Ruptura Celular

Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnologa
Rompimiento celular
Sergio Huerta Ochoa
UAM-Iztapalapa
Productos Extracelulares
-Antibiticos
-Enzimas extracelulares
-Muchos polisacridos
-Mayora de aminocidos
Productos Intracelulares
-Mayora de protenas modificadas
genticamente
-Lpidos
-Algunos antibiticos
Biomasa
Esteroides
(Se extraen sin romper)
Procariotes Gram
(E. coli produce la mayora de las protenas recombinantes)
Membrana externa
(Protenas y lipopolisacridos)
Polipptidoglucanos
8 nm
Fuerza mecnica
Esquema de la pared celular de clulas procariotas
Procariotes Gram +
Polipptidoglucanos
Espacio Periplasmtico
(Protenas)
Membrana de plasma
8 nm
Polipptidoglucanos
Espacio Periplasmtico
(Protenas)
Membrana de plasma
(Fosfolpidos, protenas dispersas, iones metlicos)
Permeabilidad
Tomado de Advances in product release strategies and impact on bioprocess design (2009)
Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell
Tomado de
Advances in product
release strategies and
impact on bioprocess
design (2009)
Bangaru
Balasundaram, Sue
Harrison and Daniel
G. Bracewell
Tomado de
Advances in product
release strategies and
impact on bioprocess
design (2009)
Bangaru
Balasundaram, Sue
Harrison and Daniel
G. Bracewell
Fermentacin
Cosecha de clulas
Rompimiento Celular
Centrifugacin, filtracin con vaco,
filtracin con membranas
Homogenizacin, molienda, lisis
(enzimtica o qumica)
Etapas primarias
de recuperacin
Remocin de restos celulares
Concentracin y/o
fraccionamiento
Operaciones de alta
resolucin
Operaciones finales
Producto
filtracin con membranas
Precipitacin, extraccin, filtracin con
membranas, evaporacin
Cromatografa, cristalizacin
Adaptado de: Sanchez-Ruiz, 1989
Studies on cell disruption and cell debris
removal in downstream processing
Ruptura Celular de Saccharomyces cerevisiae
Antes de la ruptura celular
Despus de 2 pasos a 1000 bar dando un
rompimiento celular de 95%
Equipo de ruptura
Industria Alimentaria
(Homogenizacin de la leche)
Industria de la Pintura
(Reduccin de Pigmentos)
Industria Biotecnolgica Aplicacin en
Mtodo Tcnica Principio Estrs
sobre el
producto
Costo Ejemplo
Qumico
Choque osmtico Ruptura osmtica de la membrana Suave Barato Ruptura de clulas de sangre
Digestin
enzimtica
Rompimiento por digestin de la
pared celular
Suave Caro Micrococcus lysodeikticus tratado con lisozima
de huevo
Solubilizacin Detergentes solubilizan la
membrana celular
Suave Moderado-
caro
Sales biliares actuando sobre E.coli
Disolucin de
lpidos
Solventes orgnicos se disuelven en
la pared celular y la desestabilizan
Moderado Barato Ruptura de levadura con tolueno
lpidos la pared celular y la desestabilizan
Tratamiento
alcalino
La saponificacin de lpidos
solubiliza la membrana
Fuerte Barato
Mecnico
Homogenizacin
(tipo navaja)
Clulas cortadas en una licuadora Moderado Moderado Tejido animal y clulas
Molido Ruptura celular por molido con
abrasivos
Moderado Barato
Ultrasonicacin Clulas rotas con cavitacin
ultrasnica
Fuerte Caro Suspensin de clulas a pequea escala
Homogenizacin
(tipo orificio)
Se hace pasar clulas por un
pequeo orificio y se rompen por
estrs
Fuerte Moderado Tratamiento a gran escala de suspensin de
clulas excepto bacterias
Rompimiento en
molino de perlas
Se aplastan las clulas entre el
vidrio y perlas de acero
Fuerte Barato Tratamiento a gran escala de suspensin de
clulas y clulas de plantas
Dificultad de la ruptura
Esporas
Cocos
gram-
Levaduras
Clulas vegetales
Bacilos gram+
Bacilos gram- y cocos
Micelios
Clulas animales
Eleccin del mtodo de ruptura
Naturaleza de la fuente de la enzima
Escala de la operacin Escala de la operacin
Velocidad del mtodo de extraccin
Estabilidad del enzima
Pureza requerida
Costo del proceso
Factor inactivante Fuente de
enzima
Frecuencia Modo de
contrarrestarlo
Calor Cualquiera Universal Enfriamiento
Fro Cualquiera Raro Calentamiento
Factores que inactivan las enzimas durante su aislamiento
Proteasa Mayora Comn Inhibidores de proteasas o fro
Productos oxidacin de
fenoles
Plantas y hongos Bastante comn Agentes reductores
Oxidacin Cualquiera Comn Agentes reductores
Dilucin protena Cualquiera Bastante comn Concentracin rpida
Prdida de estabilidad Cualquiera Bastante comn Restauracin de ese factor
Inhibidores especficos Plantas y bacterias Raro Separacin del inhibidor
Metales pesados Cualquiera Raro Agentes quelantes
Cambio de fase Cualquiera Comn Mnima agitacin
Choque osmtico
1. Suspensin de clulas en solucin tamponada hipertnica (sacarosa 20%)
2. Equilibrio osmtico
3. Centrifugacin: concentracin de las clulas
4. Resuspensin en agua (4C)
5. Ruptura celular por entrada de agua en el interior celular
Mayor sensibilidad en GRAM (GRAM + alta presin osmtica interna)
Ventajas:
Extraccin de enzimas del espacio periplasmtico, simplificacin de
los procesos de purificacin
NO a gran escala:
Grandes volmenes de medio (400 L/10 kg pasta celular)
