BASES GENÉTICAS DE LA DIABETES:

CÉLULA β y DESARROLLO EMBRIONARIO

Bases Moleculares de Enfermedades

Metabólicas

Alberto Bartolomé

@a_bartolome
abartolome@iib.uam.es 1
bartolomelab.com 1/57
bartolomelab.com

“Development of Pancreatic Islets and Beta

Cell Mass Lab”
Esquema de la clase

1. Células β y su papel en diabetes

2. Genética de la diabetes

3. Desarrollo embrionario del páncreas endocrino

4. Células madre pluripotentes: un modelo para estudiar el

desarrollo humano
Islotes de Langerhans
~1-2% de la masa total del páncreas

~ 3,000 cells/islet
75% β cells
25% non-β cells
~200 µm

β
 ¿Cuál es el papel de las células ß?
1. Síntesis y almacenamiento de insulina

Aprox. 13,000 gránulos/célula ….. 200.000 moléculas de insulina/gránulo

 ¿Cuál es el papel de las células ß?

1. Síntesis y almacenamiento de insulina

2. Secreción de insulina estimulada por glucosa

Las células β responden a diversos nutrientes, incluyendo glucosa, otros monosacáridos,

aminoácidos y ácidos grasos.

La glucosa es evolutivamente el estímulo primario para la liberación de insulina.

• Es uno de los componentes principales de los alimentos.
• Se acumula inmediatamente después de la ingestión de alimentos.

Las células β han desarrollado mecanismos extremadamente precisos que les permiten
ser 'sensores de glucosa'
Secreción de insulina y su
efecto en metabolismo
 Diabetes

La diabetes es una enfermedad crónica que se caracteriza por niveles elevados

de glucosa en sangre. Esto ocurre debido a una incapacidad del organismo para
utilizar adecuadamente la glucosa, debido a una insuficiente acción de la
insulina

Diabetes tipo I (T1D) Diabetes tipo 2 (T2D) Diabetes monogénica

5-8% >90% 2-5%
Diabetes juvenil Diabetes del adulto Formas raras de diabetes

Destrucción autoinmune de las Resistencia a la insulina, que
células β. Deficiencia de insulina evoluciona a disfunción de
célula β
Factores ambientales y genéticos
Factores ambientales y genéticos
Aparición al nacer (diabetes neonatal) o
en individuos jóvenes (MODY)
Causada por una mutación en un único
gen
 Célula β y progresión de T2D
(Type 2 Diabetes)
Intolerancia a la
Normal Adaptación glucosa Diabetes tipo 2

Glucemia en ayunas

Insulinemia en ayunas

Disfunción de la
Resistencia a la insulina célula β

Masa y función de la célula β

Fracaso de la célula
β
Aumento compensatorio
Masa inicial de de masa de célula β
célula β

Adaptado de
Lingohr et al. (2002)
 Genes y ambiente:
interacción en enfermedad
humana

Genes
 Diabetes Tipo II: factores ambientales
Actividad Metabolismo en
Ingesta física reposo
calórica

Aporte Consumo
energético energético

Consumo energéti

co
La diabetes: pandemia global
Esquema de la clase

1. Células β y su papel en diabetes

2. Genética de la diabetes

3. Desarrollo embrionario del páncreas endocrino

4. Células madre pluripotentes: un modelo para estudiar el

desarrollo humano
 Genética de la enfermedad
• Enfermedad monogénica:
• Enfermedades causadas por una mutación en un solo gen específico.
• Las variantes genéticas suelen tener un impacto significativo, como la pérdida casi completa de la
función o la alteración de genes críticos.

• Enfermedad poligénica:
• Enfermedades causadas por la interacción de múltiples variantes genéticas, cada una con un efecto
marginal.
• El efecto relevante es el resultado acumulativo de estas variantes en lugar de una mutación única y de
gran impacto en un solo gen.
 Genética de la diabetes
La evolución del genoma humano es
mucho más lenta que los cambios en el
estilo de vida. El humano moderno no
está genéticamente adaptado a la
abundancia de alimentos y un estilo de
vida sedentario.

