis B (AgsHB),
hormonas tiroideas (ej: T3, T4, TSH "hormona estimulante del tiroides"), hormonas de la fertilidad (ej:
cortisol, testosterona), ferritina, interleuquinas, interferón gamma, factor de necrosis tumoral, entre
otros.
Las pruebas inmunoenzimáticas han permitido obtener importantes mejoras en la especificidad del
diagnóstico de las enfermedades infecciosas y parasitarias, donde la liberación del antígeno coincide con
la actividad de la afección.

Determinación de Proteína C Reactiva (PCR)

I. INTRODUCCIÓN

Varias proteínas plasmáticas llamadas colectivamente proteínas de fase aguda sufren un espectacular
aumento de su concentración en respuesta a mediadores químicos llamados citocinas secretados por los
macrófagos y liberados como consecuencia de una infección o lesión de los tejidos. Estás citocinas actúan
directamente sobre los hepatocitos, incrementando la síntesis de las proteínas de fase aguda por parte de
estas células (Figura 1). Entre estás proteínas se pueden mencionar: la proteína C reactiva (PCR), la proteína
fijadora de mañosa, el componente O amiloide sérico y el fibrinógeno.

Dibujo página 141

Figura 1: Respuesta de fase aguda debido a la presencia de una infección bacteriana.

La proteína C Reactiva (PCR) originalmente descrita por Tillet y Francis en 1930, debe su nombre a su
capacidad de interactuar con el polisacárido C de la cápsula del neumococo. Fue descubierta en el suero de
personas con neumonía producida por Streptococcus pneumoniae. Pertenece a la familia de las pentraxinas
de proteínas plasmáticas, así llamadas porque contienen cinco subunidades globulares idénticas. Otra
proteína termolábil que no atraviesa la barrera placentaria y cuya movilidad electroforética se encuentra
entre las zonas de la Alpha y Beta globulinas.

Diversos métodos han sido empleados para la detección de niveles de PCR en el suero humano. Hay técnicas
que permiten la determinación de forma cualitativa y semicuantitativa; entre estás podemos mencionar: las
pruebas de Precipitación en tubos capilares y las de aglutinación de partículas de látex. Otras metodologías
muy utilizadas en la actualidad determinan la presencia de PCR de manera cuantitativa a través de
inmunoanálisis nefelométrico y turbidimétrico. Por técnicas turbidimétricaa se ha logrado determinar que los
valores referenciales de PCR están comprendidos entre 0,0 - 0,8 mg/dL y por nefelometría los valores
referenciales están por debajo de 1 mg/dL. También se ha realizado radioinmunoensayo que permite
detectar niveles de 3 ng/mL. De todas las anteriores, la técnica de aglutinación de partículas de látex tiene la
ventaja de ser simple y rápida con respecto a los otros métodos.

II. FUNDAMENTO METODOLÓGICO

El sistema analítico que se empleará en esta práctica para la detección de PCR en muestras de suero, tiene
como principio o fundamento una reacción inmunológica entre el antígeno (Ag) (PCR) presente en el suero y
su anticuerpo (Ac) específico, el cual está asociado a partículas de látex, manifestándose este fenómeno por
la aparición de grumos visibles macroscópicamente al realizar el ensayo en láminas de aglutinación de fondo
oscuro y bajo una fuente de iluminación adecuada (Figura 2). La sensibilidad del reactivo de látex es
aproximadamente de 6 mg/dL, por lo que valores normales de PCR en el suero no pueden ser detectados por
este procedimiento.

Comúnmente la fuente de PCR para su purificación es la contenida en el líquido ascítico o pleural de

pacientes con infecciones agudas o cáncer. Adicionalmente, la PCR puede obtenerse después de la
inoculación con vacunas tifoideas-paratifoideas o de neumococos virulentos vivos en animales de
experimentación.

Los anticuerpos contra la PCR se pueden producir en conejos, carneros o cabras, mediante el uso del
adyuvante completo de Freund. Hoy en día, hay disponibilidad comercial de antisueros anti-PCR y de PCR
purificada; de este modo el laboratorio clínico dispone de los reactivos para ejecutar las pruebas
diagnósticas.

DIBUJO PAGINA 143

Figura 2: Representación esquemática del fundamento de las pruebas de aglutinacion pasiva (indirecta)
reversa para la determinación de PCR en suero.

III. Proteína C Reactiva como mecanismo de respuesta inmune

Después de estímulos nocivos, cómo por ejemplo infecciones, quemaduras, neoplasias o traumatismos, el
organismo lleva a cabo una serie de reacciones complejas que involucran una variedad de mediadores
químicos. Algunos de estos mediadores son derivados de los microorganismos invasores, otros son
generados por varios sistemas enzimáticos plamáticos y algunos son productos de varias células que
participan en la respuesta inflamatoria. Este proceso en su conjunto es denominado inflamación, y las
reacciones inmediatas que se llevan a cabo después del daño tisular constituyen la respuesta de fase aguda.
Esta respuesta consiste en un rápido ajuste en la composición de las proteínas plasmáticas, aumentando la
concentración de algunas (proteínas de fase aguda) mientras que disminuye la de otras.

