Pruebas para detección de
antígeno-anticuerpo
Inmunofluorescencia
Mgtra. Brechla Moreno A.
Laboratorio de Inmunología
Inmunofluorescencia
La fluorescencia es la propiedad que tienen ciertos elementos
químicos denominados fluoróforos o fluorocromos (isotiocianato de
fluoresceína, rodamina) de absorber una luz de una longitud de onda
determinada (por ejm. Luz azul) y luego emiten otra luz de una mayor
longitud de onda (amarillo, verde, rojo).
La inmunofluorescencia es una técnica de inmunomarcación, donde
los anticuerpos unidos químicamente a una sustancia fluorescente para
demostrar la presencia de una determinada molécula.
Pasos claves de la Inmunofluorescencia
Fijación: preservar la estructura
del material biológico
manteniéndolo lo más intacto y
real, como si fuese in vivo.
Glutaraldehído, paraformaldehído,
metanol/acetona.
Permeabilización: métodos o
compuestos que producen poros en
la membrana celular que permitirá
el ingreso de los Acs a las células, si
se desea detectar estructuras
internas.
Pasos claves de la Inmunofluorescencia
Bloqueo: sustancias que impiden
las interacciones inespecíficas de
los Acs con el material biológico a
analizar. Albúmina bovina sérica.
Inmunodetección: la unión
específica y de alta afinidad que
se da mediante el reconocimiento
de los Acs a otras moléculas
(material biológico).
Inmunofluorescencia Directa
La presencia de antígenos se da en un solo paso.
La muestra del paciente se fija a un portaobjetos y se agrega una solución
de anticuerpos específicos marcados con fluoresceína. Luego de una
incubación, se lava para eliminar restos de anticuerpos no reaccionantes y
se observa con microscopio de luz UV.
La presencia de elementos fluorescentes indica reacción positiva. Se
aplica especialmente en el diagnóstico de sífilis, infecciones por virus
respiratorios, uretritis y endocervicitis por Chlamydia trachomatis, etc
Inmunofluorescencia Indirecta
Se utilizan portaobjetos con el antígeno contra el cual se desea
estudiar la presencia de anticuerpos. Se agrega el suero del paciente,
se incuba y se lava para eliminar las sustancias no reaccionantes.
Finalmente se agrega una inmunoglobulina anti inmunoglobulinas
totales, anti IgG o anti IgM y luego se observa al microscopio de luz UV.
La presencia de elementos fluorescentes indica reacción positiva.
Esta técnica puede aplicarse para la detección de anticuerpos del tipo
IgG o IgM para diagnosticar un gran número de enfermedades
infecciosas como ser Sífilis, Herpes, Listeriosis, Chagas, Toxoplas-
mosis, infecciones por Mycoplasmas, Chlamydias y Rickettsias, etc.
Instrumentación
Reactivos
Placas
Anticuerpos
Solución lavadora
Microscopio
fluorescencia
Cubetas
micropipetas
https://www.youtube.com/watch?v=xqvHsIWETjs
IFD & IFI
Ventajas Ventajas
Alta especificidad Sensible y especifico
Posibilidad de detección de Reproducible
proteínas intracelulares
Mismo conjugado puede ser
usado en sistemas diferentes
Desventajas
Alto costo de los microscopios Desventajas
Necesidad de conjugados para Alto costo de los microscopios
cada antígeno que se va
Subjetividad de la lectura
identificar
Sin automatización
Subjetividad de la lectura
Aplicaciones
Detección de moléculas de complemento
Cuantificación de inmunoglobulinas
Diagnostico de enfermedades cutáneas
Diagnostico de neoplasias
Detección de virus, bacterias, hongos
Observación de biopsias
TOXOPLASMA ADENOVIRUS
https://micro.magnet.fsu.edu/primer/virtual/fluorescence/index.html
TRYPANOSOMA LEISHMANIA
ANTICUERPOS
INMUNOGLOBULINAS
Proteínas sintetizadas por los linfocitos B, capaces de reconocer y unirse
con alta afinidad a otras moléculas.
4 cadenas polipeptídicas: 2 Heavy
o pesadas y 2 Light o livianas
Unidas por puentes o uniones de
disulfuro
• El Ag es reconocido por la
región variable del Ac –Fab-
• La parte del Ag reconocida
por el Ac se denomina
epítope.
Acs monoclonales vs Acs policlonales
Anticuerpos policlonales: son Acs producidos por diferentes clones de
linfocitos, dando lugar a una mezcla heterogénea de Acs que reconocen
distintos epitopes de un mismo Ag.
Acs monoclonales vs Acs policlonales
Anticuerpos monoclonales: Acs producidos por un único clon de linfocitos,
dando lugar a una mezcla de Acs homogéneos que reconocen el mismo
epitope de un Ag.
PREGUNTAS
PR
