UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIA, TECNOLOGÍA E INGENIERÍA
DE ALIMENTOS

CUENTA TOTAL ESTÁNDAR DE MICROORGANISMOS MESÓFILOS

AEROBIOS EN ALIMENTOS Y MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE

PARA EL ANÁLISIS DE COLIFORMES FECALES EN ALIMENTOS

CURSO : Microbiología de Alimentos II

PROFESOR : Ing. Víctor E. Condori Rondan

ALUMNOS : Cuya Cordova Max

Lope Condori Stefany Cristell
Tangoa Reyna Wendy

CICLO : 2020-0

TINGO MARÍA – PERÚ

2020
 I. INTRODUCCIÓN

Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas

por vía fecal-oral utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario
contar con microorganismos que funcione como indicador de contaminación
fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia
fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y
debe de ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente. El grupo coliforme
es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin embargo, las
características de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse fuera del
intestino también se observan en aguas potables, por lo que el grupo coliforme
se utiliza como indicador de contaminación fecal en agua; conforme mayor sea
el número de coliformes en agua, mayor será la probabilidad de estar frente a
una contaminación reciente. Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no
sólo sobreviven, sino que se multiplican, por lo que en los alimentos el grupo
coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. En
productos alimenticios que han recibido un tratamiento térmico (pasteurización,
horneado, cocción, etc.), se utilizan como indicadores de malas prácticas
sanitarias. Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogéneo
con hábitat primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que
involucra. El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos
Gramnegativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que
fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a
35°C ± 1ºC. Este grupo esta conformado por 4 géneros principalmente:
Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. Escherichia coli es un bacilo
corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia
Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), existe como comensal en el intestino
delgado de humanos y animales. Sin embargo, hay algunas cepas de E. coli
patógenas que provocan enfermedades diarreicas. Estas E. coli se clasifican
con base en las características que presentan sus factores de virulencia únicos,
cada grupo provoca la enfermedad por un mecanismo diferente. Las
propiedades de adherencia a las células epiteliales de los intestinos grueso y
delgado son codificadas por genes situados en plásmidos. De manera similar
las toxinas son mediadas por plásmidos o fagos. Este grupo de bacterias se
encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli enterotoxigénica (ETEC),
E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli
enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) E. coli enteroadherente
difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han sido perfectamente
caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras están implicadas en
intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos contaminados.

1.1. OBJETIVOS
 Cuantificar la microflora mesófila aerobia e identifique la
contaminación de origen fecal en alimentos utilizando las técnicas
más comunes.

II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1. Generalidades
Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC), incluido el
serotipo O157:H7, es un patógeno emergente asociado a casos de diarrea,
colitis hemorrágica, síndrome urémico hemolítico (SUH) y trastornos de
coagulación (púrpura trombocitopénica trombótica) en seres humanos.
Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH) se identificó por primera vez como
patógeno humano en 1982, cuando se detectaron en dos brotes de colitis
hemorrágica en los Estados Unidos cepas de un serotipo antes poco frecuente,
el O157:H7. A partir de entonces se han registrado y se siguen registrando
brotes de infección por ECEH O157:H7 en muchas regiones del mundo (FAO).
El período de incubación promedio de la infección por STEC es de 3 días (con
un rango de 1 - 8 días) y el cuadro clínico incluye un período de 1 a 2 días de
vómitos, fiebre baja o ausente, dolores abdominales severos y diarrea sin
sangre, como síntomas iniciales, seguidos por diarrea sanguinolenta o colitis
hemorrágica durante 4 a 6 días. Aunque en la mayoría de los casos la diarrea
por STEC es autolimitada, aproximadamente el 5 a 10% de los niños infectados
evolucionan a SUH. (ICMSF) La complicación de la enfermedad afecta
particularmente a niños, ancianos y aquellos que, por padecer otras
enfermedades, tengan su sistema inmunológico deprimido.
2.2. Reservorio y fuentes de infección
Los rumiantes en general y el ganado vacuno en particular, han
sido señalados como los principales reservorios de STEC. La contaminación de
la canal durante el sacrificio es la ruta primaria que últimamente lleva a la
contaminación de la carne picada de vacuno. El escenario más normal que
conduce a que se presente la enfermedad es una cocción insuficiente, la
supervivencia del patógeno y la subsecuente infección. (INEI-ANLIS, 2009) La
principal vía de transmisión son los alimentos contaminados como carne
molida, productos cárnicos crudos o insuficientemente cocidos, embutidos
fermentados, leche y jugos no pasteurizados, vegetales que se consumen
crudos, etc. Otras formas de transmisión incluyen la contaminación cruzada
durante la preparación de alimentos, el contacto directo del hombre con los
animales, bañarse en aguas recreacionales contaminadas y de persona a
persona por la ruta fecal-oral.

