TecnicBasicas Colif Tot Fecales Ecoli NMP 6529

Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009.
Tcnicas para el
Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
Mtodo para la determinacin de bacterias coliformes, coliformes

fecales y Escherichia coli por la tcnica de diluciones en tubo
mltiple (Nmero ms Probable o NMP)
OBJETIVOS
Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos
coliformes fecales.
Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante la
bsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y
Escherichia coli.
Organizar e interpretar los resultados.
GENERALIDADES
Debido a que un gran nmero de enfermedades son transmitidas por va fecal-oral
utilizando como vehculo los alimentos y el agua, es necesario contar con
microorganismos que funcione como indicador de contaminacin fecal. Estos
deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener
una sobrevivencia similar a la de los patgenos intestinales y debe de ser capaces
de desarrollarse extraintestinalmente.
El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin
embargo, las caractersticas de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse
fuera del intestino tambin se observan en aguas potables, por lo que el grupo
coliforme se utiliza como indicador de contaminacin fecal en agua; conforme
mayor sea el nmero de coliformes en agua, mayor ser la probabilidad de estar
frente a una contaminacin reciente.
Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no slo sobreviven, sino que se
multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado
distinto al que recibe en el agua. En productos alimenticios que han recibido un
tratamiento trmico (pasteurizacin, horneado, coccin, etc.), se utilizan como
indicadores de malas prcticas sanitarias.
Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogneo con hbitat
primordialmente intestinal para la mayora de las especies que involucra.
El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gramnegativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la
lactosa con produccin de gas en un lapso mximo de 48 h. a 35C 1C. Este
Versin para Administrador de Manuales y Documentos
(AMyD). Facultad de Qumica, UNAM
1
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el
grupo esta conformado por 4 gneros principalmente: Enterobacter, Escherichia,

Citrobacter y Klebsiella.
El grupo de coliformes fecales, est constituido por bacterias Gram-negativas
capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas a las 48 h. de incubacin a
44.5 0.1C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la ms
prominente es Escherichia coli.
La demostracin y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse
mediante el empleo de medios de cultivo lquidos y slidos con caractersticas
selectivas y diferenciales.
Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado
dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias entricas), existe como
comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, hay
algunas cepas de E. coli patgenas que provocan enfermedades diarreicas. Estas
E. coli se clasifican con base en las caractersticas que presentan sus factores de
virulencia nicos, cada grupo provoca la enfermedad por un mecanismo diferente.
Las propiedades de adherencia a las clulas epiteliales de los intestinos grueso y
delgado son codificadas por genes situados en plsmidos. De manera similar las
toxinas son mediadas por plsmidos o fagos.
Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli
enterotoxignica (ETEC), E. coli enteropatgena (EPEC), E. coli
enterohemorrgica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa
(EAEC) E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han
sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras estn
implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos
contaminados.
Escherichia coli enterotoxignica ETEC es reconocida como el agente causal
de la diarrea del viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin
fiebre. Este tipo de infecciones es muy frecuente en pases subdesarrollados y
afecta principalmente a los nios.
Patognesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una
toxina termolbil de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y
funcin es similar a la toxina del clera, la otra toxina que produce es termoestable
y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de resistir temperaturas de
ebullicin hasta por 30 minutos.
La infeccin puede ser adquirida por el consumo de alimentos como vegetales
frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido
calculada en aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jvenes y ancianos
la dosis infectiva puede ser ms baja.

