Purificacin de RNA

IG 2010

Purificacin de RNA
Para qu sirve?
Cmo se trabaja con RNA?
Pasos generales:
Homogeneizar clulas
Purificar el RNA (total o no total, ej mRNA)
Cuantificar el RNA purificado
Calidad del RNA
2

Purificacin de RNA
Para qu sirve?
Cmo se trabaja con RNA?
Pasos generales:
Homogeneizar clulas
Purificar el RNA (total o no total, ej mRNA)
Cuantificar el RNA purificado
Calidad del RNA
3

Usos del RNA purificado

Para identificar un RNA en particular, dentro
de la poblacin total de RNA de la clula
Northern blot
RPA (RNase protection assay)
RT-PCR (transcripcin reversa y posterior
PCR)
Otras cosas: traduccin in vitro, construccin
de cDNA library, etc.
4

1- Northern blot
La sonda es
complementaria
al RNA que se
busca
Es un mtodo
lento y
semicuantitativo
Se ve el
tamao del RNA
de inters
5

2- RPA o ensayo de proteccin

de ribonucleasas
1. La sonda es complementaria al RNA
que se busca. Hibridacin
2. Digestin con RNasa: degrada simple
cadena, se protege RNA de inters
(doble cadena con la sonda)
3. Corrida electrofortica

Ms rpido y cuantitativo (relacin 1 a

1 sonda-RNA) que NB
No se ve el tamao del RNA de
inters (depende de la sonda)
6

3- RT-PCR
1.
2.

3.

Transcripcin reversa
(RT): de RNA a cDNA
PCR: con primers
especficos se puede
amplificar una regin de
inters
Corrida electrofortica
El producto de PCR
indica presencia del
RNA de inters
7

Purificacin de RNA
Para qu sirve?
Cmo se trabaja con RNA?
Pasos generales:
Homogeneizar clulas
Purificar el RNA (total o no total, ej mRNA)
Cuantificar el RNA purificado
Calidad del RNA
8

Manipulacin del RNA

El RNA es degradado por
RNasas, que estn por todos
lados.
Las RNasas son mucho ms
poderosas que las DNasas:
Son termorresistentes en gral
(autoclavar soluciona parcialmente)
No requieren cationes divalentes (as
que EDTA no tiene efecto, a
diferencia de lo que pasa con
DNAsas)
9

Manipulacin del RNA

Cmo vencer a las RNasas?

Evitar la contaminacin
con RNasas:

Impedir (o disminuir) la
accin de las RNasas:

- trabajar con material libre de

- utilizar inhibidores

RNasas (autoclavar soluciones,

material descartable especial,
etc.

especficos

- trabajar con guantes en todo

momento

- trabajar con rapidez y

precisin y a veces en fro,
especialmente cuando no hay
inhibidores presentes
10

Dnde estn las RNasas y cmo

luchamos contra ellas?
1.

2.
3.

4.

PROBLEMA
En uno. (Manos,
saliva, etc)
Tips, epps, etc.
Agua y buffers

Superficies del labo

(por presencia de
bact, hongos, cls
humanas, etc.)

SOLUCIN
1. Guantes, trabajo prolijo

2. Todo RNasa-free
3. Agua mQ autoclavada, o
tratada con DEPC
(DISCUTIR)
4. Evitar contacto, limpiar
con soluciones
comerciales (ej RNase
zap de Ambion) o al
menos con alcohol
11

Dnde estn las RNasas y cmo

luchamos contra ellas? (cont.)
5.
6.

7.

8.

PROBLEMA
RNasas endgenas

5.

Muestras RNA se
contaminan o las RNasas
copurifican
Plsmidos que se usan
para transcripcin in vitro

6.

Pipetas contaminadas con

RNasas

8.

7.

SOLUCIN
Fro (hielo, congelar en N2
lq) y rpido
Usar inhibidores de
RNasas (RNase-out de
Invitrogen, etc)
Si en la mini/maxi prep se
utiliz RNasa, usar
proteinasa K y extraccin
con fenol cloroformo
Tener pipetas para RNA,
aspirar alcohol, usar tips
con filtro, etc.
12

Purificacin de RNA
Para qu sirve?
Cmo se trabaja con RNA?
Pasos generales:
Homogeneizar clulas
Purificar el RNA (total o no total, ej mRNA)
Cuantificar el RNA purificado
Calidad del RNA
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Purificacin de RNA
Para qu sirve?
Cmo se trabaja con RNA?
Pasos generales:
Homogeneizar clulas
Purificar el RNA (total o no total, ej mRNA)
Cuantificar el RNA purificado
Calidad del RNA
14

