RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

 Verificar la calidad de los alimentos haciendo uso de los parámetros coliformes

totales y coliformes fecales

OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Determinar el número de colonias formadas de coliformes totales y fecales en los

diferentes medios de cultivo como ser PDA, PCA, MC
 Verificar el crecimiento de coliformes totales y fecales en los caldos verde bilis
brillante y caldo E.C. respectivamente

INTRODUCCION

Coliformes Totales

La denominación genérica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas que

tienen ciertas características bioquímicas en común e importancia relevante como
indicadores de contaminación del agua y los alimentos.

Hábitat del grupo coliforme

Las bacterias de este género se encuentran principalmente en el intestino de los humanos

y de los animales de sangre caliente, es decir, homeotermos, pero también ampliamente
distribuidas en la naturaleza, especialmente en suelos, semillas y vegetales.

Los coliformes se introducen en gran número al medio ambiente por las heces de
humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse que la mayoría de los coliformes que
se encuentran en el ambiente son de origen fecal. Sin embargo, existen muchos
coliformes de vida libre.

Los coliformes como indicadores

Tradicionalmente se los ha considerado como indicadores de contaminación fecal en el

control de calidad del agua destinada al consumo humano en razón de que, en los medios
acuáticos, los coliformes son más resistentes que las bacterias patógenas intestinales y
porque su origen es principalmente fecal. Por tanto, su ausencia indica que el agua es
bacteriológicamente segura.

Asimismo, su número en el agua es proporcional al grado de contaminación fecal;

mientras más coliformes se aislan del agua, mayor es la gravedad de la descarga de
heces.

Los coliformes son una familia de bacterias que se encuentran comúnmente en las
plantas, el suelo y los animales, incluyendo a los humanos. En general, las bacterias
coliformes se encuentran en mayor abundancia en la capa superficial del agua o en los
sedimentos del fondo. Por su amplia diversidad el grupo coliformes ha sido divido en dos
grupos: coliformes totales y coliformes fecales.

Bacterias que integran el grupo

El grupo coliforme está formado por los siguientes géneros:

1.Escherichia

2.Klebsiella

3.Enterobacter

4.Citrobacter

FUNDAMENTO TEORICO

Existen diversos métodos para cuantificar el número de microorganismos presentes en

muestras líquidas y sólidas. Dentro de las técnicas más comunes se encuentra el
recuento directo por microscopia de fluorescencia, así como los procedimientos basados
en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos en medios de cultivo sintéticos
sólidos o líquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias (UFC)
o la estimación por el método del Número Más Probable (NMP).

El método del número más probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente
sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este método fue empleado para
estimar el número de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo,
se ha demostrado que también puede ser aplicado para la determinación de
microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos
contaminados, por tanto este método es aplicable para estimar el número de
microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como
anaerobias.

Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces

de fermentar la lactosa a 44º C en vez de 37 ºC como lo hacen los totales.
Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces están
formados por Escherichia coli y ciertas especies deKlebsiella. Ya que los Coliformes
Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre
caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminación fecal. Éstos
últimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas más
elevadas. Esta es la característica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales.

La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los

animales homeotérmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de
materia orgánica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo se han utilizado como
indicador ideal de contaminación fecal. Su presencia se interpreta como una indicación de
que los organismos patógenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua o
el alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores de enfermedades.
En alimentos, la identificación de una concentración elevada de Coliformes Fecales en
un alimento es indicador de su contaminación y por tanto su mala manipulación, de ser
esto así, se debe declarar al alimento en cuestión como
No Apto para el Consumo Humano.

La Organización Mundial de la Salud indica que la problemática de la contaminación

de mares y ríos por aguas servidas y desagües a puesto en alto riesgo a la población
acuática de directo consumo humano, estando entre ellos los peces. La contaminación
producida también contamina la carne de dichos animales, estando por tanto
contaminados en su mayor parte desde su fuente de extracción. Es por tanto de mucha
importancia en la actualidad pruebas que descarten la presencia de microorganismos
contaminantes tan peligrosos como son los Coliformes Fecales

El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gram negativos
aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la
lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC.

Este grupo esta conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia,

Citrobacter y Klebsiella.

El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas

capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h. de incubación a 44.5 ±
0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más prominente es
Escherichia coli.