2
Escherichia coli enteropatgena ECEP. Es causa importante de diarrea en los

lactantes particularmente en los pases en vas de desarrollo. La ECEP se adhiere
a las clulas de la mucosa del intestino delgado. Sus factores de virulencia
favorecen la adhesin y en ocasiones penetra a las clulas mucosas. La infeccin
por ECEP provoca diarrea acuosa generalmente autolimitada aunque en
ocasiones puede ser crnica.
Patognesis. El microorganismo produce dos protenas: la intimina que es
codificada por el gen eae y un factor de adherencia que es codificado por un
plsmido, ambas protenas permite su unin a los enterocitos y la destruccin de
las microvellosidades intestinales.
Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua
contaminada y productos crnicos. En estudios con voluntarios se encontr que la
dosis infectiva es de 106 microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado
con mltiples serotipos especficos de E. coli los cuales pueden ser identificados
mediante la tipificacin del antgeno O (somtico) y en ocasiones del antgeno H
(flagelar).
Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra
estrechamente relacionado con el gnero Shigella, produce una enfermedad
similar a la shigelosis. La enfermedad se presenta comnmente en nios de
pases subdesarrollados y en personas que viajan a dichos lugares. La EIEC
provoca la enfermedad (diarrea disentrica invasiva) al invadir las clulas
epiteliales de la mucosa intestinal.
A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos,
en el caso de EIEC la dosis infectiva es de aproximadamente 106 bacterias.
Algunas caractersticas importantes de este microorganismo que permiten
diferenciarlo de la cepa tpica de E. coli son: No utiliza la lactosa como fuente de
carbono, no descarboxilan la lisina, es inmvil y anaerogenicos.
La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y
destruir el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los
fagolisosomas.
Escherichia coli enterohemorrgica EHEC produce verotoxina, denominada as
por su efecto citotxico sobre las clulas Vero, una lnea de clulas renales de
monoverde africano. Existen al menos dos variantes antignicas de la toxina. La
ECEH se ha asociado con colitis hemorrgica, una variedad grave de diarrea; y
con el sndrome urmico hemoltico, enfermedad capaz de producir insuficiencia
renal aguda, anemia hemoltica microangioptica y trombocitopenia. La verotoxina
tiene muchas propiedades similares a la toxina shiga producida por algunas cepas
de Shigella dysenteriae tippo 1; De los serotipos de E. coli que producen la
verotoxina el ms comn y el nico que puede identificarse en muestras clnicas
es el O157:H7. La E. coli O157:H7 no emplea sorbitol y es negativa a la prueba
de MUG.
3
La causa ms comn de esta infeccin es el consumo de carne sin cocinar o poco

cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los
casos de colitis hemorrgica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse
mediante la coccin completa de la carne
En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y sntomas causados por
las cepas de Escherichia coli antes descritas.
Propiedades y sntomas causados por algunas cepas de Escherichia coli
patgenas
ETEC
EPEC
EHEC
EIEC
Toxina
Lbil/estable Shiga o vero
Invasiva
Enterohemolisina -
Aspecto de las
heces
Presencia de
leucocitos en
heces
Fiebre
Aguadas
Aguadas
Aguadas muy Mucoides y
sanguinolentas sanguinolentas sanguinolentas
baja
Intiminas
Intestino
involucrado
Dosis infectiva
Serotipos
Colon y parte
baja del
delgado
Alta
Delgado
Delgado
Colon
Alta
Alta
O26, O111 y
otros
baja
O157:H7, O26,
Varios
O111 y otros
varios
FUNDAMENTO
La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del
Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo
microbiano de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a
35C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales
biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase
confirmativa.
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de
sodio el cual permite la recuperacin de los microorganismos daados que se
4
encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa

como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de
cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el
desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares
como el verde brillante.
La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes
fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se
fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir
gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1C por un periodo de
24 a 48 h.
La bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo
EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales
(Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las
pruebas bioqumicas bsicas (IMViC) a las colonias tpicas.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES
1. Para anlisis de agua
Para la preparacin del medio de cultivo utilizado en la prueba presuntiva de
muestras de agua o hielo, consultar el cuadro 1.
5 10 tubos de 22 x 175 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio o

caldo lactosado concentracin doble o triple con campana de Durhama.
5 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con
campana de Durhamb.
5 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC y campana de Durham
o caldo EC MUG con campana de Durham b.
2 cajas Petri con agar para mtodos estndar d
2 cajas Petri con agar Eosina azul de metileno c
6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe
3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIM (opcional)e
3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de caldo citrato de Koser o citrato de
Simmons (opcional)e
2. Para anlisis de alimentos

1 matraz de 250 mL con 90.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solucin
amortiguadora de fosfatosa
2 tubos de 16 x 150 mm con 9.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solucin
amortiguadora de fosfatosa

