UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Bioquímica Avanzada
Pedro Jorge Chimoy Effio
 Contenido de la clase
• Transporte de solutos a través de membranas:

a) Transportadores proteicos, difusión pasiva y activa

b) Transportadores uniport, sinport y antiport,

c) Na+-K+ ATPasa, tipos de ATPasas

d) Transportadores ABC, ionóforos, acuaporinas, canales

iónicos.
Movimiento de solutos a través de una membrana permeable. (a) El movimiento efectivo de un soluto eléctricamente neutro se dirige
al lado de la concentración de soluto más baja hasta alcanzar el equilibrio. Las concentraciones de soluto en los lados izquierdo y
derecho de la membrana se designan como C 1 y C2. La tasa de movimiento de los solutos transmembranosos (indicados por flechas) es
proporcional a la relación entre concentraciones. (b) El movimiento efectivo de un soluto cargado eléctricamente está determinado por la
combinación de potencial eléctrico (V m) y por la relación entre las concentraciones químicas (C 2/C1) a través de la membrana; el
movimiento iónico resultante continúa hasta que el potencial electroquímico llega a cero.
Variación de energía que acompaña el paso de un soluto hidrófilo a
través de la bicapa lipídica de una membrana biológica. (a) En la
simple difusión, eliminación de la capa de hidratación es altamente
endergónica, y la energía de activación (G‡ ) para la difusión a través
de la bicapa es alta. (b) Una proteína transportadora reduce la G‡ para
la difusión transmembrana del soluto. Esto se debe a la formación de
interacciones no covalentes con el soluto deshidratado, por la sustitución
de enlaces de hidrógeno con el agua y por el establecimiento de una vía
hidrófila transmembrana.
Diferencias entre canales y transportadores. (a) En un canal iónico,
un poro de transmembrana está abierto o cerrado, dependiendo de la
posición de la puerta única. Cuando está abierto, los iones pasan a través
de velocidad limitada únicamente por la velocidad máxima de difusión
de la equilibrar. (b) Los transportadores (bombas) tienen dos puertas,
que nunca están abiertos al mismo tiempo. El movimiento de un sustrato
(un ión o una molécula pequeña) a través de la membrana, por lo tanto,
está limitada por el tiempo necesario para que una puerta se abra y cierre
(en un lado de la membrana) y para que se abra la segunda puerta. La
velocidad de movimiento a través de los canales iónicos puede tener
órdenes de magnitud por encima de la velocidad de movimiento a través
de las bombas, pero los canales permiten el flujo de los iones sólo a
favor de sus gradientes electroquímicos, mientras que las bombas
pueden mover sustratos contra su gradiente de concentración.
Topología de la membrana del transportador de glucosa GLUT1. (a) Las hélices transmembranas se representan aquí como filas
oblicuas (angulares) con tres o cuatro residuos de aminoácidos, cada fila representando un retorno de la hélice a. Nueve de las doce hélices
contienen tres o más residuos polares o cargados (en azul o rojo), generalmente separados por varios residuos hidrofóbicos (en amarillo).
Esta representación de topología no está pensada para ilustrar la estructura en tres dimensiones. (b) Un diagrama de una rueda helicoidal
muestra la distribución de residuos polares y no polares en la superficie de un segmento helicoidal. La hélice se representa en el diagrama
supuestamente observado a lo largo de su eje, desde su extremo aminoterminal. Los residuos adyacentes en la secuencia lineal están
conectados, y cada residuo se coloca alrededor de la rueda en la posición que ocupa en la hélice; Recuerde que se necesitan 3,6 residuos
para hacer un giro completo de la hélice a. En este ejemplo, los residuos polares (en azul) están en un lado de la hélice y los residuos
hidrofóbicos (en amarillo) están en el otro. Esta es, por definición, una hélice anfipática. (c) La asociación lado a lado de cuatro hélices
anfipáticas, cada una con su fase orientada hacia el centro de la cavidad central, puede producir un canal transmembrana recubierto de
residuos polares (y cargados). Este canal ofrece muchas oportunidades para enlaces de hidrógeno con glucosa a medida que se mueve a
través del canal.