Ejemplos de poblaciones alto riesgo

Oji-Cree

Pima Este de Asia

Nativos del
Poblaciones las islas del
Africanas y Pacífico
afrodescendientes
Aborígenes
australianos
 Genética de la diabetes

Comunidad de indios Pima, una de las mayores incidencia

de diabetes de todo el mundo

EE.UU. Pima

Mexico Pima
 Genoma humano
Proyecto Genoma Humano

2002-2009

2008-2016
2018-2024

May 2023

Crecimiento del número de

polimorfismos genéticos
conocidos
 Conceptos clave
• SNV (Single Nucleotide Variant): variación genética que implica un cambio en un solo nucleótido,
que puede ser común o rara en la población.
• SNP (Single Nucleotide Polymorphism): variación genética común (>1%) que implica un cambio
en un solo nucleótido (4-5 millones de SNPs, 0.1% del genoma)
• Desequilibrio de ligamiento (linkage dissequilibrium, LD): no independencia en la segregación de
alelos en genes (o SNPs) cercanos en un cromosoma

SNV/SNP

Major allele: El más frecuente

Minor allele: el menos frecuente

• SNP > 1%
• SNV < 1%

Identificador de SNVs/SNPs
rsXXXXXXXXXX (número)
 Desequilibrio de “Cuando dos genes están estrechamente asociados

ligamiento en el mismo cromosoma, no se segregan de manera

independiente” (Morgan, 1911)

Generación inicial 100 generaciones 1000 generaciones

Linkage dissequilibrium map

or
1 2 3 4 5 6 “Haplotype structure”
Alelo1 C A C G T A
Alelo2 C A C G T A NOTCH2
rs835575

Alelo3 T T G G T A
Alelo4 T T G G T A rs10923931

Alelo5 C A C C
A T

SNPs C/T A/T C/G G/A T/C T/C

TagSNPs A/T T/C

1,2,3: LD=1.00 (CAC o TTG) LD entre 0 y 1

4,5,6: LD=1.00 (GTA o ACT)
LD=Linkage dissequilibrium
LD link https://ldlink.nih.gov/
 Conceptos clave
• SNV (Single Nucleotide Variant): variación genética que implica un cambio en un solo nucleótido,
que puede ser común o rara en la población.
• SNP (Single Nucleotide Polymorphism): variación genética común (>1%) que implica un cambio
en un solo nucleótido (4-5 millones de SNPs, 0.1% del genoma)

• Desequilibrio de ligamiento (linkage dissequilibrium, LD): no independencia en la segregación de

alelos en genes (o SNPs) cercanos en un cromosoma

• Haplotipo: combinación de alelos (o SNPs) en uno o varios loci dentro del mismo cromosoma que
tienden a ser heredados juntos debido al desequilibrio de ligamiento genético
• Tag SNP: una variante de un solo nucleótido seleccionada para representar un conjunto de SNPs
cercanos en un genoma debido a su capacidad para inferir información sobre el haplotipo en esa
región del genoma.
• GWAS (Genome Wide Association Studies): estudios que buscan identificar relaciones entre
variantes genéticas, y rasgos o enfermedades complejas en una población.
 GWAS(Genome Wide Association Studies)
100,000 SNPs (primeros GWAS)
Cerca de 1M SNPs (actualidad)

Manhattan
plot

Las variantes genéticas que influyen en el riesgo de enfermedad son muy jóvenes en el
"tiempo evolutivo", con orígenes específicos en Homo sapiens
GWAS
 T2D GWAS

~600 loci
SNPs en los loci de T2D-GWAS,
¿cómo están relacionados con el
riesgo diferencial de T2D?

Vujkovic et al, 2020; Spracklen et al, 2020;

Mahajan et al, 2018; Xue et al, 2018; Zhao et
al., 2017; Morris et al, 2012; Dupuis et al., 2010
Zeggini et al., 2008. etc...
 Bases de datos de SNPs y GWAS
Bases de datos de SNPs
• dbSNP https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/

Bases de datos de GWAS

• GWAS Catalog https://www.ebi.ac.uk/gwas/
La genética de la diabetes: un
cambio de paradigma
 ¿Efecto tejido-específico de
variantes genéticas?
Los SNP asociados con un mayor riesgo de enfermedad se encuentran enriquecidos en
regiones accesibles del genoma. Esta accesibilidad es en ocasiones variable entre los
diferentes tejidos (o tipos celulares).

