Estructura celular y métodos

de ruptura

ITESM Campus Toluca

Escuela de Ingeniería y Ciencias
Depto. de bioingeniería
IBT Juan Jesús Cruz Maldonado
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Introducción
• Los productos de los procesos biotecnológicos son inicialmente sintetizados
dentro de las células.
• Posteriormente, pueden ser secretados hacia el exterior o mantenerse en el
interior
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Introducción
• La gran mayoría de proteínas recombinantes se acumulan
intracelularmente.
• Algunas incluso forman agregados insolubles con una estructura
desnaturalizada conocidos como cuerpos de inclusión.

Intracelular soluble Intracelular insoluble

(cuerpos de inclusión)
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Introducción
• Cuando un bioproducto no es excretado, es necesario romper a las células
para liberar los contenidos intracelulares.

• Existen 2 tipos de métodos de ruptura: físicos y químicos.

• Métodos severos implican ruptura completa de la célula → Métodos físicos

• Métodos menos severos permeabilizan de las membranas y/o paredes celulares,

permitiendo una la liberación más específica → Métodos químicos

• La selección del método de ruptura depende tanto de la escala de producción

como las características de la pared celular del organismo y del bioproducto.
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Estructura celular (Procariotas)

• Los procariotas, especialmente bacterias, son de los organismos más
utilizados en procesos biotecnológicos debido a su facilidad de
crecimiento y mantenimiento.

• Aunque su pared celular es porosa

también es muy resistente

E. coli
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Estructura celular (Procariotas)

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Estructura celular (Procariotas)

• Bacterias gram positivas
• Pared gruesa de peptidoglicano
• Peptidoglicano: disacárido de N-acetil-D-
glucosamina y N-acetilmurámico entrelazado
por oligopéptidos con D-aminoácidos

• El peptidoglicano es resistente a la acción

de proteasas
• Contiene D-aminoácidos
• Susceptible a :
• Hidrólisis de enlace glucosídico (Lisozima)
• Ruptura mecánica
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Estructura celular (Procariotas)

• Bacterias gram negativas
• Delgada pared de peptidoglicano
• Membrana externa e interna
• Lipopolisacáridos en membrana externa

• Resistente a la acción de lisozima

• Susceptible a:
• Ruptura por choque osmótico
• Solubilización de la membrana externa
• Ruptura mecánica.
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Estructura celular (Eucariotas)

• Mayor complejidad (compartamentalización)
• División por membranas lipídicas

• Levaduras y hongos tienen paredes celulares de diferentes

polisacáridos (glucano, manano, quitina)

• Las células animales carecen de paredes celulares

• Las células vegetales tienen una pared gruesa de polisacáridos como

la celulosa
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Células eucariotas
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Métodos de ruptura
• Choque osmótico
• Métodos químicos • Digestión enzimática
• Solubilización

• Homogenización
• Métodos físicos • Rompimiento con abrasivos
• Ultrasonicación
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Choque osmótico
• Fundamentado en el fenómeno de ósmosis

• Efectivo en células sin pared

• Usualmente se adiciona el doble del volumen de biomasa

• Método simple y barato

http://bit.ly/2ZAWq2Z
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Digestión enzimática
• Uso de enzimas específicas para degradar la pared celular
• Lisozima, Quitinasa y varias hidrolasas
• Alternativamente se utilizan inhibidores de la síntesis de péptidoglicano
(penicilina)

• Método específico pero caro si se emplean enzimas puras

• Usualmente se utilizan preparaciones enzimáticas de costo más

accesible
• Se debe tener precaución de actividades inespecíficas de proteasa y nucleasa
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Lisozima
purificada

Preparado con:
detergentes no iónicos + Lizosima
+ DNAasa + (otras hidrolasas)
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Solubilización
• Adición de solventes o detergentes para permeabilizar o solubilizar
membranas plasmáticas.