Modelo de transporte de glucosa para dentro del
eritrocito por GLUT1. El transportador existe en dos
conformaciones: T1, con el sitio de unión a la glucosa
expuesta en la superficie exterior de la membrana y T 2, con
el sitio de unión expuesto en la superficie interior. El
transporte de glucosa se produce en cuatro pasos. 1 La
Glucosa plasmática se conecta al sitio estereoespecífico
enT1; esto reduce la energía de activación para un 2 cambio
de conformación de glucosa fuera· T1 para glucosa dentro·
T2, efectuando el paso transmembrana de la glucosa. 3 La
glucosa es liberada de T2 al citoplasma, y 4 el transportador
vuelve a la conformación T1, listo para llevar otra molécula
de glucosa.
La glucosa transporta cinética al eritrocito. (a) La velocidad
inicial de entrada de la glucosa al eritrocito, V0, depende de la
de la concentración inicial de glucosa en el exterior, [S] fuera.
(b) El grafico de la doble reciproca de los datos en (a). La
cinética de la difusión facilitada es análoga a la cinética de la
reacción catalizada por una enzima. Tenga en cuenta que Kt es
análogo a Km, la constante de Michaelis.
El transporte de glucosa a un miocito por
GLUT4 está regulado por insulina
Intercambiador cloruro-bicarbonato de la membrana
eritrocitaria. Este sistema de cotransporte permite que el
HCO3- entre y salga sin cambiar el potencial de
membrana. Su función es aumentar la capacidad de la
sangre para transportar CO2. La mitad superior de la
figura ilustra los eventos que ocurren en la respiración en
los tejidos; la mitad inferior, los eventos que ocurren en
los pulmones.
Tres clases generales de sistemas de transporte.
Los Transportadores difieren en el número de
solutos (sustratos) transportados y en la dirección
en la que se mueve cada soluto. Ejemplos de los
tres tipos de transportadores son discutidos. Tenga
en cuenta que esta clasificación no dice si estos
procesos requieren energía (transporte activo) o si
son independientes de la energía (transporte
pasivo).
Dos tipos de transporte activo. (a) En el transporte
activo primario, la energía liberada por la hidrólisis de
ATP impulsa el movimiento de soluto (S1) contra el
gradiente electroquímico. (b) En el transporte activo
secundario, el gradiente de un ion X (S1) (generalmente
Na+) se establece por transporte activo primario. El
movimiento de X (S1) a favor de su gradiente
electroquímico ahora proporciona energía para impulsar
el cotransporte de un segundo soluto (S2) contra su
gradiente electroquímico.
La estructura general de las ATPasas de tipo P. (a) Las ATPasas de tipo P tienen tres dominios citoplásmicos (A, N y
P) y dos dominios transmembrana (T y S) que consta de múltiples hélices. El dominio N (nucleótido) se une a ATP y
Mg2+, y tiene actividad de proteína quinasa que fosforila el residuo de Asp específico que se encuentra en el dominio P
(fosforilado) de todas las ATPasas de tipo P. El dominio A (actuador) tiene actividad de proteína fosfatasa y elimina la
grupo fosforilo del residuo Asp en cada ciclo catalítico de la bomba. El dominio de transporte (T), con seis hélices
transmembrana, incluye la estructura de transporte de iones, y otras cuatro hélices transmembrana soportan el dominio
(S), que proporciona soporte físico al dominio de transporte y puede tener otra función especializada en ciertas ATPasas
tipo P. Los sitios de unión para los iones que se transportarán están cerca de la mitad de la membrana, de 40 a 50 Å del
residuo de Asp fosforilado; por lo tanto, la fosforilación-desfosforilación de Asp no afecta directamente la unión de iones.
El dominio A comunica los movimientos de los dominios N y P a los sitios de unión de iones.