Entre las proteínas que aumentan sus niveles se encuentra la PCR, el componente P del amiloide sérico, la
haptoglobina, el fibrinógeno, la glucoproteína ácida Alpha 1, entre otras; la albúmina y la transferring,
disminyen. La Respuesta inmediata es la activación de los leucocitos, fibroblastos y células endoteliales con la
subsiguiente liberación de Interleuquinas 1, 6 (IL-1, IL-6) y Factor de Necrosis Tumorak (FNT), las cuáles
inducen la producción por parte del hígado de las proteínas de fase aguda. Es importante considerar que en
realidad, el hígado no es la única fuente de proteínas de fase aguda, aunque la síntesis extrahepática (llevada
a cabo principalmente por monocitos, fibroblastos, adipocitos y células endoteliales) es cuantitativamente
poco importante. La proteína primeramente descubierta y caracterizada fue la PCR, reactantes de fase aguda
mejor estudiada y de mayor aplicación clínica en el presente.

Una propiedad importante se la PCR es su capacidad de fijarse de manera dependiente del calcio, a varios
microorganismos que contienen fosforicolina en su membrana y el complejo tiene la útil propiedad de activar
el complemento (por la vía clásica). Esto ocasiona el depósito de C3b en la superficie del microbio que así
opsoniza para su adherencia). Esto ocasiona el depósito de C3b en la superficie del microbio que así opsoniza
para su adherencia a los favoritos. También puede actuar como opsonina inespecífica (es decir,
independiente de Ac); esta opsonización inespecífica es menos eficiente que el revestimiento por Acs o C3b
pero potencia la fagocitosis en las fases iniciales de la infección, antes de que se sinteticen los Acs específicos.

La PCR redistribuye a los neutrófilos en los tejidos inflamados; cuando el pentámetro de PCR es disociado, sus
unidades sufren un arreglo confirmacional que resulta en un isómero distinto con características
fisicoquímicas y antigénicas únicas, esta forma modificada de PCR aumenta la localización y activa a los
neutrófilos en los sitios inflamados. Actúa armónicamente con los componentes de la vía clásica del
complemento para promover la limpieza de las células apoptóticas y tiene afinidad natural para depurar
fragmentos de nucleosomas y pequeñas ribonucleoproteínas nucleares. Por otra parte, la PCR se une a la
cromatina liberada del tejido necrótico durante la inflamación y promueve su depuración.

IV. Utilidad Clínica

1.- Reactante de fase aguda

La PCR es un marcador del proceso inflamatorio ampliamente reconocido, dado que la concentración que
normalmente se detecta en el suero humano es inferior a 1 mg/dL y en algunos casos se encuentra ausente;
no obstante, los niveles de está proteína se incrementan notablemente en muchas reacciones inflamatorias e
infecciosas, en las cuales es posible observar en niveles que superan en mil veces a la concentración
referencial y fisiológica antes mencionadas. Infección, daño tisular, crecimiento neoplásico o un desorden
inmunológico generan una reacción de fase aguda. El incremento se produce aún antes de la aparición de
algunos signos clínicos como la fiebre. El aumento se observa entre las 6 y 8 horas de iniciado el proceso
inflamatorio, observándose la mayor concentración entre las 24 y 48 horas siguientes.

Si bien el hallazgo de niveles elevados de PCR no es específico de una determinada enfermedad, resulta un
indicador útil de procesos inflamatorios, siendo más sensible y fiable para estos procesos que la Velocidad de
Eritrosedimentación Globular (VSG), la cual puede estar influida por cambios fisiológicos no asociados al
proceso inflamatorio, como es el caso de las anemias. El aumento en la concentración de PCR ocurre más
rápidamente que el aumento de la VSG y cuando la condición inflamatoria cede, la PCR cae muy
rápidamente, alcanzando niveles normales varios días antes de que normalice la VSG.

2.- Marcador de recuperación post-cirugía

La PCR se ha utilizado como marcador de recuperación post-cirugía. Cuando se extrae suero de un paciente
que ha sido intervenido quirúrgicamente y se prueba a intervalos de tiempo adecuados, la disminución del
título o de la concentración de PCR puede utilizarse como índice de recuperación. Los valores retornan a los
preoperatorios a los 7 días de la cirugía.

3.- Evaluación de tratamiento

En todas aquellas enfermedades que cursan con PCR elevada, la medición seriada de PCR puede ofrecer
información sobre la evolución del tratamiento permitiendo su monitorización.

4.- Detección y evaluación de infección recurrente

La PCR es especialmente sensible a la mayor parte se las infecciones, y el aumento en sus niveles permite
evidenciar una posible infección en pacientes sanos y/o con predisposición a la misma. En los casos en qué la
elevación de los valores de PCR no estén relacionados con un proceso infeccioso, la causa de dicho aumento
será definido a través de otras mediciones de laboratorio o de la clínica del paciente.