2.3. Factores de virulencia

Las cepas STEC de origen humano, animal o de alimentos pueden
producir dos tipos de toxinas Shiga,Stx1 y Stx2, que poseen efectos citotóxicos
en células Vero y portan marcadores de virulencia accesorios como el gen eae
y el gen hlyA. El gen eae codifica una proteína, denominada intimina, la cual
induce una unión íntima de la bacteria al enterocito y la desorganización de las
microvellosidades, con producción de la lesión AE (“attaching and effacing”); y
el gen hlyA codifica una enterohemolisina.

E. coli O157 posee la mayoría de las características bioquímicas de

la especie, con las siguientes diferencias:

 No fermenta el sorbitol o lo hace lentamente

 No posee actividad de β – glucuronidasa
 Temperatura óptima de crecimiento: 30°C - 42ºC
 Desarrolla pobremente a 44°C - 45ºC
 No desarrolla a temperaturas superiores a 45ºC
 No desarrolla a temperaturas de –10ºC, pero sobrevive en productos
congelados (–20ºC), sin cambio en el número total de microorganismos
por períodos prolongados
  Es resistente a los cambios de pH
2.4. Incidencia
La notificación de las infecciones por E. coli O157:H7
experimentaron un aumento exponencial a partir de su primera aparición en
1982. Los numerosos brotes y casos esporádicos detectados en distintas
partes del mundo, así como también la cantidad de vehículos de transmisión
identificados llevaron a promover estrategias de prevención y control. En
Canadá, la incidencia de las infecciones por E. coli O157:H7 es de 5,3/100.000
habitantes. En Asia hay pocos reportes de infecciones por STEC, salvo en
Japón donde hubo un brote masivo con más de 10.000 afectados en el año
1996. En EE.UU. E. coli productor de toxina Shiga es el causante de diarrea en
72.000 habitantes por año, de los cuales el 5%, evolucionan a SUH. En dicho
país, en el año 2002 el número de casos fue de 1,7/100.000 habitantes,
registrándose que más del 50% de los brotes de origen alimentario fue debido
a carne picada. En Argentina el SUH es endémico; es el país con mayor
incidencia de SUH a nivel mundial (13,9/100000 niños menores de 5 años). La
enfermedad está distribuida en todo el país, pero la frecuencia es mayor en las
provincias del centro y sur. En el año 2006, en Argentina hubo 464 casos
notificados, de los cuales el 60 % eran menores de 2 años. La letalidad en la
fase aguda fue del 3,2 %. En niños, es la primera causa de insuficiencia renal
aguda, y la segunda de insuficiencia renal crónica. Causa el 20 % de los
transplantes renales en niños y adolescentes.

2.5. Pruebas confirmativa para Escherichia coli sp.

 Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y
sembrar por estría cruzada en agar eosina azul de metileno para su
aislamiento.
 Incubar las placas invertidas a 35°C por 18-24 h.
 Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfología
colonial: Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metálico.
Si no hay colonias con morfología típica, probar una o más colonias
lo más parecido E. coli de cada placa y sembrarlas en agar cuenta
estándar para realizar las pruebas de morfología microscópica y
pruebas bioquímicas.
  Incubar las placas a 35°C por 18-24 h.
 Hacer un frotis y teñirlo por Gram. Observar al microscopio la
presencia de bacilos cortos o cocobacilos Gram-negativos.

2.6. Identificación bioquímica de Escherichia coli sp. mediante pruebas

(IMViC).
A. Producción de INDOL (I)
 Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 35°C por 24 ± 2 h.
 Adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de Kovacs.
 La presencia de una coloración roja en la superficie del tubo se
considera una prueba positiva.

B. Producción de ácidos mixtos (Rojo de metilo, RM)

 Inocular un tubo adicional con caldo RM-VP e incubar a 35°C por

48 ± 2 h.
 Adicionar 5 gotas de solución de rojo de metilo.
 Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color
rojo. Un color amarillo es una prueba negativa.

C.Producción de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)

 Inocular un tubo con caldo RM-VP e incubar a 35°C por 48 ± 2 h.

 Adicionar 0.6 mL de solución VP1 y 0.2 mL de solución VP2 y
agitar.
 Dejar reposar durante 10 minutos sin agitar el tubo; se considera
una prueba positiva cuando se desarrolla un color rosa en la
superficie.

