PROTEINOGRAMA ELECTROFORETICO

1. PROTEINAS PLASMATICAS

1.1. Composición de la sangre

La sangre es un tejido que circula dentro del sistema de los vasos sanguíneos. Está
compuesta por elementos figurados (eritrocitos o glóbulos rojos, leucocitos o glóbulos blancos y
plaquetas) y por el plasma que mantiene a las células en suspensión.
La sangre constituye el vehículo por el cual la mayor parte de los nutrientes son
transportados al hígado y a los órganos en general, y los productos de desecho retornan a los
pulmones y a los riñones, para su excreción. La sangre transporta el oxígeno desde los pulmones
a los tejidos, y el dióxido de carbono, producido durante el metabolismo respiratorio desde las
células hacia los pulmones.
Casi la mitad, aproximadamente, del volumen sanguíneo lo ocupan sus células, que
consisten en su mayor parte en los glóbulos rojos y en una cantidad mucho más pequeña, los
glóbulos blancos y las plaquetas.
Si se saca sangre de una vena y se agrega un anticoagulante apropiado para prevenir su
coagulación, los elementos celulares en suspensión pueden ser separados por centrifugación. El
líquido sobrenadante, normalmente de color ligeramente amarillo, se denomina plasma
sanguíneo.
Si al extraer la sangre se deja que coagule, y se somete luego a centrifugación, se separa
un líquido que se denomina suero sanguíneo.
Así, la diferencia entre plasma y suero sanguíneo es que este último carece de fibrinógeno
(precursor de la fibrina que forma el coágulo).
El plasma contiene aproximadamente un 10% de solutos disueltos, de estos un 2% esta
integrado por nutrientes orgánicos y sustancias de desecho. Un 1% está representado por sales
inorgánicas y aproximadamente el 7% restante, lo constituyen las proteínas plasmáticas.
Los principales iones inorgánicos del plasma sanguíneo son el Na+, Ca++, Mg++, Cl-,
HCO3 y H2PO4-, que desarrollan una importante función en la regulación de la actividad hística.
-

Las proteínas plasmáticas están integradas por una mezcla de diferentes fracciones
proteicas. La concentración total de proteínas plasmáticas en mamíferos varía entre 5,5 y 8,5
g/100ml (ver cuadro pág. 7).
1.2. Fracciones proteicas del plasma

1.2.1. Fibrinógeno
Es el precursor de la fibrina, que participa en la formación del coágulo sanguíneo. Esta
proteína es producida por el hígado y constituye solo el 4 - 6% de las proteínas totales del plasma.
El suero no contiene fibrinógeno puesto que se usa en el mecanismo de coagulación, pero sí
contiene la misma cantidad de albúminas y globulinas que el plasma.

1.2.2. Albúmina
Es la fracción más abundante, aunque las cantidades relativas, varían entre 40-60% de las
proteínas totales, según las distintas especies. La albúmina es sintetizada en el hígado y sus
principales funciones son:
a) El mantenimiento del volumen del plasma, o sea del equilibrio osmótico entre la sangre
circulante y el líquido intersticial.
b) El transporte de sustancias poco solubles en agua (Ej: ácidos grasos libres).

1.2.3. Globulinas
La fracción globulínica de las proteínas plasmáticas es una mezcla muy compleja, que
agrupa las siguientes fracciones principales: 1 y 2 globulinas,  globulinas y  globulinas.
Todas cumplen funciones biológicas muy importantes; por ejemplo:
a) Antitripsina (1 globulina)
b) Ceruloplasmina: (2 globulina), transporta el 90% del cobre presente en el plasma.
c) Transferrina: ( globulina) es una glucoproteína que transporta el Fe+++ desde el intestino a
los lugares del organismo que lo necesiten.
d) Inmunoglobulinas: ( globulina) son sintetizadas en los linfocitos B, secretadas a la
circulación sanguínea y constituyen un mecanismo importante de defensa del organismo.