5.- Monitoreo de angina inestable y enfermedad cardíaca

Después de un episodio de dolor toráxico correspondiente a angina inestable, ocurre normalmente una
elevación de PCR que debe disminuir a valores normales algunos días después. Esta elevación es reflejo del
grado de inflamación presente en las arterias coronarias. La persistencia de un título o concentración elevada
de PCR está relacionada con un pronóstico desfavorable a mediano plazo en estos pacientes. Necrosis tisular
en general por isquemia o infarto, la más representativa el infarto de miocardio que muestra incrementos de
PCR a las horas con tendencia a la normalización a los 7 días.

6.- Otras patologías

La PCR aumenta en:

•Artritis reumatoide, fiebre reumática, artritis tipo monoartritis y artritis seronegativas.

•Diferentes espondilitis inflamatorias, la más representativa la anquilosante. Enfermedades inflmatorias

vasculíticas con ó sin síntomas articulares.

• Tumores malignos incluidos los más frecuentes como pulmón, mamá y cánceres del tubo digestivo,
particularmente con metástasis. Después de tratamiento con éxito y normalización de la PCR, la evolución de
la misma puede ser un buen marcador Tumorak.

•El rechazo de transplante de órganos ó de médula ósea.

•Traumatismos, fracturas ó quemaduras.

•Infecciones particularmente las bacterianas en diferentes localizaciones. Las elevaciones son más modestas
en las infecciones víricas.

V. Limitaciones

Esta prueba de laboratorio debe ser apoyada con otros estudios de laboratorio y con la clínica del paciente.
No debe utilizarse como una prueba de diagnóstico única, ya que no es un examen específico.

VI. Muestras

Recolección y preparación:

Las muestras pueden extraerse por punción venosa. Después de su completa coagulación, el suero se separa
para realizar las pruebas.

Sustancias que interfieren:

Los sueros muy lipémicos, hemolizados o muy contaminados por bacterias no deben ensayar se debido a la
posibilidad de reacciones inespecíficas. No se debe utilizar plasma porque el fibrinógeno puede falsear los
resultados. La placa debe enjuagarse con agua destilada inmediatamente luego de su empleo y secar con
gasa. Cuando la placa se lave con jabón o detergente hay que enjuagar cuidadosamente con agua destilada
debido que el residuo de jabón puede interferir con la reacción.

Condiciones de Almacenaje:

La PCR es relativamente estable y las muestras de suero, en casos que no se analicen inmediatamente, deben
almacenadas en la nevera a 2-8°C por un tiempo no mayor de 72 horas. Si la prueba se retrasara por un
período de tiempo mayor, se debe congelar a -20°C.

VII. Procedimiento

Prueba Cualitativa en lámina:

1. En una lámina de aglutinación de fondo oscuro de tres o seis anillos, seleccione uno de ellos para el control
positivo, otro para el control negativo y otro para el suero del paciente.

2. En los anillos correspondientes, añadir una gota de control positivo, una gota de control negativo y 50μl de
suero del paciente.

3. Agregar una gota de reactivo de látex anti-PCR a cada uno de los anillos antes mencionados.

4. Mezclar, utilizando palillos diferentes y extender por toda el área del anillo.

5. Realizar movimientos circulares durante dos minutos para garantizar la unión antígeno-anticuerpo.

6. Bajo una fuente de luz adecuada realice la lectura correspondiente.

En general las reacciones de aglutinación se interpretan de la siguiente manera:

•Resultado Negativo: Se observa una suspensión homogénea de las partículas de látex (Figura 3a).

•Resultado Positivo: Se observa la glutinación macroscópica de las partículas de látex, la cual se pueden
presentar según la siguiente escala:

1+: Grumos muy pequeños (Figura 3b).

2+/3+: Grumos medianos (Figura 3c).

3+/4+: Grumos grandes (Figura 3d).

Dibujo página 147

Figura 3: Tamaño relativo de los grumos formados de acuerdo a la intensidad de la reacción de aglutinación.

Prueba Semicuantitativa en lámina:

1. Con la finalidad de obtener el título de la prueba, realizar diluciones seriadas en tubo de acuerdo con las
recomendaciones del inserto del equipo a aquellos sueros que resulten positivos en la prueba Cualitativa.
2. Llevar a cabo el procedimiento cualitativo sobre cada dilución.

3. El título del suero corresponderá a la mayor dilución en donde se observé aglutinación mayor o igual a 1+.

4. Si se observa aglutinación en todas las diluciones del suero, se debe repetir la prueba realizando diluciones
mayores y seriadas a partir de la última dilución.