• Solventes (tolueno y acetona) o detergentes sin carga (Triton X-100 o Tween

20) en concentraciones de hasta 10% (v/v) y 1-3% (v/v) respectivamente

• Es un método simple y de costo moderado

• Requiere mayor tiempo para la liberación de los contenidos intracelulares.
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>3% (v/v)

1-3% (v/v)
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Métodos físicos
• Técnica preferida para operaciones a gran escala

• Se basa en la ruptura de las células debido al esfuerzo cortante ya sea

de un sólido o de un líquido

Prensa francesa
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Métodos físicos
• En la práctica se realizan de 2 a 3 pasos para alcanzar una ruptura
mayor al 90%.

• El grado de ruptura usualmente se determina al medir ya sea la

concentración del bioproducto o su actividad biológica
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Actividad 2: Selección de métodos de ruptura

• Objetivo: Seleccionar un método de ruptura adecuado con base en las
características de un producto intracelular dado

Opción 1:
Insulina recombinante en forma de cuerpos de inclusión en el citoplasma E.
coli (Escala industrial)
Opción 2:
β-fructosidasa (invertasa) termófila recombinante expresada de forma soluble
en el citoplasma de E. coli (Escala laboratorio)
Opción 3:
Pepsinógeno humano recombinante soluble expresada en el periplasma de E.
coli (Escala laboratorio)
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Molino de perlas
• Constan de una cámara de molienda (vertical u horizontal) con un
agitador y un sistema de discos lleno de pequeñas perlas de vidrio

http://bit.ly/2KyKSHn
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Molino de perlas
• Ruptura de bacterias, levaduras, algas y hongos

• Capacidades entre 50 mL a 250 L con flujos de hasta 2000 L/h

• Las perlas usadas van de los 0.2 mm a los 1.4 mm de diámetro

• La ruptura se debe a la fuerza y la frecuencia del

choque de las perlas de vidrio.

• Las colisiones hacen que el equipo se caliente, razón

por la que algunos tienen chaqueta de enfriamiento.
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Molino de perlas
• Los parámetros que tienen mayor influencia sobre la ruptura son:
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Molino de perlas
• Velocidad del agitador: Es el responsable de transferir la energía a las
perlas.

(+) velocidad de agitación=(+) esfuerzo cortante y

frecuencia de colisiones=(+) ruptura.

Actividad (UI/mL)
Pero también implica mayor desgaste de

Proteína mg/mL
las perlas y mayor temperatura

Velocidad de agitación (rpm)

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Molino de perlas
• Flujo de alimentación: Dicta el tiempo de residencia dentro del
molino
• Ruptura es inversamente proporcional al flujo
• Más costeable operar a flujos altos y realizar varios pasos para aumentar el
porcentaje de disrupción.

• Diseño del agitador: Determina el patrón de flujo y el mezclado

dentro del molino.
• Diferentes configuraciones de agitadores tendrán diferentes efectos en cuanto
al porcentaje de disrupción
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Molino de perlas
• Tamaño de la perlas: De entre 0.2-1.5 mm de diámetro
• >0.5mm para levaduras y <0.5mm para bacterias
• (-) diámetro = (+) ruptura. Aumenta el número total de perlas.
• Disminuir mucho el diámetro ocasionará que las perlas empiecen a flotar

• Carga de las perlas: Empíricamente la carga óptima fluctúa entre 80 y 90%.

• Depende del tipo de célula y el tamaño de las perlas

• (+) carga = (+) ruptura. Con mayor incremento de temperatura
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Molino de perlas
• Concentración celular
• Desde concentraciones bajas (4-20% de peso seco) hasta altas (40-50% peso
húmedo)
• (-) concentración celular = (-) temperatura

• Temperatura
• (+) temperatura = (+) ruptura
• Productos termolábiles pueden verse afectados por el incremento de
temperatura
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Molino de perlas (diseño)

