TEMA 2

PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE ENZIMAS A PARTIR DE ALIMENTOS
Procedencia comercial de las enzimas:
microbianas, de plantas, de animales

Etapas en la obtención de enzimas industriales:
selección de la fuente  optimización de la producción  extracción, aislamiento y purificación ingeniería y diseño de enzimas

TEMA 2

PROCEDENCIA COMERCIAL DE LAS ENZIMAS ANIMALES PLANTAS MICROORGANISMOS

CULTIVOS CELULARES

Los microorganismos pueden ser modificados genéticamente para producir mayor cantidad de enzima. Fácil escalado Las enzimas microbianas son más estables que sus homólogas de plantas y animales. La recuperación de las enzimas microbianas suele ser fácil. son extracelulares.TEMA 2 Los microorganismos son la fuente principal de enzimas de aplicación industrial. tienen velocidades crecimiento y de producción de enzimas muy alta (baratas. puesto que. abundantes) de La tecnología a gran escala para su producción se encuentra hoy bien establecida. . generalmente. Presentan numerosas ventajas Los microorganismos son muy versátiles y teóricamente se puede encontrar un microorganismo que produzca un enzima concreto. Los microorganismos son fáciles de cultivar. La producción de enzimas microbianas requiere materias primas fáciles de conseguir ya que crecen en medios de cultivo con escasos requerimientos.

Para obtener el producto es necesario romper las células y separar el producto de los restos celulares. Glucosa isomerasa. Operación difícil y costosa Las enzimas aparecen contaminadas con otras proteínas intracelulares. la separación de las células del medio de cultivo permite obtener preparados muy concentrados que facilitan la purificación . a-galactosidasa pullulanasa y lactasa. Actúan sobre sustratos de bajo peso molecular.TEMA 2 ENZIMAS INTRACELULARES: permanecen en el interior de la célula. penicilin acilasa. Es necesaria la integridad de la célula para que se sintetice el enzima y preservar su estabilidad. glucosa oxidasa.

Se sintetizan en grandes cantidades. . no se requieren técnicas de ruptura celular que a veces son difíciles de aplicar a gran escala.TEMA 2 ENZIMAS EXTRACELULARES: actúan sobre sustratos de alto peso molecular. Hidrolasas Dado que la molécula es segregada fuera de la célula. El número de proteínas que se segregan es limitado y por eso es relativamente fácil aislar una enzima concreta a partir de una mezcla Las enzimas extracelulares suelen presentar una estructura más compacta y menos susceptibles a la desnaturalización que las correspondientes intracelulares. Muy reguladas.

TEMA 2 ETAPAS EN LA OBTENCIÓN DE ENZIMAS INDUSTRIALES Selección de la fuente Producción de células con un alto nivel de la enzima Rotura celular y eliminación de los restos celulares (enzimas intracelulares) Concentración y enriquecimiento Purificación con alta resolución (dependiendo de su uso final) Concentración y formulación del preparado .

• Constitutiva o inducible. • Requerimientos nutricionales. • Mecanismos de control de su síntesis. • Intracelular o extracelular. de enzima y su Experimentación previa en el laboratorio: • Ciclo celular. .TEMA 2 OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN Maximizar la velocidad de síntesis concentración para reducir costos.

TEMA 2 OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN Selección de una cepa. Factores a considerar:  criterios de seguridad: daños sobre el producto (propio organismo o por un metabolito) contaminación con toxinas debe crecer en medios simples y baratos estable en sus propiedades genéticas producir alta cantidad de producto en poco tiempo fácil de separar ORGANISMOS TERMÓFILOS . a partir del medio natural o de colecciones de cultivo.

Hibridación 3. Mutación y selección 2.TEMA 2 OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN Mejora de estirpes Incrementar la productividad de la enzima Reducir o eliminar enzimas contaminantes Conseguir su síntesis sin necesidad de inductores Permitir su síntesis en condiciones inadecuadas 1. Tecnología de ADN recombinante .

etc) Propiedades de la enzima: Inducción Represión por catabolitos Inhibición por producto Mecanismos de liberación ESTERILIZACIÓN EXTRACCIÓN DE LA BIOMASA Y RECUPERACIÓN DE ENZIMA .S.O. Mg. P. Consideraciones: Requerimientos nutricionales (C. N. Ca.TEMA 2 OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN Formulación y preparación del medio de cultivo: baratos y fáciles de reproducir.