 La estructura general de las ATPasas de tipo P. (b) Una representación en cinta de Ca 2+ ATPasa (bomba
SERCA) (PDB 1T5S). El ATP se une al dominio N y los iones Ca 2+ que se transportan se unen al dominio T. (c)
Otras ATPasas de tipo P tienen estructuras de dominio, y probablemente mecanismos, como la bomba SERCA: la
ATPasa Na+ K+ (PDB ID 3KDP), H+ ATPasa de membrana plasmática (PDB ID 3B8C) y H+ K+ ATPasa gástrica
(derivada de PDB ID 3IXZ).
Mecanismo postulado para la bomba SERCA.
El ciclo de transporte comienza con la proteína en la
conformación E1, con los sitios de unión al Ca 2+ expuestos
al citosol. Dos iones Ca2+ se unen y luego el ATP se une al
transportador y fosforila al Asp351, formando E1-P. La
fosforilación favorece la segunda conformación, E2-P, en
la que los sitios de unión de Ca2+, ahora con afinidad
reducida por Ca2+, son accesibles en el otro lado de la
membrana (espacio extracelular o lumen) y el Ca 2+ se
difunde hacia afuera. Finalmente, E2-P es desfosforilado,
devolviendo la proteína a la conformación E1 para otro
ciclo de transporte.
Papel de la Na+K+-ATPasa en células animales.
En las células animales, el sistema de transporte activo es
responsable principalmente para el establecimiento y
mantenimiento de las concentraciones intracelulares de Na + y K+
y para la generación del potencial de membrana. Lo hace sacando
tres Na+ de la celda. por cada dos K+ que se mueva hacia adentro.
El potencial eléctrico a través de la membrana plasmática es
esencial en la señalización de neuronas,y el gradiente de Na + se
utiliza para impulsar "corriente arriba" el cotransporte de soluto
en muchos tipos de células.
Dos bombas de protones con estructuras similares
(a) La ATPasa H1 VoV1 usa ATP para bombear protones hacia vacuolas y lisosomas, creando pH interno bajos. Tiene un dominio integral
(insertado en la membrana) Vo (en naranja) que incluye múltiples subunidades idénticas y un dominio periférico que sobresale hacia el
citosol y que contiene el sitio de hidrólisis de ATP ubicado en tres subunidades B idénticas (en violeta). (b) La ATPasa mitocondrial F oF1
/ ATP sintasa tiene un dominio integral, F o (en naranja), con múltiples copias de la subunidad c, y un dominio periférico, F 1, que consta
de tres subunidades , tres subunidades  y una varilla central unido al dominio integral. F o y presumiblemente Vo proporcionan un
canal transmembrana a través del cual se bombean protones cuando el ATP se hidroliza en la subunidad  de F1 (subunidades B de V1).
La hidrólisis del ATP se acopla al movimiento de los protóns. Implica la rotación de F o en el plano de la membrana. Las estructuras de
ATPasa VoV1 y sus análogos ATPasa AoA1 (de arqueas) y ATPasa CFoCF1 (de cloroplastos) son esencialmente similares a las de ATPasa
FoF1 y los mecanismos también se conservan. Un transportador de protones impulsado por ATP también puede catalizar la síntesis de
 (a)

Dos transportadores ABC. (a) El transportador de múltiples fármacos de células animales,

(b) (MDR1, también llamado glicoproteína P: PDB IB 3G60) responsable de bombear una variedad de
fármacos antitumorales fuera de las células humanas, tiene dos mitades homólogas (en azul y azul
claro), cada una con seis hélices transmembrana en dos dominios transmembrana (TMD, del
dominio transmembrana; en azul) y un dominio citoplasmático unión de nucleótidos (NBD, de
dominios de unión de nucleótidos; en rojo). (b) El importador de vitamina B12, BtuCD (PDB ID 1
L7V) de E. coli, es un homodímero con 10 hélices transmembrana (en azul y azul claro) en cada
monómero, y dos dominios NBD (en rojo) que se extienden en el citoplasma. (c) Mecanismos
propuestos para acoplar la hidrólisis de ATP transporte de vitamina B12 al transportador ABC de E.
coli. El sustrato se lleva al portador en el lado periplásmico mediante una proteína de unión
específica del sustrato. Con el ATP adherido a los sitios NBD, el portador se abre hacia el exterior
(periplasma), pero en el momento en que el sustrato se une y el ATP se hidroliza a ADP 1 Pi, un
cambio conformacional expone el sustrato a la superficie interna y se difunde desde el portador. al
citosol.