5. Si se conoce la sensibilidad del equipo que se está utilizando Ud puede calcular la concentración relativa de
PCR en la muestra examinada. La Concentración Relativa (CR) de PCR corresponde al producto de la
sensibilidad (S) por el inverso del título (T-1) (CR=S×T-1)

VIII. Observaciones

Al realizar la prueba, los reactivos y las muestras de suero deben haber alcanzado la temperatura ambiente.
Mezclar bien el reactivo de látex antes de usarlo, pues este tiende a sedimentar espontáneamente. Los
resultados deben ser leídos dentro de los dos minutos. Un prolongado tiempo de reacción puede causar
resultados falsos positivos debido al efecto de desecación. La intensidad de la aglutinación en la prueba
cualitativa no es indicativa de la concentración de PCR en la muestra. Una reacción débil puede ocurrir con
concentraciones marcadamente elevadas. Estas concentraciones elevadas pueden causar resultados falsos
negativos. Si el nivel de PCR es muy alto la aglutinación puede decaer debido al exceso de antígeno
(fenómeno zonal), por lo tanto se recomienda realizar un segundo ensayo a todos los sueros negativos a una
dilución 1/10.

Detección de Factores Reumatoideos

1. Introducción

Los Factores Reumatoideos (FR) son anticuerpos, caracterizados especialmente por su capacidad de
reaccionar con determinantes antigénicos presentes en la porción Fc de la molécula de IgG. Esta reacción da
lugar a la formación de inmunocomplejos capaces de fijar complemento y de actuar sobre las membranas
celulares y la pared vascular, provocando alteraciones (aumento de la permeabilidad y reacciones
inflamatorias) que finaente, conducen a la destrucción de la membrana sinovial, cartílago y hueso. Todo esto
es una reacción inmunológica que se produce en la artritis reumatoidea, enfermedad sistémica de causa
desconocida. Generalmente, son anticuerpos IgM, aunque pueden ser IgG o IgA. Estos anticuerpos se
detectan en suero y líquido sinovial.

Están disponibles varias pruebas para detectar FR en el laboratorio. Los FR se miden tradicionalmente en
suero por las pruebas clásicas de aglutinación de partículas de látex. La prueba de Waaler y Rose utiliza
eritrocitos de carnero (EC) sensibilizados con anticuerpos de conejo anti-EC. En la actualidad se van
imponiendo las técnicas de inmunoanálisis nefelométrico, turbidimétrico y ELISA.

II. Fundamento Metodológico:

Los sistemas analíticos aquí descritos incluyen el de aglutinación de látex en láminas. Estas pruebas tienen
amplia popularidad como procedimientos rápidos y semicuantitativos en muchos laboratorios clínicos por su
simplicidad, confiabilidad y disponibilidad de reactivos. El principio de está prueba es una reacción
inmunológica entre los FR presentes en el suero y la correspondiente IgG asociada a partículas de látex de
poliestireno. Si los FR están presentes, se produce la aglutinación del látex en láminas de aglutinación de
fondo oscuro y bajo una fuente de ilumación adecuada (Figura 1).

Dibujo página 152

Figura 1: Representación esquemática del fundamento de las pruebas de aglutinación pasiva (indirecta) para
la determinación de FR.

III. Utilidad Clínica

Diagnóstico serológico de Artritis Reumatoidea

La artritis reumatoidea es una enfermedad inflamatoria crónica, recidivante y sistémica que afecta
principalmente las articulaciones. Se estima que entre el 1 a 3% de la población de Estados Unidos, sufre de
está enfermedad, con una relación de mujeres a varones 3:1. Se presenta con mayor frecuencia entre los 30 y
50 años de edad, pero también puede ocurrir en niños. La enfermedad tiene un inicio característico en las
articulaciones pequeñas de manos y pies; progresa de manera centrípeta y simétrica. Los ancianos pueden
presentar afección de las articulaciones grandes proximales. Son frecuentes las deformidades. Las
manifestaciones extraarticulares son vasculitis, atrofia de piel y músculo, nódulos subcutáneos, neumonitis,
linfoadenopatía, esplenomegalia y leucopenia. Aún se desconoce la causa, sin embargo se propone que la
enfermedad es el resultado de una respuesta autoinmune desencadenada por un evento ambiental (cómo
infección) en un individuo genéticamente susceptible. No existe consenso respecto a la identidad de
infecciones iniciadoras potenciales o de otros eventos ambientales.

El dato serológico más importante en la artritis reumatoidea es el título elevado de los FR, los cuales se
identifican en 80% de los pacientes. A títulos mayores de 1:1.280 se consideran significativos de artritis
reumatoidea. Un 60% de pacientes con AR tienen factor reumatoideo en líquido sinovial (en las primeras
fases de la enfermedad sólo se encuentra aquí); por eso, se recomienda su determinación cuando el suero es
negativo.

Aunque todavía no se ha encontrado una curación específica, una terapia temprana resulta de gran valor
para detener o minimizar los daños irreversibles de las articulaciones; por este motivo, un pronto diagnóstico
es importante.

IV. Muestras:

1.- Recolección y preparación muestras

Las muestras pueden extraerse por punción venosa. La prueba debe efectuarse con suero. No debe
emplearse plasma, porque el fibrinógeno puede causar aglutinación no específica de las partículas de látex.