TEMA 2 OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN Diseño del equipo y del proceso de fermentación FERMENTACIÓN EN SUSTRATO SÓLIDO: sustrato insoluble sin fase líquida libre El proceso está limitado a hongos Difícil medida de los parámetros del proceso Difícil control del pH. Tª. transferencia de oxígeno La mayoría de los sustratos requieren un pretratamiento Medios de cultivo muy simples No suele haber contaminación bacteriana.ESTERILIZACIÓN Enzima se recoge muy concentrado No es necesario mantener inóculos FERMENTACIÓN SUMERGIDA .

.TEMA 2 PURIFICACIÓN Consideraciones Generales  Necesidad de purificación Pérdida del enzima: pérdida física inactivación     pH y temperatura formación de espuma Proteasas agentes quelantes.

TEMA 2 FACTORES QUE INACTIVAN LAS ENZIMAS DURANTE SU AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN Factor inactivante Fuente de enzima frecuencia Modo de contrarrestarlo Calor Frio Proteasa Productos oxidación de fenoles oxidación Dilución proteína Pérdida de estabilidad Inhibidores específicos Metales pesados Cambios de fase cualquiera cualquiera mayoría Plantas y hongos universal raro Común Bastante común Enfriamiento Calentamiento Inhibidores de proteasas o frío Agentes reductores cualquiera cualquiera cualquiera Plantas y bacterias cualquiera cualquiera común Bastante común Bastante común Raro Raro común Agentes reductores Concentración rápida Restauración de ese factor Separación del inhibidor Agentes quelantes Mínima agitación .

TEMA 2 EXTRACCIÓN. AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN MATERIAL DE PARTIDA ROTURA CELULAR Detergente Tratamiento con álcali Tamización líquida Agitación con abrasivos Tratamiento enzimático Choque osmótico Tamización sólida ELIMINACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS SEPARACIÓN SÓLIDO-LÍQUIDO Centrifugación CONCENTRACIÓN Filtración Precipitación Adsorción Secado Liofilización PURIFICACIÓN Ultrafiltración Cromatografía Sistemas en dos fases .

TEMA 2 EXTRACCIÓN CONSIDERACIONES PARTICULARES: SEGÚN LA NATURALEZA INTRACELULAR O EXTRACELULAR necesidad o no de rotura celular SEGÚN LA FUENTE DE ENZIMA: Microorganismos Animales Vegetales .

TEMA 2 ELECCIÓN DEL MÉTODO DE ROTURA  Susceptibilidad de la célula  Características de estabilidad del enzima  Velocidad del método  Facilidad de separación de los restos celulares  COSTE del proceso .

Métodos químicos de lisis celular: 1.2 lisozima y EDTA 1.2 shock por enfriamiento 2.1 álcali 1.3 choque osmótico 2.3 detergentes: iónicos no iónicos 2.5 tamización sólida 2.TEMA 2 MÉTODOS DE ROTURA 1. Métodos físicos de lisis celular: 2.1 sonicación 2.7 tamización líquida .4 congelación y descongelación 2.6 homogeneización con abrasivos 2.

AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN MATERIAL DE PARTIDA ROTURA CELULAR Detergente Tratamiento con álcali Tamización líquida Agitación con abrasivos Tratamiento enzimático Choque osmótico Tamización sólida ELIMINACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS SEPARACIÓN SÓLIDO-LÍQUIDO Centrifugación CONCENTRACIÓN Filtración Precipitación Adsorción Secado Liofilización PURIFICACIÓN Ultrafiltración Cromatografía Sistemas en dos fases .TEMA 2 EXTRACCIÓN.

nucleasas 2º paso: Eliminación de restos celulares: Centrifugación Filtración 3er paso: Concentración: Precipitación Adsorción Ultrafiltración Secado Liofilización .TEMA 2 CONCENTRACIÓN Y ENRIQUECIMIENTO 1er paso: Eliminación de ácidos nucleicos: pH alto. fuerza iónica baja.

TEMA 2 AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN: CENTRIFUGACIÓN • Centrífugas discontinuas • Centrífugas de flujo continuo: De disco De rotor tubular De cestillo .

Fácil escalado .TEMA 2 AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN: FILTRACIÓN • Ultrafiltración: – – – – Opera a temperatura y presión baja Suave y no destructiva No hay inactivación del enzima Económica • Filtración de flujo tangencial.