Tres estados del regulador de conductancia
transmembrana de fibrosis quística, CFTR. La
proteína tiene dos segmentos, cada uno con seis
hélices transmembrana, y tres dominios
funcionalmente significativos se extienden desde la
superficie citoplásmica: NBD1 y NBD2 (en verde)
son dominios de unión a nucleótidos que se unen a
ATP, y un dominio regulador R (en azul) es el sitio
de fosforilación de la proteína quinasa dependiente
de AMPc. Cuando este dominio R está fosforilado,
pero el ATP no se une al NBD (izquierda), el canal
está cerrado. La conexión ATP abre el canal (centro)
hasta que se hidroliza el ATP conectado. Cuando el
dominio regulador se desfosforila (derecha), se une
al dominio NBD y evita la unión de ATP y la
apertura del canal. La mutación que ocurre con
mayor frecuencia y que conduce a la FQ es la
deleción de Phe508 en el dominio NBD1
(izquierda). CFTR es un transportador ABC típico
en todo, excepto en dos aspectos: la mayoría de los
transportadores ABC no tienen dominio regulador y
CFTR actúa como un canal de iones (para Cl2), no
como un transportador típico.
Captación de lactosa en E. coli. (a) El transporte primario de H1 fuera de la célula, impulsado por la
oxidación de una amplia variedad de combustibles, establece tanto un gradiente de protones como un gradiente
eléctrico (interior negativo) a través de la membrana. El transporte activo secundario de lactosa al interior de la
célula implica el soporte de H1 y lactosa por el transportador de lactosa. La captación de lactosa contra su
gradiente depende completamente de este influjo de protones impulsado por el gradiente electroquímico. (b)
Cuando las reacciones de oxidación metabólica que producen energía son bloqueadas por cianuro (CN -), el
transportador de lactosa permite el equilibrio de lactosa a través del membrana mediante transporte pasivo. Las
mutaciones que afectan a Glu325 o Arg302 tienen el mismo efecto que el cianuro. La línea de puntos representa
la concentración de lactosa en el entorno circundante.
El transportador de lactosa de E. coli (lactosa - permeasa). (a) Representación en forma de cinta en una vista paralela al plano de
la membrana que muestra las 12 hélices transmembrana dispuestas en dos dominios aproximadamente simétricos, en diferentes
tonalidades de violeta. En la forma de la proteína para la que se determinó la estructura cristalina, el sustrato de azúcar (en rojo) se
adjunta cerca del centro de la membrana donde el azúcar se expone al citoplasma (derivado de PDB ID 1PV7). (b) La segunda
conformación postulada del portador (PDB ID 2CEQ), relacionada con la primera por un cambio conformacional grande y reversible
en el que el sitio de unión del sustrato se expone primero al periplasma, desde donde se captura la lactosa, y luego a el citoplasma,
donde se libera lactosa. La interconversión entre las dos formas está impulsada por cambios en el emparejamiento de cadenas laterales
cargadas (protonables) como las de Glu325 y Arg302 (en verde), que se ve afectado por el gradiente de protones transmembrana.
Transporte de glucosa en células epiteliales
intestinales. La glucosa se cotransporta con
Na⁺ al interior de la célula epitelial a través de
la membrana plasmática apical. Viaja a lo largo
de la célula hasta la superficie basal, donde
pasa a la sangre a través de GLUT2, un
unipuerto pasivo de glucosa. Na⁺K⁺-ATPasa
continúa bombeando Na⁺ para mantener el
gradiente de Na⁺ que impulsa la captación de
glucosa.