2.- Sustancias que interfieren

Una fuerte contaminación bacteriana puede causar una falsa aglutinación positiva. Los sueros intensamente
lipémicos no deben ensayarse debido a la posibilidad de reacciones no específicas.
3.- Condiciones de Almacenaje

Deben emplearse muestras frescas para realizar la prueba, ya que los FR son lábiles. En casos que no se
realicen los análisis inmediatamente, las muestras de suero deben almacenarse en la nevera a 2-8°C por un
tiempo no mayor de 72 horas. Si la prueba se retrasara por un período de tiempo mayor, se debe congelar a
-20°C.

4.- Preparación de la muestra

Antes de usar el suero, termoinactivarlo por 30 minutos en baño de agua a 56°C, esto permite inactivar al
C1q del sistema del complemento, que puede producir una reacción de aglutinación falsa positiva. Esto es
debido a la conformación molecular que tiene el C1q. El C1q es una proteína hexamérica, es decir está
formado por seis subunidades idénticas dispuestas en forma de un núcleo central con brazos radiales que se
proyectan en forma simétrica (Figura 2). Si el C1q está activado, éste puede unirse a las inmunoglobulinas
que están recubriendo las partículas de látex y producir la aglutinación aún en aquellas muestras donde no
hay factores Reumatoideos. El C1q se une al dominio CH2 de la IgG y al dominio CH3 de la IgM (Figura 3).

Primero dibujo página 154

Figura 2: Estructura molecular del C1q

Segundo dibujo página 154

Figura 3: Aglutinación de las partículas de látex por el C1q

V. Procedimiento

Prueba Cualitativa en lámina:

1. En una lámina de aglutinación de fondo oscuro de tres, seleccione uno de ellos para el control positivo,
otro para el control negativo y otro para el suero del paciente.

2. En los anillos correspondientes, añadir una gota de control positivo, una gota de control negativo y 50μl
del suero del paciente.

3. Agregar una gota de reactivo de látex a cada uno de los anillos antes mencionados.

4. Mezclar utilizando palillos diferentes y extender por toda el área del anillo.

5. A continuación realizar movimientos circulares durante dos minutos para garantizar la unión de los
elementos de la reacción.

6. Bajo una fuente de luz adecuada realice la lectura correspondiente.

En general las reacciones de aglutinación se interpretan la siguiente manera:

•Resultado Negativo: Se observa una suspensión homogénea de las partículas de látex.

•Resultaso Positivo: Se observa la aglutinación macroscópica de las partículas de látex, la cual se pueden
presentar según la siguiente escala:

1+: Grumos muy pequeños

2+/3+: Grumos medianos

3+/4+: Grumos grandes

Prueba Semicuantitativa en lámina:

1. Con la finalidad de obtener el título de la prueba, realizar diluciones seriadas de acuerdo a las
especificaciones de la casa comercial.

2. Llevar a cabo el procedimiento cualitativo sobre cada dilución.

3. El título del suero corresponderá a la mayor dilución en donde se observé aglutinación mayor o igual a 1+.

4. Si se observa aglutinación en todas las diluciones del suero, se debe repetir la prueba realizando diluciones
mayores y seriadas a partir de la última dilución.

VI. Limitaciones de la Prueba

En la población sana el factor reumatoideo es positivo en el 5% de los individuos, aunque en títulos bajos. En
personas mayores de 65 años, puede ser positivo en alrededor del 20%. Es importante destacar que el factor
reumatoideo no es específico de la artritis reumatoidea, por lo que hay varios estados reumáticos y procesos
inflamatorios del tejido conectivo que producen factores reumatoideos. Estos incluyen: síndrome de Sjögren,
esclerodermia, dermatomiositis, mononucleosis infecciosa, hepatitis viral, sarcoidosis, macroglobulinemia de
Waldenström, enfermedad hepática inflamatoria, sífilis, lepra, endocarditis bacteriana, tuberculosis, lupus
erimatoso sistémico diseminado. Se presentan en un 10-20% de pacientes con artritis reumatoidea (AR)
infantil.

Aunque la prueba determinación de factores reumatoideos puede resultar positiva en estos casos es
importante destacar que la misma no es utilizada para el diagnóstico de estás patologías.

VII. Observaciones:

Al realizar la prueba, los reactivos y las muestras de suero deben haber alcanzado la temperatura
ambiente.ezclar bien el reactivo de látex antes de usarlo, pues este tiende a sedimentar espontáneamente.
Los resultados deben ser leídos dentro de los 2 minutos. Un prolongado tiempo de reacción puede causar
resultados falsos positivos debido al efecto de desecación.

Determinación de Gonadotropina Coriónica Humana

I. Introducción
La GCh es una glucoproteína producida por el sincitiotrofoblasto, justo después que el óvulo fertilizado es
implantado en las paredes del útero. Similar a las hormonas hipofisiarias, está constituida por dos
subunidades Alpha y Beta. Mientras que la primera subunidad es compartida por la hormona
foliculoestimulante (FSH) y la hormona luteinizante (LH), la subunidad Beta confiere especificidad biológica e
inmunológica a cada una de estas hormonas.