La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse

mediante el empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos con características
selectivas y diferenciales.

Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de
la familia Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), existe como comensal en el intestino
delgado de humanos y animales. Sin embargo, hay algunas cepas de E. coli patógenas
que provocan enfermedades diarreicas.

Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas:

 E. colienterotoxigénica (ETEC)
 E. coli enteropatógena (EPEC)
  E. coli enterohemorrágica (EHEC)
 E. coli enteroinvasiva (EIEC)
 E. coli enteroagregativa (EAEC)
 E. coli enteroadherente difusa (DAEC).

Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas
anteriores, las 4 primeras están implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de
agua y alimentos contaminados.

Escherichia coli enterotoxigénica ETEC

La infección puede ser adquirida por el consumo de alimentos como vegetales
frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido
calculada en aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jóvenes y ancianos la
dosis infectiva puede ser más baja.

Escherichia coli enteropatógena ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes

particularmente en los países en vías de desarrollo.

Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua

contaminada y productos cárnicos. En estudios con voluntarios se encontró que la dosis
infectiva es de 106 microorganismos.

Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra

estrechamente relacionado con el género Shigella, produce una enfermedad
similar a la shigelosis. La enfermedad se presenta comúnmente en niños de
países subdesarrollados y en personas que viajan a dichos lugares. La EIEC
provoca la enfermedad (diarrea disentérica invasiva) al invadir las células
epiteliales de la mucosa intestinal.

La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y

destruir el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los
fagolisosomas.

Escherichia coli enterohemorrágica EHEC produce verotoxina, denominada así

por su efecto citotóxico sobre las células Vero, una línea de células renales de
monoverde africano. Existen al menos dos variantes antigénicas de la toxina. La
ECEH se ha asociado con colitis hemorrágica

La causa más común de esta infección es el consumo de carne sin cocinar o poco
cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades.
Los casos de colitis hemorrágica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse
mediante la cocción completa de la carne
MATERIALES

Reactivos Materiales y Equipos

 Violeta Rojo Bilis Lactosado (VRBL)  8Cajas Petrie desechables
 Plate Country Agar (PCA)
 Papa Dextrosa Agar (PDA)  8 Tubos de Ensayo
 Caldo E.Coli (CEC)  5 Pipetas Volumétricas de 1mL y 10 mL
 Caldo Verde Bilis Brillante (CVBB)  1 Matraz Erlenmeyer 250 mL
 Agua Peptona
 1 Mechero
 1 Asa de Aguja
Muestra  1 Agitador
 Queso menonita  1 Estufa

PROCEDIMIENTO

 Protegerse adecuadamente antes de comenzar la práctica es decir colocándose

barbijo, gorro y guantes, para posteriormente desinfectar el area de trabajo
 Tritura lo mas posibles la muestra de queso menonita
 Pesar 25 gramos de queso y agregar a 225 mL de agua peptonada, agitando
vigorosamente
 Agregar 9 mL. De agua peptonada a 4 tubos de ensayo los cuales tendrán una
concentración de 10-2, 10-3, 10-4, 10-5
 Enumerar las concentraciones con las que se va a trabajar en las placas petry
 PCA: 10-3, 10-4, 10-5
 PDA: 10-2, 10-3
 MC : 10-3, 10-4, 10-5
 Para el medio PCA se pipetea 1mL de la solución madre y se vierte al primer tubo
de concentración 10-2
 Del tubo de concentración 10-2 es extraído 1mL con otra pipeta , la cual es
depositada en el tubo de concentración 10-3

 De la misma manera que la anteriores del tubo de concentración 10-3 se extrae 2

mL. con una nueva pipeta y es vertido 1 ml al tubo de concentración 10-4 y el 1
mL. Restante a la caja petry de concentración 10-3 TENIENDO SIEMPRE EN
CUENTA QUE EN TODAS LAS DILUCIONES SE TRABAJA DETRÁS DEL
MECHERO Y QUE PARA CADA DILUCION DE HACE USO DE OTRA PIPETA