D. Utilización del citrato (c)

 Inocular un tubo con caldo citrato de Koser o Simmons un inóculo

ligero para evitar turbiedad en el tubo (opcional: puede utilizarse
citrato de Simmons)
 Incubar a 35°C por 96 h.
 El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad del
medio, se considera una prueba positiva.
 Para determinar la producción de indol, en lugar del caldo triptona
puede utilizarse al agar SIM. Este medio se inocula por picadura con el asa
bacterioogíca de forma recta. Se incuba a 35°C por 24± 2 h. Finalizado el
periodo de incubación se adiciona el reactivo de Kovac o Erlich cuyo
fundamento es el mismo. Para determinar la utilización del citrato de sodio
como única fuente de carbono, también se puede utilizar el agar citrato de
Simmons en forma inclinada, el cual se inocula en la superficie (pico de flauta).
Se incuba a 35°C de 24 a 48 h. La presencia de una coloración azul debida al
vire del indicador que contiene el medio, indica prueba positiva.

2.7. Método de disolución

Consiste en diluir el material o examinarse generalmente en serias

al décimo, inoculando estas diferentes diluciones, en un número apropiado de
tubos con medio líquido si el desarrollo ocurre cuando se ha inoculado un
centímetro de la dilución de 1/100, no así en la dilución al 1/1000, el número de
bacterias estaría comprendido entre 100 y 1000. El método en general es
bastante preciso, su desventaja consiste en calcular el número de bacterias
presentes en las diferentes diluciones que se han realizado y en determinar el
número de tubos que debe usarse para cada dilución, dificultades que han sido
obviados mediante la tabla dada por McCrady en 1915 y Wallmann, la que ha
sido completada por las ecuaciones estadísticas de Ziegler y Halvarson
(MARIA DEL ROSARIO,1992).
 III. MATERIALES Y MÉTODOS

III.1 Materiales y equipos de laboratorio

3.1.1. Materiales
 Vasos de precipitación
 Tubos de ensayo
 Matraz de Erlenmeyer
 Placas Petri
 Gradilla
 Mechero de Bunsen
 Pipetas
 Tubitos Durham
3.1.2. Equipo
 Estufa
 Refrigeradora
III.2 Reactivos
 Caldo lactosa bilis verde brillante (BRILA)
 Caldo peptona
 Caldo lactosado
 III.3 Metodología

10 ml 90 ml Caldo peptona (10−1 ¿

Liquido
MUESTRA
ORGANICA
(250 g o ml)
10 g

Solido

1ml 1ml
90 ml Caldo
peptonado
con la 1ml
muestra

10−1 10−2 10−3 10−4

1. Prueba Presuntiva:
1ml 1ml 1ml

Tubos con 9 ml de CALDO

LACTOSA BILIS VEDE
BRILLANTE (BRILA) o CALDO
TRIPTOSA Y LAURIL
SULFATO y tubitos de Durham
invertidos.

Se lleva a 35°C-37°C por 24-48h. Se verifica

producción de gas en los DURHAM cada 24 h se determina el índice NMP de
la tabla y se calcula el NMP por 100ml con la fórmula:

NMP Indice NMP ( tabla ) x Dilucion intermedia

=
100 ML 100

2. Prueba confirmativa
Se utilizan tubos con 9 ml de CALDO LACTOSADO con tubitos
Durham invertidos.
Se llevan a incubación a 35°C-37°C por 24-48h y se determina el
NMP para confirmar el índice encontrado.
3. Prueba completada
Los tubos positivos se siembran en medio solido de: EMB, ENDO o MAC
CONKEY y se lleva a incubación a 37°C por 24 h si aparecen colonias
lactosa positiva son coliformes.
 IV. RESULTADOS

Cuadro 1. Resultado del método de Índice de NMP

Índice
10−1 10−2 10−3 NMP/100 mL
Grupo 1 2 0 0 9
Grupo 2 3 3 2 1100

Cuadro 2. Número de colonias encontrados en placa

X́ X́
M.O/ml de M.O/ml de
10−3 10−4
muestra muestra
Grupo 1 8,5 8500 2,5 25000
Grupo 2 17 17000 5 50000

Cuadro 3. Resultado en CALDO BRILA

10−1 10−2 10−3
+
Grupo 1
-
+ +
Grupo 2 + + -
+ + +

Cuadro 4. Resultado de la prueba de IMVIC

Factor de Indo Rojo de Voges Citrato de
Resultado
dilución l Metilo Proskauer Simmons
Grupo
10−3 + + - - E. Coli
1
Grupo E.
10−3 + - + -
2 Agglomerans
 E.
10−3 + - + +
Agglomerans
10−3 - - + + Klebsiella