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2. FRACCIONAMIENTO DE PROTEINAS PLASMATICAS POR
ELECTROFORESIS

2.1. Introducción
Se denomina electroforesis al movimiento de partículas cargadas, presentes en una
solución, bajo la influencia de un campo eléctrico. Las partículas cargadas pueden ser enzimas,
ácidos nucleicos, lipoproteínas, glucoproteínas o elementos organizados como virus, bacterias,
espermatozoides.
En la electroforesis sobre soporte, la solución que contiene las sustancias a separar se
coloca (o siembra) sobre un soporte, embebido en un buffer adecuado, cuyos extremos están
sumergidos en sendas cubas cargadas con dicho buffer y conectadas a los electrodos provenientes
de una fuente de poder. Como soportes pueden utilizarse agar, gel de poliacrilamida, papel de
filtro, acetato de celulosa, etc.
En el trabajo práctico se realizará la electroforesis de proteínas plasmáticas en tiras de
acetato de celulosa: Proteinograma. El acetato de celulosa contiene la celulosa con parte o
todos los grupos -OH de las unidades de glucosa reemplazados por acetato. Esto elimina casi
enteramente las propiedades adsorbentes de la celulosa. Es un soporte delgado que presenta las
siguientes ventajas:
a) Mínima adsorción, separación de las fracciones más rápida y eliminación del color de base
más fácilmente.
b) Material homogéneo, microporoso y químicamente puro.
c) Se usa menos material biológico que con el papel.
d) Se puede transparentar para su "scanning", o cortar las bandas y medirlas
fotocolorimétricamente.
Las desventajas serían:
a) Tendencia a secarse durante la corrida por su delgadez.
b) Alta electroendósmosis.
c) Alto costo.
El proteinograma se efectuará con un equipo semejante al de la siguiente figura.

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 Una vez colocado el soporte adecuadamente, se siembra el suero en la zona indicada en la
figura, luego se aplica una corriente eléctrica para lograr la separación de las fracciones proteicas
según la especie, por ejemplo en bovinos las fracciones son albúminas, 1, 2,  y  globulinas.
Luego de efectuada la corrida electroforética, las fracciones proteicas separadas se pondrán de
manifiesto mediante la tinción de las mismas.
El aspecto de la tira coloreada (proteinograma) mostrando las zonas separadas es el
siguiente en una muestra de suero bovino:

2.2. Teoría de la electroforesis

En principio, podemos considerar que la velocidad de una partícula cargada es

directamente proporcional al campo eléctrico aplicado y la constante de proporcionalidad es
llamada movilidad m.
V
v  H m Donde H 
d

H = campo eléctrico v = velocidad de migración de la partícula

V = voltaje aplicado d = distancia entre electrodos

A su vez, la movilidad depende de la carga neta de la partícula, su radio, la viscosidad del

medio líquido en que se mueve y de la trama microcapilar del soporte sólido sobre el cual migra
(papel o acetato de celulosa), siendo además inversamente proporcional a la raíz cuadrada de la
fuerza iónica.
En condiciones de trabajo estándar (cubeta, soporte, soluciones buffers y voltaje
definidos) los factores que hacen que la movilidad (m) de cada una de las fracciones proteicas sea
diferente son principalmente su tamaño y su carga eléctrica neta. La carga eléctrica depende a
su vez del punto isoeléctrico de cada proteína y del pH del buffer elegido.
En general, en la realización del proteinograma se utiliza un buffer de pH alcalino (9,2) al
cual todas las proteínas del suero estarán cargadas negativamente, dependiendo la cantidad de
cargas del número de grupos –COO - , –O - de cada una de las fracciones proteicas. Si una
proteína tiene mayor cantidad de estos grupos, migrará más rápidamente hacia el polo positivo o
ánodo.
De todo lo dicho puede inferirse que las funciones del buffer serán:
a) Mantener el pH constante por encima del PI de las proteínas, para que los grupos –COO - y
–O - estén disociados.

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b) Transportar la corriente eléctrica.
c) Proveer al medio de la fuerza iónica adecuada para lograr una eficiente movilidad de las
proteínas.