5
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio

concentracin sencilla o caldo lactosado concentracin sencilla con campana
de Durhama
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con
campana de Durhamb.
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC o EC-MUG con campana
de Durhamb.
2 cajas Petri con agar para mtodos estndard
2 cajas Petri con agar Mac Conkeyc
6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe
3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIMe
3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de citrato de Simmons, o caldo citrato de
Kosere
SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES
Frascos gotero con reactivo de Erlich o Kovace

Frascos gotero con indicador rojo de metiloe
Frascos gotero con reactivo alfa naftol VP1e
Frascos gotero con solucin de hidrxido de potasio al 40 % VP2e
COLORANTES PARA TINCIN DE GRAMd
MATERIAL Y EQUIPO
Mechero, a,b,c,d,e.
Propipetaa.
Gradillaa,b,c,e.
Balanza granatariaa.
Stomachera
Bolsas para stomacher .
Lmpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)c
Lentes de seguridadc
Pipetas de 10.0 mL estriles con tapn de algodna.
Pipetas de 1.0 mL estriles con tapn de algodna.
Pipetas Pasteur estriles a, b, c, d
Asa bacteriolgicab,c,d,e
Portaobjetosd
Microscopio pticod
Termmetro calibradob
Bao de agua a 44.5 0,1C.b
Incubadora a 35 2,0Ca.
Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180Ca
Autoclavea
6
NOTAS
a
Material necesario al inicio de la prctica.
b
Material necesario a las 48 h. de iniciada la prctica.
c
d
e

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Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed.
Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
DETERMINACIN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA Y HIELO POTABLES

37C
24 - 48 h
Tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato

de sodio (CLSS) triple concentracin (3X)
CLSS + 20.0 mL de muestra
2 a 3 asadas/tubo
Siembra con asa bacteriolgica de los tubos

positivos (produccin de gas) en caldo lactosa
verde brillante bilis 2% y caldo EC
2 a 3 asadas/tubo
44.5C
37C
24 48 h
Tubos con 10.0 mL de

Caldo Lactosa verde
brillante bilis 2%
Lectura de tubos positivos en

tablas. NMP de coliformes
totales /100 ml de muestra
24 48 h

Caldo EC o EC-MUG

fecales /100 ml de muestra.
Siembra de tubos positivos en

placas de Agar EMB para la
bsqueda de Escherichia
coli

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Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed.
Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
DETERMINACIN DEL NMP DE COLIFORMES EN MUESTRAS SLIDAS O ALIMENTOS

Pesar 10.0 g de muestra
en condiciones de asepsia
Homogenizar la muestra
con 90.0 mL de solucin diluyente
Realizar 2 diluciones decimales ms en

tubos con 9.0 mL de solucin diluyente
1.0 mL
1.0 mL
Sembrar por triplicado
cada dilucin en tubos
de caldo lauril sulfato de
sodio (1X)
10-1
10-2
10-3
35C
24 - 48 h
10-1
10-2
10-3
10-1
10-2
Siembra con asa bacteriolgica de los tubos

positivos (produccin de gas) en caldo lactosa
verde brillante bilis 2% y caldo EC
Tubos con 10.0 mL de CLSS concentracin

sencilla (1X) + 1.0 mL de muestra
35C
44.5C
24 - 48 h
10-1
10-2

Caldo Lactosa verde
brillante bilis 2%
10-3
24 - 48 h
10-1
10-2
10-1
10-2
10-1
10-2

Caldo EC o EC-MUG
fecales /g de muestra.
totales
de muestra
Versin
para/g
Administrador
de Manuales y Documentos
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Siembra de tubos positivos en
agar Mac Conkey para
bsqueda de Escherichia coli
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el Anlisis
Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
PROCEDIMIENTO
1. Agua y hielo
1.1 Prueba presuntiva
Agitar la muestra y transferir volmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada uno de

los tubos con caldo lauril sulfato de sodio que se hayan seleccionado. Agitar los
tubos para homogeneizar la muestra.
CUADRO 1. Preparacin de inculo con caldo lauril sulfato de sodio
INOCULO
(mL)
CANTIDAD DE
MEDIO POR
TUBO (mL)
VOLUMEN DE CALDO LAURIL

MEDIO MAS
TRIPTOSA
INOCULO
REQUERIDO g/L
(mL)
CONCENTRACIN
10 o ms
11 o ms
35,6
1X
10
10
20
71,2
2X
10
20
30
53,4
1.5 X
20
10
30
106,8
3X
100
50
150
106,8
3X
100
35
135
137,1
3.5 X
100
20
120
213,6
4X
Incubar los tubos a 35 0,5C. Examinar los tubos a las 24 h. y observar si hay
formacin de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se
observa produccin de gas, incubar 24 h. ms.
1.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba

presuntiva, a otro tubo de 16 x150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante
(brila), con campana de Durham.
Agitar los tubos para su homogeneizacin.
Incubar a 35 2C durante 24 a 48 h..