Valinomicina, un péptido ionóforo que se une a K⁺.
En esta imagen, el contorno de la superficie aparece
como una envoltura amarilla, a través de la cual se ven
una estructura de varilla del péptido y un ión K ⁺ (en
verde). Los átomos de oxígeno (en rojo) que conectan
K⁺ son parte de una cavidad hidrofílica central. Las
cadenas laterales de aminoácidos hidrófobos (en
amarillo) cubren el exterior de la molécula. Como el
exterior del complejo de K⁺ -valinomicina es
hidrófobo, el complejo se difunde fácilmente a través
de la membrana, llevando el K⁺ a favor de su gradiente
de concentración. La disipación del gradiente de iones
transmembrana resultante mata las células microbianas,
lo que convierte a la valinomicina en un potente
antibiótico.
Acuaporina. La proteína es un tetrámero de subunidades idénticas, cada una con un poro transmembrana. (a)
Un monómero de acuaporina de espinaca SOPIP 2:1 (derivado de PDB ID 2B5F), visto en el plano de la
membrana. Las hélices forman un poro central, y dos segmentos helicoidales cortos (en verde) contienen las
secuencias Asn - Pro - Ala (NPA), que se encuentran en todas las acuaporinas que forman parte del canal de
agua. (b) Este diseño de acuaporina bovina 1 (derivado de PDB ID 1J4N) muestra que el poro (en marrón;
lleno de moléculas de agua que se muestran en rojo y blanco) se estrecha en His180 hasta un diámetro de 2.8 Ǻ
(aproximadamente el tamaño de la molécula de agua) , limitando el paso de moléculas mayores que H ₂0. La
carga positiva de Arg195 repele los cationes, incluido el H₃0⁺, impidiendo su paso a través del poro. Las dos
hélices cortas que se muestran en verde están orientadas con sus dipolos cargados positivamente apuntando
hacia el poro, para forzar a la molécula de agua a reorientarse. a su paso, esto rompe las cadenas de enlaces de
hidrógeno en las moléculas de agua, evitando que los protones pasen por el "salto de protones".
Medición eléctrica de la función del canal de iones. La
“actividad” de un canal iónico se estima mediante una medida del
flujo de iones a través del canal, utilizando la técnica de fijación
de membrana. Se presiona una micropipeta contra la superficie
celular y se aplica una presión negativa a la pipeta para formar un
sello. por presión entre la pipeta y la membrana. A medida que la
pipeta se extrae de la celda, también tira de una parte muy
pequeña de la membrana (que puede contener uno o varios
canales iónicos). Después de colocar la parte de la membrana
sujeta por la pipeta en solución acuosa, el investigador puede
medir la actividad del canal en forma de corriente eléctrica que
fluye entre el contenido de la pipeta y la solución acuosa. Luego
se mide la corriente que debe fluir para mantener ese voltaje. Con
detectores de corriente de alta sensibilidad, los investigadores
pueden medir la corriente que fluye a través de un solo canal
iónico, generalmente de unos pocos picoamperes. La traza
muestra la corriente a través de un solo canal receptor de
acetilcolina en función del tiempo (en milisegundos), revelando
qué tan rápido se abre y se cierra el canal, con qué frecuencia se
abre y cuánto tiempo permanece abierto. La deflexión hacia abajo
representa la apertura del canal. El ajuste de V a diferentes valores
permite determinar el efecto del potencial de membrana en estos
parámetros de función del canal.