• Para un molino de perlas operado en lote
ENTRADA – SALIDA + GENERACIÓN = ACUMULACIÓN
𝑑𝑅 𝑅𝑚
= 𝑘 𝑅𝑚 − 𝑅 𝑙𝑛 = 𝑘𝑡
𝑑𝑡 𝑅𝑚 − 𝑅

𝑅: Proteína liberada en el tiempo t [𝑀/𝐿3 ]

𝑅𝑚 : Concentración máxima de proteína liberada [𝑀/𝐿3 ]
𝑘: Constante cinética de ruptura de 1er orden [𝑡 −1 ]
𝑡: Tiempo de operación [𝑡]
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Ejercicio 1
Se quiere liberar proteína intracelular de un caldo de cultivo con 120gPeso seco/L y
densidad de 0.997 kg/L utilizando un molino de perlas con un diámetro de 0.5m.
A partir de los siguientes datos experimentales, determine:

a) La velocidad de agitación óptima (mejor balance entre proteína liberada y

consumo energético)
Nota: Se estima que el 20% del peso seco de las células es
proteína intracelular.

Nota: Para el cálculo de potencia, en este caso, la constante “c”

es igual a 1 𝜌: Densidad [𝑀/𝐿3 ]
𝑁: Velocidad de agitación [𝑟𝑎𝑑/𝑡]
𝐷: Diámetro del molino de perlas [𝐿] 2𝜋
1 𝑟𝑝𝑚 = 𝑟𝑎𝑑/𝑠
𝑐: Constante empírica 60
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Ejercicio 1 (continuación)
• Una vez definida la velocidad de agitación óptima se hacen experimentos
con dos tipos de agitadores a diferentes tiempos de residencia. A partir de
los datos experimentales, determine:
a) La constante cinética de ruptura de cada agitador
b) ¿Cuánto tiempo tarda cada agitador en alcanzar un 80% de ruptura?
c) ¿Qué agitador elegiría para hacer la ruptura? ¿Por qué?
Tiempo de residencia Proteína liberada – Agitador 1 Proteína liberada – Agitador 2
(min) (mg/mL) (mg/mL)
3 1.960 3.097
5 4.492 7.009
10 7.396 9.704
15 9.704 12.644
20 11.972 14.980
25 13.644 16.835
30 15.226 18.627
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𝑘Agitador1 (min−1 ) k Agitador2 (min−1 )

0.033 0.047
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Homogenizador de alta presión

• Son los más utilizados para el rompimiento celular a gran escala

• Rompimiento no selectivo

• Operación tanto en lote como continuo

• Sencillos de escalar

• Dos tipos: Manton-Gaulin y Microfluidizador

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Homogenizador Manton-Gaulin
• Consta de una bomba de pistón de alta presión y una válvula

• La ruptura es debido a las altas presiones, efectos de cavitación y el esfuerzo

de corte líquido una vez que pasan por la válvula

• Tienen altas eficiencias y trabajan con concentraciones

celulares intermedias

• Efectivo para rompimiento de bacterias a partir de

55MPa

• Se necesita equipo de seguridad debido a las altas

presiones alcanzadas.
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Cavitación: http://bit.ly/2ZjNUbB

Pistol shrimp: http://bit.ly/2ZjUoYa

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Homogenizador Manton-Gaulin
• Algunos de los parámetros operacionales más importantes son

• Menor número de parámetros en comparación al molino de perlas, lo que lo

hace más fácil de optimizar
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Homogenizador Manton-Gaulin
• Presión
(+) Presión = (+) ruptura

Dependiendo del producto de interés:

Proteínas se liberan a partir de 10MPa

ADN a partir de 25MPa

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Homogenizador Manton-Gaulin
• Válvula: Dependiendo del diseño de la válvula será la cantidad de producto
liberado.
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Homogenizador Manton-Gaulin
• Concentración celular
• La ruptura es independiente de éste parámetro hasta concentraciones de
100-600 gPeso seco/L en levaduras.