10
Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento)

y produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h..
Consultar la tabla 1 2 de NMP para conocer el nmero ms probable de

organismos coliformes totales/100 mL.
1.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.

presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC
conteniendo campana de Durham.
Incubar a 44.5 0.1C en incubadora o un bao de agua durante 24 a 48 h.
Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y

produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h.
Consultar la tabla 1 2 de NMP para conocer el nmero ms probable de

organismos coliformes fecales/ 100 mL.
Control de calidad
1. Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de
Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.
1.4 Prueba confirmativa para Escherichia coli
Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y sembrar por
estra cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.
Incubar las placas invertidas a 35C por 18-24 h.
Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfologa colonial:

Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metlico. Si no hay colonias con
morfologa tpica, probar una o ms colonias lo ms parecido E. coli de cada placa y
sembrarlas en agar cuenta estndar para realizar las pruebas de morfologa
microscpica y pruebas bioqumicas.
Incubar las placas a 35C por 18-24 h.
Hacer un frotis y teirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos

cortos o cocobacilos Gram-negativos.

11
1.4.1 Identificacin bioqumica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC).

a. Produccin de indol (I)
Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 35C por 24 2 h.
Adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de Kovacs.
La presencia de una coloracin roja en la superficie del tubo se considera una

prueba positiva.
b. Produccin de cidos mixtos (Rojo de metilo, RM)
Inocular un tubo adicional con caldo RM-VP e incubar a 35C por 48 2 h.
Adicionar 5 gotas de solucin de rojo de metilo.
Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color

amarillo es una prueba negativa.
c. Produccin de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)
Inocular un tubo con caldo RM-VP e incubar a 35C por 48 2 h.
Adicionar 0.6 mL de solucin VP1 y 0.2 mL de solucin VP2 y agitar.
Dejar reposar durante 10 minutos sin agitar el tubo; se considera una prueba
positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.
d. Utilizacin del citrato (C)
Inocular un tubo con caldo citrato de Koser o Simmons un inculo ligero para evitar
turbiedad en el tubo (opcional: puede utilizarse citrato de Simmons)
Incubar a 35C por 96 h.
El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad del medio, se considera una
prueba positiva.
NOTAS
Para determinar la produccin de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al
agar SIM. Este medio se inocula por picadura con el asa bacterioogca de forma recta.
12
Se incuba a 35C por 24 2 h. Finalizado el periodo de incubacin se adiciona el

reactivo de Kovac o Erlich cuyo fundamento es el mismo.
Para determinar la utilizacin del citrato de sodio como nica fuente de carbono,
tambin se puede utilizar el agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se
inocula en la superficie (pico de flauta). Se incuba a 35C de 24 a 48 h. La presencia
de una coloracin azul debida al vire del indicador que contiene el medio, indica prueba
positiva
1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG
(4 metil-umbeliferil-
-D-glucuronido)
FUNDAMENTO
Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de
gas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato especfico
4-metilumbeliferil-beta-D-glucurnido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser
expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una
fluorescencia azul fcil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se
puede identificar Escherichia coli.
a. Prueba confirmativa
A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) y de cada tubo que muestre formacin de
gas , tomar una asada y sembrar en un nmero igual de tubos con medio de
confirmacin EC-MUG.
Incubar a 44,5 0,2C en bao de agua durante 24 h., observar si hay formacin de
gas; si no se observa la formacin de gas continuar la incubacin 24 h. ms.
Irradiar los tubos con una fuente de luz UV, observar fluorescencia y hacer la
lectura.
Utilizar estos resultados para calcular el nmero ms probable (NMP) de E. coli.
Control de calidad
Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K.
pneumoniae como control negativo.