ATAC-seq
T1D-GWAS: >50 loci T2D-GWAS: >600 loci

Accesibilidad de la cromatina CD4/

y eQTL tejido-específico :
Zhang et al., 2021 Cell CD8
β
GTEx portal
 ¿Efecto tejido-específico de
variantes genéticas?

eQTL: expression quantitative trait loci

Locus genómico (puede ser un solo SNP, o combinación)
donde las diferencias genéticas entre individuos se
correlacionan con diferencias en expresión genética.
NO NECESARIAMENTE CAUSALES.

Bases de datos de eQTL, tejido específico.

Podemos buscar nuestro SNP de interés, y su asociación sobre
expresión de genes de forma tejido-específica: ejemplo
rs10923931

gtxportal.org
 Tipos de diabetes

Diabetes tipo I (T1D) Diabetes tipo 2 (T2D) Diabetes monogénica

5-8% >90% 2-5%
Diabetes juvenil Diabetes del adulto Formas raras de diabetes

Destrucción autoinmune de las
células β. Deficiencia de insulina
Factores ambientales y genéticos
Resistencia a la insulina, que
evoluciona a disfunción de célula
β
Factores ambientales y genéticos
Aparición al nacer (diabetes neonatal) o
en individuos jóvenes (MODY)
Causada por una mutación en un único
gen

T1D-GWAS: >50 loci T2D-GWAS: >600 loci 20-30 genes

Accesibilidad de la
cromatina
y eQTL tejido- CD4/
CD8 β β
específico :
Zhang et al., 2021 Cell
GTEx portal
¿Por qué resulta complicado el estudio de SNPs y
variantes causales?

1. La mayoría de SNPs asociados con enfermedades poligénicas se encuentran en

regiones no codificantes
2. El desequilibrio de ligamiento hace que múltiples SNPs sean heredados
conjuntamente ¿Cuál es el causal del mayor riesgo de enfermedad?
3. Efectos potenciales en genes distales
 Desequilibrio de ligamiento

La asociación de un SNP con riesgo de enfermedad puede deberse al desequilibrio

de ligamiento (LD) con otra variante causal Los patrones de LD entre los SNP
pueden ser complejos, lo que dificulta la identificación de las variantes
reguladoras causales.

158 Kb NOTCH2 rs835575

NOTCH2 SNPs
Desequilibrio de
ligamiento
rs10923931
(linkage disequilibrium,
1 Ref: C
93 Ref: G linked
LD)

5
23

57
35
09 Alt: T linked Alt: A

rs8
1
rs

rs10923931
rs835575

LD>0.99
Potencial efecto en genes distales
 SNPs y riesgo de diabetes

¿Como pueden los SNPs explicar el riesgo diferencial de enfermedad?

• SNPs en regiones codificantes

• SNPs en regiones no codificantes

• Promotor
• Enhancer
• lncRNA
• Splicing
• Estructura de la cromatina
• Metilación de DNA
• Modificaciones de RNA
 SNPs/SNVs en regiones codificantes
• Las variantes causales de diabetes monogénicas (variantes poco frecuentes) resultan en
alteración de la secuencia codificante de genes importantes para el desarrollo del páncreas
endocrino.

• HNF1A S319G: solo encontrada en Oji-Cree (Canada), frecuencia 20%. Una de las
poblaciones con mayor incidencia de T2D del mundo

• Variantes raras (<0.5%) asociadas con riesgo de T2D en genes que participan en
procesamiento y secreción de insulina: TBC1D30, KANK1, PAM o PPIP5K2,
Huyghe et al., Nat Genetics 2013

• Variantes de menor riesgo de T2D en

SLC30A8 (transportador de Zn2+)
• No sinónima (Q325W, frecuencia=25%!)
• Sin sentido (R138*, frecuencia=0.0238%)
Dwivedi et al., Nat Genetics 2019
Variantes en regiones no codificantes: promotor