 Terminado de depositar las diluciones se procede a vaciar el PCA mas o menos

que tenga 3-5 mm de espesor y realizar movimientos leves en forma de 8 y 5

 Se procede de la misma manera para el medio PDA y MC con la varienta de que

las concentraciones en las placas petry son distintas

 del tubo de concentración 10-4 se pipetea 2 mL. con la pipeta ya descontaminada

y es vertido a la caja petri de concentración 10-4 y el otro 1 ml al tubo de
concentración 10-5
 Finalmente del tubo de concentración 10-5 se pipetea 1 mL. Y se lo vierte a la caja
petry de concentración 10-5

 Una vez que las muestras son depositadas en las cajas petri se proceden a
destaparlas no por completo y a verter el agar (agua en esta práctica) lentamente
hasta que tenga un espesor de 2 cm., luego se tapa la caja y se realizan
movimientos en forma de 8 unas 5 veces verticalmente y 3 veces
horizontalmente , este procedimiento se realiza con todas las muestras
depositadas

SEGUNDA PARTE

Una vez que se hubiesen formado las colonias en el medio MC se verifica la

presencia de coliformes totales y coliformes fecales en el caldo verde bilis brillante y
caldo EC respectivamente

Para ello se elige una placa petri la cual se encuentre dentro del rango y se toman 2
colonias enumerando cada una, a partir de ahí se elige una colonia para hacer la
inoculación en el caldo EC y Caldo verde bilis brillante
  Después de haber transcurrido 24 horas después de la siembra se procede con la
inoculación de la siguiente manera

 Se esteriliza todo el medio con el que se va a trabajar es decir mesones y se

protege uno adecuadamente (barbijo , guantes y gorro)

 Posterior a ello se esteriliza el asa en un mechero se deja enfriar y se destapa la

placa petry de concentración 10-3 se pincha la colonia uno y se le agrga al tubo de
ensayo verde bilis brillante teniendo el cuidado de calentar la boquilla en el
mechero antes y después de la inoculación

 Se vuelve a esterilizar el asa en el mechero dejando que enfrie por unos

segundos y se vuelve a pinchar la colonia 1 se destapa el tubo de ensayo que
contiene el caldo EC y se lo agrega se agita levemente y se tapa el tubo teniendo
el cuidado de calentar la boquilla antes y después de la inoculación

 De la misma manera se procede con la colonia # 2 inoculando en los 2 tubos

CALCULOS Y RESULTADOS

MEDIO: PCA

Dilución Dilución
Dilución 10-3 10-5
10-4
Incontable
24 HORAS Incontable Incontable

341
48 HORAS Incontable Incontable

Debido a que los datos obtenidos en nuestras diluciones en caja petry sobrepasan el
rango se trabajara con estos por motivos de practica

RTBAM: 3.4*107 UFc/g

 MEDIO: PDA

Dilución
Dilución 10-2
10-3

24 HORAS Incontable Incontable

48 HORAS Incontable 420

M y L= 4.2*105

MEDIO: MC

Dilución Dilución
Dilución 10-3 10-5
10-4

24 HORAS 96 3 0

VERIFICACION

COLONIA #1 COLONIA #2
CALDO VERDE Positivo Positivo
BILIS BRILLANTE
(Presencia de CT )
CALDO E.C. Positivo Positivo
(Presencia de CF)
 MEDIO : MC

PARAMETRO: Coliformes totales

CT = 96*(2/2)* 103 = 9.6 * 104 UFc

PARAMETRO: Coliformes fecales

CF= 96*(2/2)* 103 = 9.6 * 104 UFc

MEDIO: PCA

10-2 10-3

24 HORAS

48 HORAS

24 HORAS
48 HORAS

MEDIO: PCA

MEDIO MACONKEY

10-3 10-4 10-5

24
HORAS

OBSERVACIONES

 Las colonias típicas de coliformes presentan un halo rojo

 En el medio PCA hubo crecimiento de mohos
 En los medio PCA y PDA los microorganismos no se encontraban dentro del rango
de la ISO para hacer el recuento correspondiente
 Los caldo VBB presentan turbidez
 Los caldos EC inicialmente eran de color amarillo tenue después de la inoculación
se tornan de un blanco lechoso con presencia de precipitado
 El caldo EC inicialmente tiene una coloración verde
CONCLUSIONES

 La muestra de queso tiene 9.6 * 104 UFc/g en coliformes totales como coliformes
fecales lo cual nos indica que no es apta para el consumo

 El medio utilizado en la practica es el MC que es una medio selectivo diferencial

para la detección de organismos coliformes y patógeno entéricos.