13
2. Alimentos
2.1 Preparacin de la muestra.
Moler 10.0 gramos de la muestra en un picador 2 veces o con cubiertos estriles y

mezclar.
Adicionar el alimento a 90.0 mL de agua peptonada al 0.1 %, licuar y dejar en

reposo de 2-3 minutos.
Realizar diluciones hasta 10- 3 g/mL con agua peptonada al 0.1 %. En caso de
trabajar con muestras congeladas, descongelarlas previamente entre 2 y 5 C.
2.1.1 Prueba presuntiva.
Aadir 1.0 mL de la dilucin 10- 1 g/mL a cada uno de 3 tubos con 10.0 mL de caldo
lauril sulfato de sodio.
Aadir 1.0 mL de las diluciones 10- 2 g/mL y 10- 3 g/mL a dos series de 3 tubos cada
una con caldo lauril sulfato de sodio.
Incubar a 35-37C durante 24-48 h.
Los tubos despus de la incubacin, se registrarn como positivos si presentan

crecimiento y produccin de gas.
2.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

presuntiva a otro tubo de 16 x 150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante
(brila), con campana de Durham.
Incubar a 35 2C durante 24 a 48 h.
Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe crecimiento y

produccin de gas, despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h.
Consultar las tablas de NMP que se encuentran en el anexo para conocer el

nmero ms probable de organismos coliformes totales por mL.
2.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.

14

presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC
conteniendo campana de Durham.
Incubar a 44.5 0.1C en incubadora o un bao de agua durante 24 a 48 h.
Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe turbidez y produccin
de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h.
Consultar la tabla de NMP (ANEXO) para conocer el nmero ms probable de

organismos coliformes fecales por mL.
Control de calidad
Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y
una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las
muestras.
2.4 Prueba confirmatoria de Escherichia coli.
Confirmar la presencia de Escherichia coli en por lo menos el 10% de las pruebas

con resultados positivos de coliformes fecales; sembrar en placas de agar
McConkey a partir de los tubos que demostraron la presencia de gas en la prueba
confirmativa.
Incubar las placas a 35 0.5C durante 24 2 h., observar las colonias tpicas
fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitacin de sales
biliares.
Hacer tincin de Gram para observacin de la morfologa de las bacterias.
Seleccionar 1 o ms colonias aisladas para realizar pruebas IMViC.
Todos los cultivos que:
Fermenten la lactosa con produccin de gas dentro de las 48 h. a 35C.
Sean bacilos o cocobacilos Gram-negativos no esporulados
Se obtenga las siguientes combinaciones para el IMVIC: Biotipo 1(++--) o Biotipo 2 (+--) son consideradas como Escherichia coli.
Calcular el NMP de E. coli basndose en la proporcin de los tubos positivos de
caldo EC.

15
CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS

Calcular la densidad microbiana con base en el nmero ms probable conforme al
procedimiento sealado en la tabla 1, (que se muestra a continuacin y es utilizado para
el anlisis de agua), para estimar la poblacin de bacterias coliformes totales, bacterias
coliformes fecales y Escherichia coli de acuerdo con las diluciones empleadas.
Expresar en NMP/g o mL para alimentos y NMP/100 mL para agua. En el caso de usar
volmenes de 20 mL de muestras de agua en 5 tubos o 10 mL de muestras de agua en
10 tubos, utilizar las siguientes tablas:
TABLA 1. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con
20 mL de muestra de agua o hielo.
No. de Tubos
positivos
0
1
2
3
4
5
NMP/100 mL
<1,1
1,1
2,6
4,6
8,0
>8,0
95% de Lmite de Confianza (aproximado)

Inferior
Superior
0
3,0
0,05
6,3
0,3
9,6
0,8
14,7
1,7
26,4
4,0
Infinito
TABLA 2. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con
10 mL de muestra de agua o hielo.
No. de Tubos
Positivos
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
NMP/100 mL
<1,1
1,1
2,2
3,6
5,1
6,9
9,2
12,0
16,1
23,0
>23,0
95% de Lmite de Confianza (aproximado)

Inferior
Superior
0,0
3,0
0,03
5,9
0,26
8,1
0,69
10,6
1,3
13,4
2,1
16,8
3,1
21,1
4,3
27,1
5,9
36,8
8,1
59,5
13,5
Infinito