Otros factores que, si bien no influyen en la migración diferencial de las proteínas,

determinan una eficiente corrida electroforética son: intensidad de corriente, temperatura y
evaporación. La intensidad de la corriente eléctrica que depende del voltaje aplicado (V) y de la
resistencia de las tiras (R), genera un calentamiento de las mismas por efecto Joule, efecto que
explica la elevación de la temperatura de cualquier elemento que funcione como resistencia
eléctrica. Al aumentar la temperatura de las tiras, aumenta la evaporación del solvente en el
soporte, lo que se traduce en un aumento de la concentración del buffer. Esto a su vez implica un
 1 
aumento de la fuerza iónica     c  z 2  y por ende una disminución de la movilidad, que es
 2 
inversamente proporcional a  , como se dijo anteriormente.
La evaporación del solvente puede disminuirse trabajando con la cuba electroforética
cerrada. Esto producirá condensación del mismo en la cara interna de la tapa de la celda
electroforética. Cuando se trabaja a elevados voltajes es necesario refrigerar por medios
especiales las tiras electroforéticas.
Debido a que los extremos de las tiras están sumergidos en la cuba se generan corrientes
ascendentes de succión por capilaridad. Para que estas corrientes tengan igual velocidad es
importante que el nivel del buffer en los compartimientos electródicos sea el mismo.

(1) Succión por capilaridad. (2) Evaporación. (3) Condensación en la tapa.

2.3. Electroendósmosis
En la electroforesis sobre soporte debe tenerse en cuenta el fenómeno de
electroendósmosis. Como la electroforesis se realiza en presencia de un buffer de pH alcalino (en
nuestro caso veronal sódico pH 9,2), los grupos ionizables del soporte estarán cargados
negativamente (-COO- del acetato de celulosa) y se rodean de iones cargados positivamente.

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 Al aplicar la corriente eléctrica las partículas cargadas negativamente no se desplazan por
estar unidas al soporte mientras que las cargadas positivamente se desplazarán hacía el polo
negativo o cátodo. Esta corriente líquida que se desplaza en sentido contrario al de la corriente
eléctrica, se llama corriente electroendosmótica y el fenómeno se llama electroendósmosis.
Dicha corriente puede ser lo suficientemente fuerte como para arrastrar a moléculas neutras o con
pocas cargas negativas (como las  globulinas) en sentido contrario al resto de las proteínas,
como sí hubieran estado cargadas positivamente, sobre todo si la muestra fue sembrada cerca del
centro de la tira donde las corrientes de succión se anulan.

Considerando el conjunto de todas las fuerzas e interacciones que intervienen en una

corrida electroforética, el proceso final se puede resumir esquemáticamente en la siguiente figura.

Zona 1 Zona 2

La dirección de la corriente eléctrica será del polo negativo (-) hacia el polo positivo (+) y
la dirección de la corriente electroendosmótica, opuesta a la dirección de migración de la
corriente eléctrica, será entonces hacia el polo negativo (-). Las corrientes de succión en la zona 1
(según el esquema) es en el mismo sentido que la electroendósmosis y en la zona 2 a favor de la
corriente eléctrica. En la zona central las corrientes líquidas de succión se anulan.
Para que un proteinograma sea óptimo debe ser nítido y contrastado, o sea sus bandas
deben ser paralelas y bien marcadas, con buena resolución entre ellas (espacios blancos bien
definidos entre ellas).

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2.4. Variaciones fisiológicas

a) En animales, las observaciones realizadas deben compararse con valores tomados como
normales, según la especie, la edad y técnica empleada. Se acepta generalmente que en los
sueros animales se encuentran las mismas fracciones que en el humano, si bien en
proporciones diferentes.
b) Los valores de las proteínas totales son menores durante la vida fetal y hasta 2 ó 3 meses del
nacimiento, especialmente en la fracción  globulina, que es la que contiene la mayor parte de
los anticuerpos (los mamíferos los reciben durante la ingesta del calostro).
c) En el hombre y el perro el contenido de albúmina es superior al de globulinas, en cambio en
el caballo, vaca, oveja y cerdo la relación se invierte (ver cociente proteico
Albúmina/Globulinas en el siguiente cuadro).