Elevado nmero de pasos de centrifugacin
Necesidad de refrigeracin
Tratamiento con lisozima + EDTA
Digestin de las paredes celulares por ruptura de los enlances beta-(1.4)
glicosdicos entre el cido N-acetilmurmico (NAM) y la N-acetilglucosamina
(NAG) del mucopptido
Mayor susceptibilidad GRAM +
Combinacin con EDTA: quelante del Ca
2+
Otros policationes: GRAM +: quitosano, hidroglutamato, polilisina,
antiobiticos GRAM -: lipasas, fosfolipasas, policationes
Hongos/levaduras: quitinasa/glucanasas
Necesidad de choque osmtico
No empleo a gran escala:
Alto precio de la lisozima
Eliminacin de lisozima tras extraccin
Tratamiento con detergentes
Permeabilizacin de clulas por solubilizacin de protenas de membrana,
debido a apertura de poros
Tipos:
1. Inicos: provoca desnaturalizacin proteica
Aninicos: Lauril sulfato sdico, colato sdico, SDS
Catinicos: Bromuro de cetil-trimetil-amonio Catinicos: Bromuro de cetil-trimetil-amonio
2. No inicos: preservan estructura nativa e interacciones de la enzima
Tween, Spam, Triton
Inconvenientes:
Precipitacin de protenas
Necesidad de eliminacin (cromatografa, ultrafiltracin)
Tratamiento con lcalis
Tratamiento de las clulas con soluciones alcalinas
(KOH, NaOH, pH 11.5-12.5; 20-30 min)
Hidrlisis de la pared celular
Ventajas:
Simpleza, barato
Fcil aplicacin a gran escala Fcil aplicacin a gran escala
Desventajas:
Tratamiento fuerte, es un ejemplo extremo de la solubilizacin
(Saponificacin de lpidos que se convierten a detergentes)
No selectivo
Aplicacin SLO si las enzimas a aislar son estables a pH alcalino
Mtodo tradicional de ataque ( tolueno).
Disolventes orgnicos
No se usan a gran escala.
Inconvenientes:
Precio
Toxicidad
Desnaturalizacin de protenas
Inflamabilidad
Homogeneizacin con abrasivos
Mortero + abrasivo (cristal, albmina, kieselgurh)
Dispositivos de funcionamiento continuo:
Agitador Mickle (agitador vibratorio)
Dyno-mill (agitador de discos giratorios)
Efectividad depende de:
Tipo y concentracin de abrasivo
Tipo, concentracin y edad de las clulas: levaduras >bacterias
Velocidad de agitacin
Cantidad y flujo a travs de la cmara
Temperatura
Dispositivo de discos
Sonicacin
Aplicacin de frecuencia superiores a 20 kHz
Aparicin de reas de compresin/enrarecimiento/cavidades colapso de
cavidades ondas de choque dao celular
Aplicacin continua o discontinua
Eficacia dependiente de:
Tipo de microorganismo: diversidad
Gram ->Gram + Gram ->Gram +
Bacilos > Cocos
pH
Temperatura
Fuerza inica del medio
Tiempo de exposicin
Densidad de la clula
Uso a pequea escal, NO a gran escala:
Elevados requerimientos de energa
Dificultad de transmisin de la energa
Problemas de disipacin del calor producido
Congelacin/Descongelacin
Formacin y fusin de cristales de hielo liberacin de protenas
Combinacin con otros mtodos: congelacin de sedimentos bacterianos
Ventajas: Ventajas:
Simplicidad
Bajas temperaturas de trabajo
NO a gran escala:
Elevado tiempo de tratamiento
Resistencia de algunos microorganismos
Sensibilidad de las enzimas a congelacin/descongelacin
Cizalla lquida
Paso de la suspensin de clulas a elevada presin (>55MPa) a travs de un
orificio estrecho
Homogeneizador de Manto-Gaulin
Mecanismo:
Ruptura celular por cada brusca de presin y choque
Modos de uso:
Paso nico, series de reciclaje, reciclaje continuo con eliminacin de
sustancia
Efectividad depende de:
Tipo de microorganismos: GRAM -> GRAM +
Historia de la materia de partida:
Condiciones de crecimiento (fase estacionaria > fase exponencial)
Congelacin/descongelacin
Cizalla slida
Paso de clulas congeladas (-20 C) a travs de orificio
Mecanismo:
Agitacin en presencia de abrasivo (cristales de hielo) +
ruptura por cizalla lquida ruptura por cizalla lquida
Fuerzas de cizalla: paso a travs de orificio + desgarro por
cristales de hielo
No produce la desnaturalizacin de las enzimas
NO a gran escala:
Manejo complicado y costoso
Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular
Choque osmtico: El clculo del gradiente de presin se basa en el equilibrio qumico
i i e
T R P P c =
(Tejeda y col., 1995, Bioseparaciones)
Molino de Perlas (operacin intermitente): El rompimiento celular con perlas agitadas
a altas velocidades sigue una cintica de primer orden. El balance de masa de protena
liberada puede ser expresado mediante la ecuacin:
( )
M m M
V R R k
dt
dR
V =
Integrando y re-arreglando
kt
R R
R
m
m
=
ln
t
R R
R
m
m
ln
k
Ejemplo 5.2
Eficiencia de los Molinos de Perlas (operacin continua): El nmero de etapas de un
molino de perlas obtenido mediante experimentos de pulsos, puede ser empleado para
calcular la eficiencia esperada del rompimiento. El balance de masa de protena liberada
(clulas rotas) considerando que el molino consta de N etapas tipo tanque perfectamente
agitado en serie y que el rompimiento sigue una cintica de primer orden puede ser
expresado mediante la ecuacin: expresado mediante la ecuacin:
( )