Variantes en promotores son POCO frecuentes, mas asociadas a enfermedades

monogénicas

Ejemplo, mutaciones en el elemento CC del

promotor del gen de la insulina (INS)
(-331 pb desde el codón inicial)
Akerman et al., Cell Reports 2021

Asociado con diabetes neonatal

Variantes en regiones no codificantes: enhancers

Los enhancers son necesarios para una

expresión génica robusta y espacio-
temporalmente correcta

Stizel et al., Cell Metab 2010

Gaulton et al., Nat Genet 2010
Ackermann et al., Mol Metab 2016
Rai et al., Mol Metab 2019
 Variantes en regiones no codificantes: enhancers

SNP en un enhancer de ZFAND3 SNP en un enhancer de MTNR1B

(>10 kb del promotor), destruye una (localizado en un intron), crea una secuencia
secuencia reconocida por NEUROD1: reconocida por NEUROD1:
… menor expresión de ZFAND3 … mayor expresión de MTNR1B
EMSA

Pasquali et al., Nat Genet 2014 Gaulton et al., Nat Genet 2014
 Variantes en regiones no codificantes:
lncRNA
KCN1Q CDKN1C

KCN1QOT (lncRNA)
T2D-SNPs

SNPs en KCN1QOT, llevan a menor función de este lncRNA, el cual debería reprimir
la expresión de CDKN1C (un inhibidor del ciclo celular).
Por lo que SNPs resultan en mayor expresión de CDKN1C, y menor masa de célula β
 Variantes en regiones no codificantes:
splicing
SNPs pueden conducir a splicing alternativo (SNPs que pueden estar localizados tanto
en regiones codificantes como no codificantes). Por lo general cerca del ”splice
junction”, pero con excepciones

Exones 5’ o 3’ alternativos, exon “skipping”

Atla et al., Genome Biology 2022

 Variantes en regiones no codificantes:
estructura de la cromatina

SNPs en el locus de STARD10 alteran la

estructura tridimensional de la cromatina y
la expresión de FCHSD2
Variantes en regiones no codificantes:
metilación de DNA
 Variantes en regiones no codificantes:
otros

SNPs que alteran 5-hidroximetilación de DNA

(5hMC)

SNPs que tienen impacto sobre la estabilidad del

mRNA (3’UTR, 5’UTR, metilación de RNA…)
 Impacto de las variantes comunes

El mecanismo preciso que asocia un SNP a riesgo diferencial de diabetes es solo conocido
para una pequeña fracción de variantes.

SNP Encontrar SNP causal y

determinar efecto a nivel de ¿Efecto espacio-
(GWAS) temporal?
expresión génica

¿Qué gen?
¿Qué tipo celular?
¿En cualquier momento?

¿Qué papel tiene este ¿Puede explicar la

proceso en la alteración de un ¿Efecto en supervivencia
fisiopatología de la proceso
celular, proliferación,
enfermedad? biológico?
función, diferenciación…?
La genética de la diabetes: un
cambio de paradigma
Pocos loci asociados a la
acción de la insulina que
puedan explicar riesgo
diferencial por “resistencia a
la insulina”

• Función de célula β (secreción

de insulina)
• Desarrollo del páncreas
endocrino

• Otros
Esquema de la clase

1. Células β y su papel en diabetes

2. Genética de la diabetes

3. Desarrollo embrionario del páncreas endocrino

4. Células madre pluripotentes: un modelo para estudiar el

desarrollo humano
Desarrollo prenatal y riesgo de diabetes

Exposición prenatal/perinatal a condiciones de hambruna

resulta en un mayor riesgo de desarrollo de
enfermedades metabólicas en edad adulta.

Existe una plasticidad durante el desarrollo prenatal que

implica la capacidad del feto para responder a la dieta de
su madre durante el período fetal.

Bajo peso al nacer y/o una nutrición inadecuada durante

las primeras etapas de la vida pueden llevar a alteraciones
permanentes a nivel hormonal y metabólico.