Valores Normales de Proteínas Séricas en Diferentes Especies

Proteínas Totales Albúminas Globulinas

Suero C.P.= Alb.
g/100ml g/100ml g/100ml
Glob.
6,0 – 8,0 3,2 - 4,5 2,7 - 3,6 1,0 - 1,8
Humano
5,5 – 7,5 2,6 - 4,0 2,1 - 3,4 1,0 - 1,7
Canino
6,0 – 8,5 2,7 - 3,9 2,9 - 4,9 0,6 - 1,0
Bovino
6,0 – 8,0 2,7 - 3,7 3,2 - 5,0 0,4 - 0,8
Ovino
6,0 – 8,0 2,4 - 3,8 2,5 - 4,6 0,5 - 1,0
Equino
6,0 – 8,0 2,3 - 4,0 3,9 - 6,0 0,4 - 0,8
Porcino

2.5. Aplicaciones clínicas

El conocimiento de los valores de un proteinograma constituye un valioso elemento de
juicio para elaborar un diagnóstico, pero siempre debe acompañarse de otros análisis y del
examen clínico del animal enfermo. Una disproteinemia puede cursar con normoproteinemia
(valores normales de proteínas totales) ya que es posible que el descenso de una fracción
compense el incremento anormal de otra. Por esto es importante determinar simultáneamente las
proteínas totales, el proteinograma y la relación Albúmina/Globulinas para adquirir una cabal
idea del estado clínico del paciente.

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2.5.1. Hiperproteinemia

a) Puede ser causada por hemoconcentración debido a una deshidratación que provocará
hiperalbuminemia e hiperglobulinemia, de modo que se mantiene el cociente proteico
albúmina/globulina normal.
b) Problemas infecciosos e inflamatorios aumentan las proteínas plasmáticas totales por
aumento de síntesis de globulinas. El aumento de  globulinas se debe a estados de defensa
contra agentes infecciosos (inmunidad natural o adquirida por vacunación)
Las  y  globulinas aumentan también en procesos inflamatorios agudos y/o crónicos.

2.5.2. Hipoproteinemia

Resulta de una variedad de estados patológicos que se pueden agrupar en:

a) Desórdenes que producen pérdida de proteínas. Ej: Hemorragias, nefropatías, enteropatías.
b) Desórdenes causados por disminución de la síntesis de proteínas. Ejemplo: Insuficiencia
hepática, mala absorción, desnutrición, neoplasia hepática, que cursan con hipoalbuminemia;
o hipoplasia y neoplasia linfoide que presentan hipo  globulinemia.
c) En preñez y lactancia debido a las necesidades proteicas aumentadas. En ovinos la albúmina
disminuye en la primera mitad de la gestación, mientras la globulina disminuye en la etapa
final por lo que el calostro es rico en globulinas.

La electroforesis de proteínas séricas ha sido utilizada en estudios inmunoquímicos de

diversas enfermedades en distintas especies (fiebre aftosa, peste porcina, etc.).
En todo proceso inmunitario se produce un aumento de  globulinas (debido a la
generación de anticuerpos que se hallan presentes en dicha fracción) y muchas veces de las 
globulinas, cuando el organismo atacado se restablece y obtiene una verdadera resistencia a la
infección.

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Proteinogramas normales y patológicos en distintas especies

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3. TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL

PROTEINOGRAMA ELECTROFORETICO

En la práctica se separarán por electroforesis las diferentes fracciones proteicas del suero
usando como soporte una lámina de acetato de celulosa y como buffer veronal sódico (pH 9,2).
Finalizada la separación, la lámina de acetato de celulosa se tiñe con un colorante (Amido
Schwartz) con el fin de que las distintas fracciones puedan observarse y determinarse
cuantitativamente.
Para la determinación cuantitativa se corta la tira ya teñida para separar las distintas
fracciones, luego se sumerge cada una de ellas en solución eluyente y se realizan las lecturas
fotocolorimétricas respectivas.