TEMA 2 AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN: CONCENTRACIÓN Precipitación Sulfato amónico Solventes orgánicos Polímeros de alto peso molecular Adsorción     polisacáridos aniónicos polisacáridos catiónicos Cromatografía de afinidad Otros Ultrafiltración Secado  Evaporación rotatoria  Secado en spray  liofilización .

. • El objetivo principal es purificar grandes cantidades en el menor tiempo posible (flujos elevados).TEMA 2 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN: CROMATOGRAFÍA Cromatografía a gran escala: • Se pueden aplicar los mismos métodos que en cromatografía analítica. Eliminación material particulado. • Fácilmente escalable (aumento del diámetro de la columna) • Optimización previa en el laboratorio. evitar la adsorción inespecífica y contaminación bacteriana. • Saltos de escala progresivos. • Destino final del producto (posible presencia de contaminantes) • Selección del tipo de matriz.

TEMA 2 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN: Cromatografía Tipo de matriz Dextrano con enlaces entrecruzados Poliacrilamida entrecruzados Agarosa Agarosa con enlaces entrecruzados Compuesto poliacrilamida/dextrano Compuesto poliacrilamida/agarosa Polímero acrílico hidroxilado Copolímero etilenglicol-metacrilato Celulosa Sílice porosa Polímero orgánico rígido con enlaces Porosidad Baja Baja Alta Alta Alta Media Media Baja/media Media/alta Baja/media Media/alta Adsorción noespecífica Baja Baja Baja Baja Media Baja Media Media Alta Alta Baja Rigidez Baja Baja Baja Media Media Media Media Media Baja Alta Alta Estabilidad Buena Buena Deficiente Buena Buena Buena Buena Buena Buena Deficiente Buena Facilidad de modificación buena buena buena buena buena buena buena buena buena deficiente buena Coste relativo Bajo/medio Medio Medio Medio Medio Medio/alto Medio Medio Bajo Alto Alto .

TEMA 2 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN Cromatografía Intercambio iónico Cromatoenfoque Afinidad Interacción hidrofóbica Filtración en gel HPLC Sistemas acuosos en dos fases .

Puede ser utilizada en cualquier fase. Es más efectiva en las primeras fases del fraccionamiento cuando se van a manipular grandes volúmenes. La velocidad puede ser alta Resolución buena Capacidad muy alta y no limitada por el volumen de muestra.TEMA 2 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN: Cromatografía Característica molecular aprovechada Tamaño Tipo de cromatografía Filtración en gel Características Resolución moderada para el fraccionamiento y buena para tampones intercambiadores. La velocidad puede ser muy elevada dependiendo de la matriz. Cromatoenfoque Es mejor usarla en una purificación posterior. Velocidad alta. pero es mejor aplicarla cuando la fuerza iónica es alta tras la precipitación con sales o después de un inter-cambio iónico Puede emplearse en cualquier etapa. Velocidad alta La resolución puede ser elevada. Capacidad puede ser alta o baja. aunque normalmente no es recomendable en las primeras fases Polaridad Interacción hidrofóbica Afinidad biológica Afinidad . La capacidad puede ser alta. La resolución puede ser alta. ya que las matrices son caras. Capacidad limitada por el volumen de la muestra Aplicación El fraccionamiento es mejor en las últimas etapas de la purificación. Capacidad alta no limitada por el volumen de la muestra. dependiendo del ligando y no limitada por el volumen de la muestra. En cualquier momento se pueden usar tampones intercambiadores y podrá existir una limitación respecto al volumen de muestra Carga Intercambio iónico La resolución puede ser alta.

Mezcla y equilibrado .separación Protein recovery using two-phase systems. Trends in Biotechnology.TEMA 2 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN Solución acuosa de dos polímeros PEG y dextrano Sistemas acuosos en dos fases: Solución acuosa de un polímero y una sal PEG y fosfato potásico Proteínas hidrofóbicas Proteínas hidrofílicas fase superior (rica en PEG) fase inferior .Operación: .Aplicaciones: separación de restos celulares enriquecimiento para posteriores pasos de purificación concentración y purificación de proteínas en baja concentración . 3:6 (139-144) 1985 .

.  Dirigir la proteína sintetizada de novo al periplasma de la célula.TEMA 2 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN Diseño de enzimas:  La fusión de un gen de interés a secuencias promotoras eficientes hace que una proteína se sobreexprese.  Adición de colas de afinidad.

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