V. DISCUSIÓN

Según (CAMPUZANO et al, 2015), en los resultados obtenidos de

la calidad microbiologica del jugo de naranja se encontro que el 100% de las
muestras analizadas excedieron el recuento permitido para coliformes totales y
es debido a que las muestas se obtuvieron en puestos abulantes cercanos de
la universidad, mientras que en la practica se realizo de un refreco de piña que
se obtuvo en el cafetin de la univerdidad, que tambien se rechazo ya que 8
muestras salieron positivos como se muestra en el cuadro 1, por lo tanto no es
para el consumo humano, y puede deberse a que no han hecho un lavado
adecuado a la piña.

Según (ALVAREZ, 2011) se encontraron bacterias dentro de las

cueles se encuentra Escherichia Coli y otras especies como Citrobacter,
Klebsiella, Enterobacter que se ha encontrado en instituciones educativas que
son alimentos preparados. En el laboratorio de microbiología se encontró
bacterias como E. Coli, E. Agglomerans y Klebsiella, que se han encontrado en
el cafetín de la UNAS como se muestra en el cuadro 4, puede deberse a que el
agua no tiene un tratamiento adecuado ya que se usa el agua del rio.

Según (MIRANDA, 2017) la cantidad de tubos de número más

probable positivos fueron de 2, 1, 0 con series de 10−1,10−2 , 10−3
respectivamente en bebidas de frutas mixtas no pasteurizadas comercializadas
en establecimientos especializados de piña, limón y naranja, en el laboratorio
que se realizó de la UNAS fue 2, 0, 0 y 3, 3, 2 en el grupo 1 y grupo 2
respectivamente como se muestra en el cuadro 1, la diferencia de resultados
puede deberse a una mala higiene en la fruta o no realizar un pasteurizado
adecuado.
 VI. CONCLUSIÓN

Se llego Identificar la bacteria de Escherichia coli sp. en el rio que

pasa por el paraninfo y los quioscos del grupo 1, además en el refresco de piña
se encontró las bacterias E. Agglomerans y Klebsiella que se vende en el
quisco del Paraninfo-UNAS del grupo 2.

VII. RECOMENDACIONES
 VIII. BIBLIOGRAFÍA

ALVAREZ , E. 2011. Determinacion del cumplimiento de las normas de higiene

y de la calidad sanitaria en alimentos preparados y expendidos en
kioscos escolares de colegios nacionales del distrito de Wanchaq -
Cusco. Cusco. Universidad Nacional San Antonio Abad Del Cusco.
182 p.

CAMPUZANO, S., MEJÍA, D., MADERO, C., PABÓN, P. 2015. Determinación

de la calidad microbiológica y sanitaria de alimentos preparados
vendidos en la vía pública de la ciudad de Bogotá D.C. NOVA.
Colombia. 13(23):81-92.

MIRANDA, S. (2017). Determinación de escherichia coli en bebidas de frutas

mixtas no pasteurizadas comercializadas en establecimientos
especializados en San Ramón, Alajuela. Rev. Costarricense de Salud
Pública. Costa Rica, 26(2):189-198.

Evaluación del riesgo de Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH)

en la carne y los productos cárnicos.
http://www.fao.org/ag/agn/agns/jemra_riskassessment_ecoli_es.asp
ICMSF Microbiología de los alimentos 7. Editorial ACRIBIA. Capítulo
17.
Manual de procedimientos: Detección de Escherichia coli productor de
toxina Shiga O157 y no-O157 en alimentos. Servicio de Fisiopatogenia.
Departamento de Bacteriología INEI- ANLIS “Carlos G. Malbrán”, 2009.
Responsible use of antibiotics in aquaculture.
ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/009/a0282e/a0282e00.pdf
FDA – Bacteriolocical Analytical Manual. Chapter 4a. Diarrheagenic
Escherichia coli. February 2011.
KORNACKI J.L., JOHNSON J.L. 2001. Enterobacteriaceae, Coliforms, and
Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In: Compendium of
Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs
F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 69-82.

International Commission on Microbiological. Specifications of Foods

(2005) “Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall. 2nd ed.

IX. ANEXO

Fig 1. Resultado prueba INVIC Fig 2. Reactivos microbiológicos

Fig 3. Resultados de las placas Petri

Fig 4. Materia Prima (Refresco)