1. Material biológico
Suero sanguíneo no hemolizado.

2. Reactivos
a) Solución reguladora de pH 9,2
Dietilbarbiturato de sodio (veronal sódico) p.a. 8,24 g
Agua destilada c.s.p. 1.000 ml
b) Solución colorante
Amido Schwartz 10 B p.a. 5 g
Metanol puro 450 ml
Acido acético glacial puro 100 ml
Agua destilada 450 ml
c) Solución eluyente
Acido acético glacial puro 80 ml
Agua destilada 20 ml
d) Solución lavadora
Metanol puro 475 ml
Acido acético glacial puro 50 ml
Agua destilada c.s.p. 1.000 ml
e) Solución para preteñido del suero
Azul de bromofenol puro 0,1 g
Etanol puro (96% V/V) c.s.p. 100 ml
f) Solución para conservar las tiras
Metanol puro 80 ml
Agua destilada 120 ml

3. Material de laboratorio
1 gradilla para tubos de ensayo
6 tubos de ensayo

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1 varilla de vidrio
1 pipeta graduada de 10 ml (1/10)
1 pipeta capilar o sembrador
1 policubeta o portaobjetos
1 tijera
1 tira de acetato de celulosa

4. Aparatos e instrumentos
Los equipos utilizados para electroforesis están constituidos por una fuente de poder que
suministra la fuerza electromotriz necesaria y una cuba electroforética.
Durante el trabajo práctico experimental se usarán también un transformador de corriente
(220-110 voltios) y un fotocolorímetro.

5. Técnica
Carga de los compartimientos electródicos: Colocar la cantidad apropiada de solución buffer de
pH 9,2 en los compartimientos electródicos, cuidando que el nivel del líquido llegue en ambos
casos hasta la misma altura.
Preparación de las tiras de acetato de celulosa: Sumergir las tiras de acetato de celulosa de 2,5
cm de ancho y 8,5 cm de largo en solución buffer de pH 9,2 durante 10 minutos para que se
impregnen bien con la misma. Retirar las tiras y eliminar el exceso de líquido secándolo con
papel de filtro (*). Inmediatamente, colocarlas sobre el soporte de la cuba electroforética tratando
de que queden bien tensas y que sus extremos se hallen sumergidos en cada uno de los
compartimientos.
Preparación de la muestra: Colocar dos gotas del colorante indicador (azul de bromofenol) en un
portaobjetos o policubetas. Inflamar hasta evaporar el solvente (etanol), dejar enfriar y agregar
dos gotas de suero sobre el residuo sólido del colorante. Mezclar hasta que el conjunto tome color
azul bien homogéneo. Este preteñido servirá como indicador del avance del frente de proteínas (o
sea de la albúmina).
Siembra de la muestra: Cargar el sembrador con la mezcla de suero y colorante. Retirar el exceso
de suero y apoyarlo suavemente del lado no brillante de la tira a 2 cm del compartimiento
catódico.

Esperar 3 minutos para que la muestra sea completamente adsorbida por el soporte y tapar
la cuba.

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 Ajuste de la intensidad de corriente: Conectar la cuba electroforética a la fuente de tensión de
manera que el cátodo se halle del lado que se sembró la muestra. Mediante el control de ajuste de
la corriente, aumentar la diferencia de potencial hasta que el miliamperímetro marque una
intensidad de corriente correspondiente a 1,5 - 2,0 miliamperes por tira. Mantener el sistema en
estas condiciones hasta que la albúmina, que corre coloreada, se desplace de 35 a 45 mm
(aproximadamente 45 minutos).
Coloración de las fracciones proteicas: Una vez finalizada la separación electroforética,
sumergir las tiras en el reactivo colorante de 3 a 5 minutos (no más). Eliminar el exceso de
colorante mediante sucesivos lavados con la solución lavadora hasta que ésta permanezca
incolora (generalmente bastan 3 lavados).

(*) IMPORTANTE: Debe tenerse especial cuidado en evitar que las tiras queden
expuestas al aire sin estar en contacto con el buffer. La deshidratación de las mismas puede
alterar irreversiblemente al acetato de celulosa.

6. Valoración cuantitativa
La valoración cuantitativa de las fracciones puede realizarse por dos métodos:
densitometría y elución.