Casi inmediatamente después de empezar su erosión endometrial, las células trofoblásticas comienzan a
secretar GCh hacia la sangre materna. Esta hormona tiene propiedades muy similares a la LH, pues la GCh
estimula poderosamente la secreción de esteroides y progesterona por parte del cuerpo lúteo durante las
primeras seis semanas del embarazo, lo cual es un factor importante en el mantenimiento de éste.

La secreción de GCh aumenta rápidamente hacia el inicio de la gestación, llegando a un pico entre los 60 a 80
días, contados a partir de la culminación del último período menstrual; luego decae con igual rapidez, de tal
manera que hacía el final del tercer mes ha alcanzado un nivel bajo, pero aún detectable en sangre y/o orina
(en la cual se excreta está hormona), que permanece más o menos constante hasta el final del embarazo. En
asociación con el decaimiento de la secreción de GCh, la placenta empieza a secretar grandes cantidades de
estrógeno y progesterona (Figura 1). Aunque la excreción de GCh en orina varía ampliamente en cada mujer
embarazada, se estima que el nivel medio de GCh en suero u orina es de aproximadamente 0,1 UI/mL al
primer día de falta menstrual.

La presencia de GCh en sangre u orina en los primeros días del embarazo es la base de las diversas pruebas
de laboratorio usadas para el diagnóstico precoz del embarazo. Sin embargo, la GCh no es específica del
embarazo pues pequeñas cantidades pueden ser secretadas por diversos tumores gestacionales o de las
células germinales y otros en ambos sexos.

II. Evolución Histórica de las Pruebas de Embarazo

A.- Pruebas Biológicas del Embarazo

Las primeras pruebas de embarazo dependían de la demostración de la presencia de GCh en la orina poredii
de pruebas con animales. La GCh inyectada a ratones y ratas provoca la ovulación acompañada de la
formación del cuerpo lúteo en el ovario de ratones hembras, la ovulación en conejos hembras y liberación de
esperma por parte de ranas machos. Sin embargo la hormona luteinizante (LH), la cual se encuentra en
elevadas concentraciones en la orina de mujeres sanas no embarazadas justo antes de la ovulación y en
mujeres posmenopáusicas, tiene la misma actividad biológica que la GCh. Por ello y por lo complejo de las
pruebas biológicas, este tipo de pruebas fueron sustituidas por métodos inmunológicos basados en la
reacción específica de un anticuerpo con su antígeno.

Dibujo página 198

Figura 1: Concentraciones de las hormonas placentarias durante el embarazo normal.

•Pruebas de embarazo que usan como reactivo sueros policlonales anti-GCh

Numerosos kits comerciales para el diagnóstico del embarazo utilizaron como reactivo sueros policlonales
que reaccionaban tanto con la subunidad Alpha como con la subunidad Beta de la GCh. El inconveniente de
este tipo de pruebas de embarazo era que los sueros policlonales anti-GCh, reaccionaban igualmente bien,
tanto con la LH Cómo con la GCh, lo cual reducía significativamente la especificidad de estás pruebas de
embarazo generando falsos positivos.

Por ello los investigadores disminuyeron la sensibilidad de las pruebas de embarazo que utilizan sueros
policlonales anti-GCh a un nivel que nunca reaccionara con las concentraciones más elevadas de LH que
puedan encontrarse en la orina de mujeres sanas no embarazadas o mujeres posmenopáusicas; es decir se
sacrifica la sensibilidad a fin de incrementar la especificidad. El principal inconveniente de estas pruebas era
su baja sensibilidad lo cual hacía imposible diagnosticar el embarazo en forma precoz.

•Pruebas de embarazo que usan como reactivo sueros monoclonales anti-GCh-Beta y/o monoclonales anti-
GCh-AlphaBeta

Posteriormente, surgió un grupo de equipos que utilizaban como reactivo un conjunto de anticuerpos
monoclonales; éstos reconocían en forma específica diferentes determinantes antigénicos de la subunidad
Beta de la molécula GCh (anti-GCh-Beta). Cómo está subunidad es totalmente diferente a la subunidad Beta
de la LH, el uso de monoclonales dirigidos contra está subunidad de la GCh incrementó enormemente la
especificidad de este tipo de pruebas y con ello también se incrementó la sensibilidad de las pruebas de
embarazo.

Algunas pruebas de embarazo combinaban estos anticuerpos monoclonales con un anticuerpo monoclonal
que reconocía un determinante confirmacional, específico para la GCh (anti-GCh-AlphaBeta) estos
monoclonales reaccionaban con la GCh intacta y no con ninguna de sus subunidades (Alpha ó Beta de la GCh)
lo cual proporcionaba una mejor discriminación de la LH (Figura 2).