El canal K de Streptomyces lividans. (PDB ID 1BL8) (a) Visto desde el
plano de la membrana, el canal consta de ocho hélices transmembrana (dos
de cada una de las cuatro subunidades idénticas), que forman un cono con
su extremo ancho hacia el espacio extracelular. Las hélices internas del
cono (con un color más suave) recubren el canal transmembrana y las
hélices externas interactúan con la bicapa lipídica. Los segmentos cortos
de cada subunidad convergen en la parte del extremo abierto del cono para
formar un filtro de selectividad. (b) En esta vista, perpendicular al plano de
la membrana, las cuatro subunidades aparecen dispuestas alrededor de un
canal central lo suficientemente ancho como para que pase un ion K ⁺
único. (c) Diagrama de un canal K⁺ en sección transversal, mostrando las
características estructurales críticas para la función. El oxígeno carbonilo
(en rojo) en el filtro de selectividad del esqueleto peptídico sobresale hacia
el canal, interactuando y estabilizando el ion K ⁺ que pasa a través de él.
Estos ligandos están perfectamente posicionados para interactuar con cada
uno de los cuatro iones K⁺, pero no con los iones Na ⁺ más pequeños. Esta
interacción preferencial con K⁺ es la base de la selectividad iónica.
Base estructural para la apertura controlada por voltaje
en el canal K⁺. (ID de PDB 2A79). Esta estructura cristalina del
complejo de subunidades Kv1.2 - β2 del cerebro de rata muestra el
canal K⁺ básico con la maquinaria adicional necesaria para hacer
que el canal sea sensible para abrirse de acuerdo con el potencial de
membrana: cuatro extensiones transmembrana helicoidales de cada
subunidad y cuatro subunidades β. Todo el complejo visto (a) en el
plano de la membrana y (b) perpendicular al plano (visto desde
fuera de la membrana), cada subunidad en un color diferente; cada
una de las cuatro subunidades y coloreadas con el mismo color que
la subunidad con la que está asociada. En (b), cada hélice
transmembrana de una subunidad (en rojo) está numerada, de S1 a
S6.S5 y S6 de cada una de las cuatro subunidades, formando el
propio canal. S1 a S4 son cuatro hélices transmembrana. La hélice
S4 contiene residuos de Arg altamente conservados y se cree que es
la parte principal que se mueve en el mecanismo sensible al voltaje.
(c) Un diagrama esquemático del canal controlado por voltaje, que
muestra la estructura básica del poro (centro) y las estructuras
adicionales que hacen que el canal sea sensible al voltaje; la hélice
S4 que contiene los residuos de Arg es naranja. Para mayor claridad,
las subunidades β no se muestran en esta vista. En la membrana en
reposo, el potencial eléctrico transmembrana (interior negativo)
ejerce una atracción sobre las cadenas laterales del Arg cargado
positivamente en S4, hacia el lado citosólico. Cuando la membrana
se despolariza, la atracción se reduce y, con la inversión completa
del potencial de membrana, S4 se empuja hacia el lado extracelular.
(d) Este movimiento de S4 está acoplado físicamente a la apertura y
cierre del canal K⁺, que se muestra aquí en sus conformaciones
abierta y cerrada. Aunque K⁺ está presente en el canal cerrado, el
poro se cierra en la base, cerca del citosol, impidiendo el paso de
• Calcule el coste energético (variación de energía libre) de bombear un
soluto no cargado contra un gradiente de concentración de 1,0 X 104
veces, a 25°C
• Resolviendo,
Calcule el coste energético (variación de energía libre) de bombear Ca 2+ desde el citosol, en donde su
concentración es alrededor de 1,0 X 10-7M, al fluidoextracelular en donde su concentración es alrededor de
1,0mM. Suponga una temperatura de 37°C (Temperatura corporal de un mamífero) y un potencial
transmembrana estándar de 50mV (negativo en el interior) para la membrana plásmatica.
En este cálculo, han de tenerse en cuenta tanto el gradiente de concentración como el potencial eléctrico.
Observe que el potencial transmembrana estándar de 50mV (negativo en el interior) por lo que el cambio en
potencial cuando un ión se desplaza desde el interior al exterior es 50mV.
 Referencias

Voet J. & D.Voet. 2007. Bioquímica. 2da. OMEGA. España.

Nelson DL & Cox MM. 2009. Principios de Bioquímica. 5ta. Ed. Omega. Barcelona.