6.1. Densitometría (no se hace en este trabajo práctico experimental).

El aparato utilizado en este caso es un densitómetro que mide la intensidad del color de
cada zona por transparencia o reflexión.
Primero la tira debe ser sometida a un tratamiento químico que la transparenta sin alterar
la intensidad de la tinción de cada fracción proteica.

Técnica de transparentación: Se sumerge la tira lavada 1º en metanol anhidro durante 1 minuto,

y 2º en una solución formada por: metanol (85 ml), ácido acético (14 ml) y glicerina (1 ml),
durante 2 minutos. Luego se coloca sobre una placa de vidrio y se deja en estufa a 70°C (o bajo
lámpara) durante unos minutos hasta transparencia completa. Se invierte la placa de vidrio sobre
el papel de filtro, se deja enfriar 20 minutos como mínimo y se separa la tira transparentada.

Luego se la coloca en el densitómetro, que esencialmente funciona como un

fotocolorímetro. La tira trasparentada se desplaza (como una diapositiva en un proyector)
perpendicularmente a un haz de luz. A medida que este haz intercepta las franjas coloreadas, las
absorbancias producidas son traducidas al movimiento de una pluma o aguja registradora que
va graficando el densitograma sobre un papel milimetrado que se desplaza sincrónicamente con
la tira electroforética.

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 La superficie de cada "pico" del densitograma (o forograma) obtenido representa la
cantidad de proteínas en la fracción respectiva.

Dicha superficie puede medirse mediante varios métodos que no se describirán en este
curso.
El porcentaje proteico de cada fracción se calcula mediante simples reglas de tres; por
ejemplo para  globulina:
g
Sup. % Sup. 100ml
 o bien 
Sup.total 100% Sup.total g.P.T
100ml

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 En el segundo caso es necesario valorar proteínas totales (g%) por cualquier otro método
(por ejemplo utilizando la reacción del Biuret).
Las ventajas principales del densitograma son que, conociendo bien la forma de la curva
normal, permite visualizar rápidamente alguna posible alteración patológica sin necesidad de
recordar cifras y que pueden informarse o archivarse junto con el proteinograma el cual, estando
transparentado, se conserva indefinidamente.
La desventaja reside en que el densitómetro es costoso, tiene una calibración algo
engorrosa y requiere además proteinogramas muy bien corridos (sin manchas ni franjas curvadas
o deformadas).

6.2. Elución. Es el método que se utilizará en el trabajo práctico experimental.

Para ello rotular seis tubos de ensayo: B, Alb., 1, 2,  y  globulinas, colocar en cada
uno 2 ml de solución eluyente.
Seleccionar la tira de manera que las fracciones queden separadas. Esto se logra cortando
por la parte media de la zona más clara que separa a las fracciones, como se indica en la figura.

Utilizar como blanco una sección de la misma tira de una superficie equivalente a la de
cualquiera de las fracciones y que no contenga colorante. Colocar los recortes así obtenidos en
los tubos de ensayos correspondientes. Dejar en contacto y agitar repetidamente durante el
tiempo necesario para que la tira y el colorante sean disueltos por la solución eluyente.
Realizar la lectura fotocolorimétrica contra un blanco a 620 nm.

7. Cálculos:
Una vez realizadas las lecturas en el fotocolorímetro se tendrán cinco valores de
absorbancia: AAlb, A1, A2, A y A. Sumando todas ellas obtenemos At, que representa la
absorbancia total: At  Aalb  A1  A2  A  A
Para obtener la concentración relativa de cada una de las fracciones tendrá que tenerse en
cuenta que At representa 100%. Por lo tanto conociendo la absorbancia de cada fracción, por
regla de tres puede realizarse el cálculo. Calcular también la concentración absoluta de las
distintas fracciones teniendo en cuenta que la concentración de proteínas totales representa el
100% y conociendo la concentración relativa de cada fracción por regla de tres puede realizarse
el cálculo. Volcar estos resultados en el cuadro del informe. Luego hallar el cociente proteico
como se indica en el informe.

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