Dibujo página 199

Figura 2: Anticuerpos monoclonales anti-GCh-AlphaBeta ofrecen la mejor discriminación, pues reconocen

específicamente la GCh.

También estaban disponibles en el mercado un conjunto de pruebas de embarazo que combinan sueros
policlonales con sueros monoclonales lo cual incrementaba enormemente la sensibilidad de la prueba.
Dependiendo del tipo de antisuero anti-GCh que se utilizará para el desarrollo de la prueba, ésta sería más o
menos sensible. Por ejemplo, si el suero anti-GCh era un suero policlonal la sensibilidad de la prueba sería
muy baja debido a que este tipo de sueros reaccionaban cruzadamente con la LH presente en orina de
mujeres sanas no embarazadas y mujeres posmenopáusicas y en consecuencia la realización de la prueba
debía hacerse más tardíamente, es decir era necesario esperar entre cinco y 15 días después de la falta
menstrual a fin de que la cantidad de GCh presente en orina fuera mayor y obtener así un resultado positivo.
Pero si el suero anti-GCh era un monoclonal anti-GCh-Beta la sensibilidad de la prueba sería elevada
pudiendo entonces diagnosticarse el embarazo más precozmente. De lo antes señalado se desprende que el
uso de antisueros monoclonales representó una extraordinaria ventaja en el diagnóstico precoz del
embarazo y en la actualidad los antisueros monoclonales anti-GCh siguen utilizados en el diagnóstico del
embarazo.
III. Métodos empleados para el diagnóstico del embarazo

A. Pruebas de Inhibición de la Aglutinación

Estás pruebas se fundamentan en la reacción de la GCh enlazada a partículas de látex con anti-GCh. La
Inhibición de esta reacción por la GCh contenida en la muestra en estudio se hace evidente mediante la
observación de una suspensión homogénea al realizar la prueba en placas de aglutinación. En este caso la
muestra de orina se pone en contacto con suero anti-GCh y partículas de látex que tienen absorbidas
moléculas de GCh en su superficie. La GCh presente en la orina de mujeres embarazadas, reaccionará con el
antisuero e inhibirá la aglutinación de las partículas de látex, observándose, entonces una suspensión
homogénea. En caso de ausencia de GCh en la muestra, los anticuerpos anti-GCh se unirán específicamente
con la GCh fijada a las partículas de látex produciéndose una aglutinación visible macroscópicamente (Figura
3).

Dibujo página 200

Figura 3: Representación esquemática del fundamento de las pruebas de inhibición de la aglutinación para la
determinación de GCh en orina o suero.

B. Pruebas de aglutinación pasiva (indirecta) reversa

En este caso la muestra de pone en contacto con el reactivo de látex portador de anticuerpos anti-GCh. Si la
muestra contiene GCh, ésta se unirá en forma específica a los anticuerpos absorbidos a la partícula de látex,
produciéndose aglutinación visible macroscópicamente (Figura 4).

Dibujo página 201

Figura 4: Representación esquemática del fundamento de las pruebas de aglutinación pasiva (indirecta)
reversa para la determinación de GCh en orina o suero.

C. Pruebas inmunoenzimáticas en fase sólida

Este tipo de pruebas se fundamenta en la técnica de ELISA o inmunoensayo enzimático, ya que la reacción
antígeno-anticuerpo se pone en evidencia gracias a la acción de una enzima conjugada a un anticuerpo, la
cual a su vez reacciona específicamente con un sustrato, generando un producto coloreado. En este caso, la
reacción ocurre en fase sólida, lo cual facilita su observación a simple vista.

Debido a lo antes mencionados y a la combinación de anticuerpos monoclonales y policlonales anti-GCh estás

pruebas son extraordinariamente sensibles lo cual permite hacer diagnóstico precoz del embarazo, esto
representa una ventaja extraordinaria frente a las pruebas de aglutininación. En la actualidad, las pruebas
inmunoenzimáticas en fase sólida han desplazado del mercado a las pruebas de aglutininación y pueden
encontrarse en dos presentaciones diferentes: las que se desarrollan en tiras de papel y las que se
desarrollan en pequeños estuches (Figura 5).

En la matriz sólida inerte existen tres zonas. La zona de reacción (R) en la cual se encuentran anticuerpos
monoclonales anti-GCh conjugados a una enzima, débilmente unidos a la matriz inerte. La segunda zona es la
zona de prueba (T) en la cual se encuentran anticuerpos policlonales anti-GCh y el sustrato de la enzima.
Finalmente la tercera zona o zona de control (C) en la cual se encuentra adherido un anticuerpo contra las Igs
de ratón (anticuerpo anti-ratón) y el sustrato de la enzima (Figura 6).

Primer dibujo página 202

Figura 5: Las pruebas inmunoenzimáticas en fase sólida para la determinación de GCh están disponibles en
dos formas de presentación en tiras (A) y en estuche (B).

Segundo dibujo página 202

Figura 6: La matriz inerte sobre la cual se desarrollan las pruebas inmunoenzimáticas para la determinación
de GCh presenta tres zonas: una de reacción (R), otra de prueba (T) y otra de control (C).