Homogeneizar las clulas

Es lo primero que hay que hacer para obtener RNA
Tener en cuenta: la lisis libera RNasas endgenas y
las pone en contacto con RNA endgenos. Adems,
hay RNasas exgenas
Este paso es crtico para el rendimiento y la
integridad del RNA obtenido.
Entonces, hay que hacer una LISIS COMPLETA Y
RPIDA
Lisis lenta: RNasas endgenas se contactan con RNA
endgeno
Lisis incompleta: mucho RNA queda atrapado y baja
rendimiento final
15

Homogeneizar las clulas

Clulas o tejidos? Tejidos blandos o duros?
Animal, vegetal, levaduras, bacterias?
Lisis mecnica o enzimtica?
Por ej, algunos tejidos, como pncreas o bazo, son
especialmente ricos en RNasas endgenas
Lisis mecnica: con homogeneizador, vortex, sonicador,
etc.
Lisis enzimtica (ej lisozima) para por ej bacterias o
levaduras, normalmente seguido de lisis mecnica

16

Homogeneizar las clulas

TEJIDOS:
Tejidos frescos: procesar en
fro y que no pasen ms de
30 min.
Ej RNA later (Ambion)
mantiene el tejido fresco
protegiendo al RNA
Si no, congelar: problemas y
ventajas (ej huesos).
Mortero para pulverizar,
temperatura baja. No
descongelar.

CLULAS en cultivo:

En suspensin: centrifugar y
resusp en sc desnat.
Pegadas: lisis en placa o
despegar clulas y lavar con
PBS
17

Purificacin de RNA
Para qu sirve?
Cmo se trabaja con RNA?
Pasos generales:
Homogeneizar clulas
Purificar el RNA (total o no total, ej mRNA)
Cuantificar el RNA purificado
Calidad del RNA
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Purificacin de RNA
En condiciones desnaturalizantes fuertes que
inactivan a las RNasas, por ej:
tiocianato de guanidinio
Agente caotrpico (desnaturaliza prots, DNA y
RNA) poderossimo

LiCl
SDS
fenol

El RNA est en riesgo antes de este paso

(lisis celular), y despus de este paso, pero
no durante.

19

Purificacin de RNA
1. Tiocianato de guanidinio y extraccin con
fenol-cloroformo
2. Tri-Reagent (Ambion. SIGMA), TRI-zol
(Invitrogen), etc. Todos Tri.
3. RNeasy-kit (Qiagen): para RNA total
4. Purificacin de mRNA: Kits enteros ej
bolitas o columnas con oligo dT pegado
(SIGMA, Roche, Invitrogen, Agilent,
Amersham, Ambion, etc)
20

Purificacin de mRNA
El mRNA representa 1-5 % del RNA total de la
clula.
Se elige purificar mRNA para:
Detectar RNAs que estn en poqusima
cantidad
Sintetizar sondas para usar en arrays
Generar libraries de cDNA

Eliminar tRNA y rRNA aumenta 30 veces una seal de

mRNA
Usar mRNAs para esto permite que no se generen
cDNAs complementarios a rRNA y tRNA, que diluyen lo
que uno busca.
21

Purificacin de RNA con

guanidinio
1.
2.

3.

4.

Homogeneizacin/Lisis: Solucin
de tiocianato de guanidinio
Extraccin RNA: extraccin con
fenol cido y luego
cloroformo:isoamlico
Precipitacin RNA: fase acuosa a
otro tubo, precipitar con
isopropanol y lavar con etanol 75%
Solubilizacin RNA: resuspender
el pellet de RNA en algo

TRI-zol, TriReagent y
similares

22

Chomczynski & Sacchi

Analytical Biochemistry, April 1987
Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium
thiocyanate-phenol-chloroform extraction

Nature Protocols, June 2006

QuickTime and a
decompressor
are need ed to see this picture.

23

Cmo se separa el RNA?

El medio cido hace que el RNA

quede en fase acuosa, el DNA en
la interfase, y las protenas
desnaturalizadas en fase
orgnica.
Fenol cido: pH 4,5 (fenol
saturado en agua en vez de en
Tris). Es crtico que sea cido.
CUIDADOS! (por la muestra y
por uno)

- Fenol:cloroformo:isoamlico 25:24:1 , pH 7 o ms en Tris: c nucleicos quedan

en fase acuosa (oxhidrilos negativos). Si es en 2 partes, primero fenol, y luego
clorof:isoamlico 24:1
- Antioxidante en el fenol: discutir

- Cloroformo afina la interfase y disuelve lpidos, y el alcohol isoamlico reduce

24
espuma

Guardado del RNA

purificado
Este es el otro paso crtico, adems de la lisis celular,
que afecta el rendimiento y la integridad del RNA
purificado
Opciones para resuspender el pellet:

Buffer TE (Tris-EDTA)
EDTA 0,1 mM
Agua libre de RNasas
Agua tratada con DEPC (dietilpirocarbonato, inactiva
RNasas porque hace modif. covalentes en -OH, -SH y -NH,
pero DEPC es incompatible con Tris por ej y hay que
eliminarlo autoclavando mn. 1 h y queda CO2 y etanol)

Por poco tiempo: a -80 C (muy poco tiempo a -20 C)

Por mucho tiempo: precipitando en alcohol
25

Purificacin de RNA
Para qu sirve?
Cmo se trabaja con RNA?
Pasos generales:
Homogeneizar clulas
Purificar el RNA (total o no total, ej mRNA)
Cuantificar el RNA purificado
Calidad del RNA
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Cuantificacin del RNA

Absorbancia a 260 nm (espectrofotmetro):
Barato y fcil, pero protenas, nucletidos libres y DNA
tambin absorben
No medir RNA en agua sino en Tris pH neutrish
1 A260 nm = 40 ug RNA/ml

Fluorescencia (fluormetro):
ej RiboGreen (Invitrogen) se pega a cidos nucleicos y
emite fluorescencia
Ms caro pero contaminacin por protenas no afecta y es
ms sensible.
Como no mide prots, se puede poner DNasa para medir
slo RNA
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Purificacin de RNA
Para qu sirve?
Cmo se trabaja con RNA?
Pasos generales:
Homogeneizar clulas
Purificar el RNA (total o no total, ej mRNA)
Cuantificar el RNA purificado
Calidad del RNA
28

Calidad del RNA: integridad

RNA total:
- Se puede chequear en un gel de agarosa nativo o
desnaturalizante.
- Idealmente se espera una relacin 2 a 1 de rRNA
28S respecto del 18S (menos que eso indica
comienzo de degradacin).
- ALTERNATIVA A GEL: Agilent 2100 Bioanalyser
Data (electroferograma)
mRNA:
- Se puede chequear haciendo un Northern con
sonda de housekeeping gene (ej actina o
GAPDH).
- No degradacin se ve banda definida de tamao
correcto.

29

Calidad del RNA:

contaminacin
Absorbancia a 260 nm vs Absorbancia a 280 nm
(espectrofotmetro):
cidos nucleicos absorben con pico en 260 nm y
protenas con pico en 280 nm
Relacin A260/A280 de 1,8 o ms indica pureza. Menos
de 1,6 indica presencia de protenas contaminantes o
trazas de fenol (ojo, absorbancia a 280 depende mucho
del pH - la baja fuerza inica aumenta A280- as que diluir
en TE o Tris)

Agilent 2100 Bioanalyser Data tambin da info

sobre presencia de contaminantes
30

Qu haremos nosotros?
Estudiar la induccin del gen p21 en clulas
tratadas con un agente de dao al ADN
(doxorubicina)
P21 se induce por p53
Utilizaremos clulas HCT116 wt y mutadas para
p53
Algunos grupos trabajarn con clulas wt (con y
sin doxo) y otros con clulas mut (con y sin doxo)

Preparar RNA de las clulas tratadas y no

tratadas, hacer una RT, y hacer una real time
PCR para levantar p21
31

Extraccin de RNA IG 2010

Discutir protocolo pg 42 y 43:
Modo de trabajar: guantes, cuidado, etc
Solucin D y acetato de sodio: se preparan y se guardan a
temp amb
Fenol saturado en agua: saturar!!!, guardar a 4C, CUIDADO!
Clorof:isoamlico 49:1 ojo, se evapora! Vidrio, CUIDADO!
No usamos agua DEPC para las soluciones sino agua mili Q
autoclavada. Ojo
Epps buenos (tapa, fenol) y RNase-free, tips, etc

32

Reaccin de transcripcin
reversa: de RNA a cDNA
Se suele usar la enzima MMLV-RT
tiene menor actividad RNasa H (degrada hbridos RNADNA) que otras RT. Esta actividad es una gran desventaja
al utilizar primers de DNA
Versiones mutantes ej Superscript (Invitrogen) ms
procesivas y que actan a mayor temp, lo que desarma
estruct secundarias)

Primer para la RT
Oligo-dT (reconoce mRNAs)
Primer especfico para un mRNA
Hexmeros al azar

dNTPs
Inhibidor de RNasas
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Transcripcin reversa IG 2010

Discutir protocolo pg 44:
Mezclar RNA total con dNTPs, oligo-dT
Calentar a 65 C por 5 min: el calor desarma estructura
secundaria del RNA
Dejar unos minutos a temp ambiente: el oligo-dT se aparea
con las colas de poliA
Agregar mix con buffer, DTT, RNAse-out (inhibidor de
RNasa) y enzima MMLV-RT
Reaccin de RT 1 hora a 37 C
Calentar a 70 C para terminar la reaccin

34

-Fin-

35