V
R R k FR
dt
dR
V
m
m
m
1 1
1
+ =
Expresando la ecuacin en funcin de un tiempo adimensional e integrando obtenemos
+
=
F
kV
F
kV
R
R
m
m
m
1
1
Eficiencia de la etapa !!!
Re-arreglando y generalizando para N etapas, tenemos:
m
m
m
F
kV
R R
R
+ =
1
Ejemplo 5.3
Homogeneizador de alta presin: La desintegracin celular en un homogeneizador de
alta presin a una presin fija puede ser descrita mediante una cintica de primer orden
respecto al nmero de pasos, de tal manera que:
( ) R R k
d
dR
m
= '
Integrando obtenemos la ecuacin:
k
R R
R
m
m
' ln =
Se ha determinado experimentalmente que la constante k tiene una dependencia con la

presin de la siguiente forma:
a
P k k " ' =
a
m
m
P k
R R
R
" ln =
Combinando las ecuaciones anteriores se tiene:

Microflidizador: En el caso del microfluidizador la cintica de rompimiento presenta una
cierta dependencia no lineal con el nmero de pasos expresada mediante la ecuacin:
a b
m
m
P k
R R
R
" ln =
Ejemplo 5.4
m
R R
Donde b es un exponente que vara con el tipo de clula y toma valores entre 0.28 y 1
Chang and Su, 2006
Kinetic model for simultaneous cell
disruption and aqueous two-phase
extraction
A = A
m
[1 exp(kt)]
La Ruptura celular, cuando se estn procesando cientos o miles de
litros de material, represanta un reto diferente a la ruptura celular a
nivel laboratorio
Factores claves son: Eficiencia y reproducibilidad
A nivel Industrial slo se emplean los molinos de perlas agitados y
los homogeneizadores a alta presin. El diseo de los molinos
est basado en ecuaciones empricas y en experimentos piloto. est basado en ecuaciones empricas y en experimentos piloto.
GEA Liquid Processing cell rupture
skid for biologic cell lysing. The
homogenizer feature the high
efficiency sharp profile rupture valve
type R which enable cell disruption at
lower pressures

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Se ha determinado experimentalmente que la constante k tiene una dependencia con la

Combinando las ecuaciones anteriores se tiene:

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