En el desarrollo de la prueba la muestra difunde por capilaridad hasta la zona de reacción, si la GCh se
encuentra presente en la muestra en estudio, ésta se unirá al anticuerpo monoclonal conjugado (AcMo*) al
enzima, formando un complejo GCh-AcMo*, el cual, cómo se encuentra débilmente unidos a la matriz inerte,
es movilizado por capilaridad hasta la zona de prueba. Allí otros epítopes de la GCh interacción am con el
anticuerpo policlonal. En la zona de control el exceso de AcMo* interactúa con el anticuerpo anti-ratón que
se encuentra en dicha zona inmovilizado. El enzima fijo es ahora capaz de actuar con el sustrato en ambas
zonas dando origen a dos bandas de color una en la zona de control y otra en la zona de prueba (Figura 7).

La ausencia de GCh se pone en evidencia por la ausencia de la banda coloreada en la zona de prueba, en este
caso los AcMo* es movilizado por capilaridad hasta la zona de prueba, donde no ocurre ningún tipo de
interacción con el anticuerpo policlonal quedando el AcMo* libre y por lo tanto sigue difundiendo por
capilaridad hasta la zona de control. En la zona de control el AcMo* libre interacción a con el anticuerpo anti-
ratón, fijándose y el enzima actúa sobre el sustrato ubicado en esta zona. En caso de que no se forme
ninguna banda o que se forme únicamente en la zona de prueba el resultado se considerará inválido. Esto
puede ser ocasionado por qué las tiras o los estuches estén dañados. De manera que, hay que repetir la
prueba con otro lote de tiras o estuches.

Dibujo página 203

Figura 7: Interpretación de los resultados.

IV. Obtención y preparación de la muestra

A. Orina

La muestras de orina deben recogerse en recipientes limpios y secos, libres de detergentes. Puede usarse
orina de cualquier período del día, sin embargo se prefiere la primera de la mañana que contiene la mayor
concentración de la hormona. Las orinas muy turbias deben ser filtradas o centrifugadas. No debe usarse
orina que contenga sangre, que esté contaminada o que de una reacción fuertemente alcalina. Las muestras
de orina pueden ser conservadas entre 2-8°C por un período de 72 horas o congeladas hasta por un año; las
orinas congeladas deben ser descongeladas antes de llevar a cabo la prueba e igualmente las muestras
refrigeradas deben alcanzar la temperatura ambiente antes de realizarse la prueba.

B. Suero

Tomar por punción venosa aséptica de 5-8 mL de sangre, permitir su completa coagulación a temperatura
ambiente y separar el suero del coágulo. Los sueros deben ser claros, libres de hemólisis y sin evidencias
visibles de contaminación bacteriana. No debe usarse plasma. En caso de no poder llevar a cabo la prueba
dentro de las primeras 12 horas a partir de la recolección de la muestra, ésta puede guardarse bajo
refrigeración entre 2-8°C por 48 horas o congelada a -20°C durante una semana. Antes de llevar a cabo la
prueba es necesario llevar las muestras a temperatura ambiente.

VI. Utilidad Clínica de la determinación de GCh

La interpretación usual de un resultado positivo es el embarazo; no obstante, es posible observar la presencia

de niveles incrementado de la GCh en orina y/o suero en ciertas condiciones patológicas asociadas a tumores
gestacionales, tumores de las células germinales que contengan elementos tromboblásticos y en pacientes
con ciertos tumores de hígado, mamá, estómago, páncreas y pulmón. Los niveles de GCh son proporcionales
al grado de enfermedad en tal caso la determinación cuantitativas de GCh en orina de 24 horas mediante
ELISA o quimioluminiscencia es una excelente herramienta a fin de diagnosticar y seguir el curso de la
enfermedad.

VII. Limitaciones de las pruebas

Se sabe que la hematuria, proteinuria y/o contaminación bacteriana son causas de resultados erróneos.
Diferentes sustancias, tales como acetaminofen, ácido acetilsalicílico, cafeína, glucosa, hemoglobina,
triglicéridos, y bilirrubina entre otras, también pueden conducir a resultados erróneos.

Cabe destacar que un embarazo normal no es distinguible de un embarazo ectópicos basado en los niveles
presentes de GCh. También, un aborto espontáneo podría causar resultados confusos a la hora de hacer la
interpretación de los resultados. Resultados falsos negativos pueden obtenerse cuando la cantidad de GCh
presente en la muestra es inferior a la sensibilidad de la prueba.

VIII. Senbilidad de las pruebas

Anteriormente, cuando se usaban las pruebas de aglutinación un resultado positivo podía obtenerse entre el
cinco y quince días después de la falta menstrual; no obstante en la actualidad debido a la disposición de las
pruebas inmunoenzimáticas en fase sólida, cuya sensibilidad es de alrededor de 25 mUI/mL, un resultado
positivo puede obtenerse en el primer día de falta menstrual.