• Temperatura
• (+) Temperatura = (+) ruptura
• Los homogenizadores suelen calentarse menos que los molinos de perlas.
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Microfluidizador
• El rompimiento se consigue al hacer pasar la suspensión celular a través
de microcanales (2 x 100 µm) a gran velocidad que posteriormente
colisionan contra una pared estacionaria.

• Ventajas con respecto al Manton-Gaulin

• Compacto
• Mayor eficiencia de ruptura para bacterias
• Menor presión de operación con eficiencias
similares.
• Más sencillos y seguros de operar

http://bit.ly/322woqf
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Homogenizador de alta presión (diseño)

𝑑𝑅 𝑘′ = 𝑘′′𝑃𝑎
= 𝑘′(𝑅𝑚 − 𝑅)
𝑑𝑁
𝑃: Presión de operación [𝑀/𝑡 2 𝐿]
𝑁: Número de pasos
𝑘′′: Constante dimensional de rompimiento [𝑀−𝑎 𝑡 2𝑎 𝐿𝑎 /𝑝𝑎𝑠𝑜𝑠]
𝑘′: Constante cinética de 1er orden [1/𝑝𝑎𝑠𝑜𝑠]

Microfluidizador
Manton-Gaulin

𝑅𝑚 𝑅𝑚
𝑙𝑛 = 𝑘′′𝑃𝑎 𝑁 𝑙𝑛 = 𝑘′′𝑃𝑎 𝑁 𝑏
𝑅𝑚 − 𝑅 𝑅𝑚 − 𝑅
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Ejercicio 2 (Homogenizador)
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Ejercicio 3 (Microfluidizador)
• Se quiere homogenizar E. coli en un microfluidizador operado a 60MPa.
Conforme a los datos presentados y considerando 𝑏 = 0.7, determine la
constante de ruptura (𝑘′′) y el número de pasos para liberar el 99.5% de
la proteína.
¿Cómo podría reducir el número de pasos?
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k ′′ MPa−a Pasos −b = 1.82385 × 10−4

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Tarea 1
Se utiliza un homogenizador de alta presión (Manton-Gaulin) para el
rompimiento de levaduras (Candida utitilis). A partir de experimentos
previos[1] en un intervalo de presión entre 50 y 125MPa se ha determinado
que la constante de ruptura es igual a 5.91x10-4 MPa-1.77. Se desea obtener
un 90% de ruptura.

Grafique cómo varía el número de pasos en el intervalo de presión

establecido.

¿En que rango de presión operaría ud. el equipo? y ¿Por qué?

[1] Engler, C. R., & Robinson, C. W. (1981). Disruption of Candida utilis cells in high pressure flow devices. Biotechnology and
Bioengineering, 23(4), 765-780.
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Ultrasonicación
• Método de ruptura muy utilizado a nivel laboratorio

• Consiste en la aplicación de ondas ultrasónicas (<25 kHz) para romper las

células en una suspensión celular.

• Los equipos usualmente consisten de una sonda o un baño que genera las
ondas sonoras.

• Parámetros como el volumen y concentración de la muestra pueden afectar

al grado de ruptura
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Células intactas

Disrupción celular y liberación de

proteínas intracelulares

Formación e implosión de burbujas (Cavitación)

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Ultrasonicación
• Tiene algunas desventajas:

• Aumento de temperatura
• Daño a diversas moléculas
• Generación de radicales libres

• Al igual que los métodos de disrupción anteriores la liberación de proteína

intracelular sigue una cinética de primer orden

𝑅𝑚
𝑙𝑛 = 𝑘𝑡
𝑅𝑚 − 𝑅
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Bibliografía
• Harrison, R. G., Todd, P. W., Rudge, S. R., & Petrides, D. P. (2015).
Bioseparations Science and Engineering. Oxford University Press.

• Tejeda Mansir, A., Montesinos Cisneros, R. M., & Guzmán Zamudio, R.

(2011). Bioseparaciones. México: PEARSON EDUCACIÓN.