16
BIBLIOGRAFA
NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-145-SSA1-1995. Productos crnicos
troceados y curados. Productos crnicos curados y madurados. Disposiciones
y especificaciones sanitarias. Apndice normativo B. De la estimacin de la
densidad microbiana por la tcnica de nmero ms probable.
CCAYAC-M-004 (2006) Estimacin de la densidad microbiana por la tcnica
del nmero mas probable, deteccin de coliformes totales, cliformes fecales y
Escherichia coli por el nmero mas probable
Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9th
ed. Arlington, VA: AOAC.
Madigan, M T y Martinko, J M., Brock, Biology of Microorganisms, 11a ed.
2006, pp 935-936
Brooks, Geo F., Batel, Janet S. y Morse, Stephen A., Microbiologa Mdica de
Jawetz. Manual Moderno 17a Edicin 2002, pp 274-275
Kornacki J.L. & Johnson J.L. (2001) Enterobacteriaceae, Coliforms, and
Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In: Compendium of
Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito
K. (Eds.) APHA. Washington. 69-82.
International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005)
Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall. 2nd ed.
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

17

TecnicBasicas Colif Tot Fecales Ecoli NMP 6529

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Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009.

Mtodo para la determinacin de bacterias coliformes, coliformes

grupo esta conformado por 4 gneros principalmente: Enterobacter, Escherichia,

Versin para Administrador de Manuales y Documentos

Escherichia coli enteropatgena ECEP. Es causa importante de diarrea en los

La causa ms comn de esta infeccin es el consumo de carne sin cocinar o poco

encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa

5 10 tubos de 22 x 175 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio o

2. Para anlisis de alimentos

Versin para Administrador de Manuales y Documentos

15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio

SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES

Frascos gotero con reactivo de Erlich o Kovace

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DETERMINACIN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA Y HIELO POTABLES

Tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato

CLSS + 20.0 mL de muestra

Siembra con asa bacteriolgica de los tubos

Tubos con 10.0 mL de

Lectura de tubos positivos en

Tubos con 10.0 mL de

Lectura de tubos positivos en

Siembra de tubos positivos en

Versin para Administrador de Manuales y Documentos

DETERMINACIN DEL NMP DE COLIFORMES EN MUESTRAS SLIDAS O ALIMENTOS

Realizar 2 diluciones decimales ms en

Siembra con asa bacteriolgica de los tubos

Tubos con 10.0 mL de CLSS concentracin

Tubos con 10.0 mL de

Lectura de tubos positivos en

Agitar la muestra y transferir volmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada uno de

CUADRO 1. Preparacin de inculo con caldo lauril sulfato de sodio

VOLUMEN DE CALDO LAURIL

1.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba

Agitar los tubos para su homogeneizacin.

Incubar a 35 2C durante 24 a 48 h..

Versin para Administrador de Manuales y Documentos

Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento)

Consultar la tabla 1 2 de NMP para conocer el nmero ms probable de

1.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba

Agitar los tubos para su homogeneizacin.

Incubar a 44.5 0.1C en incubadora o un bao de agua durante 24 a 48 h.

Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y

Consultar la tabla 1 2 de NMP para conocer el nmero ms probable de

Incubar las placas invertidas a 35C por 18-24 h.

Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfologa colonial:

Incubar las placas a 35C por 18-24 h.

Hacer un frotis y teirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos

Versin para Administrador de Manuales y Documentos

1.4.1 Identificacin bioqumica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC).

Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 35C por 24 2 h.

Adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de Kovacs.

La presencia de una coloracin roja en la superficie del tubo se considera una

b. Produccin de cidos mixtos (Rojo de metilo, RM)

Inocular un tubo adicional con caldo RM-VP e incubar a 35C por 48 2 h.

Adicionar 5 gotas de solucin de rojo de metilo.

Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color

c. Produccin de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)

Inocular un tubo con caldo RM-VP e incubar a 35C por 48 2 h.

Adicionar 0.6 mL de solucin VP1 y 0.2 mL de solucin VP2 y agitar.

d. Utilizacin del citrato (C)

Incubar a 35C por 96 h.