La Gran Hambruna de Holanda

(1944-45)

Ravelli et al., The Lancet (1998)

Barker. The developmental origins of adult disease. J Am Coll Nutr, (2004)
 Riesgo genético en T2D y desarrollo
prenatal: ¿factores genéticos?

Durante el desarrollo prenatal, además de factores ambientales, factores genéticos pueden

ser clave para explicar el riesgo diferencial de diabetes.

Esto queda patente en diabetes monogénicas,

la mayoría de los genes implicados tienen un
conocido papel en el desarrollo del páncreas

Bartolomé, IJMS 2022

Conocemos bien el desarrollo humano a nivel anatómico, a nivel molecular

sigue siendo una caja negra, especialmente cuando se compara con nuestra
comprensión molecular de la fisiopatología adulta
Desarrollo del pancreas
 Determinación del destino celular durante el
desarrollo

El ”destino celular” depende de una serie de

decisiones en puntos de bifurcación que van
determinando el linaje

Gastrulation

Ectoderm Mesendoderm

Mesoderm Endoderm

Hindgut Foregut
endoderm endoderm

Pancreatic
Duodenum
progenitor
Beta cell
Beta/delta
Exocrine Endocrine precursor
Delta cell
progenitor progenitor Alpha/PP
precursor
 Rutas de señalización importantes para el
desarrollo del páncreas

Wnt signaling: participa en la gastrulación y en la especificación del intestino anterior

Hedgehog signaling: la represión de Shh es esencial para determinar el linaje pancreático
Notch signaling: su inhibición es necesaria para la diferenciación de progenitores pancreáticos
Nodal/Activin A: necesario para la especificación del endodermo
BMPs: inhibición determina el intestino anterior
FGF: formación del intestino primitivo y promueve su diferenciación hacia “intestino anterior”
Ácido retinóico: necesario para la especificación de progenitores pancreáticos
 Rutas de señalización importantes para el
desarrollo del páncreas
Pax
α cells
6

Arx

Duct Pdx
δ cells
1
Endocrino Neur
od1

Ngn
3 Pax
Notch activo 4
Pdx
Nkx Nkx Pdx
1
+Wnt -Shh Pdx - 2.2 6.1 1
SoxPdx
1 Notch
Pdx
9 1
Sox
1 Sox
Intestino
9
Sox 9 β cells
9
anterior
Progenitor
espancreá Hes
1
ticos
Notch activo Ptf1
a

Exocrino Adaptado de
Habener et al.
Endocrinology
Notch signaling
Gamma-secretase
complex
Presenilin
Nicastrin
Ligandos Aph1
Receptores Pen2
Dll1, Dll3, Dll4
Notch1-4
Jagged1, Gamma-secretase
Jagged2 complex
ADAM

NICD
NICD
NICD: Notch
IntraCellula
r Domain

MAML
RBPJ Notch target genes
HES/HEY family genes
MYC
Esquema de la clase

1. Células β y su papel en diabetes

2. Genética de la diabetes

3. Desarrollo embrionario del páncreas endocrino

4. Células madre pluripotentes: un modelo para estudiar

el desarrollo humano
 Stem cells
1. Capacidad indefinida de auto-replicación
2. Células indiferenciadas, con el potencial a diferenciarse hacia
un/varios/todos los tipos celulares
(unipotente/multipotente/pluripotente).

Células madre pluripotentes (Pluripotent stem cells, PSCs)

Capaces de diferenciarse hacia las tres capas germinales, dando lugar a todos los
tipos celulares del organismo (sin incluir el tejido extraembrionario).
• Ectodermo: Sistema nervioso y piel
• Endodermo: Tracto GI, tracto respiratorio, hígado, páncreas
• Mesodermo: hueso, músculo, sistema circulatorio, tejido conjuntivo...

Dependiendo de su origen:
• Células madre embrionarias (ESCs)
• Células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)
• Introdución de factores de reprogramación en células somáticas
(Yamanaka cocktail)
• Transferencia nuclear de células somáticas
• Reprogramación por medios químicos blastocisto
El uso de células madre en la investigación tiene el potencial de
revolucionar nuestra comprensión de la biología humana

Wu & Belmonte
(2016) Cell
 ¿Qué podemos hacer mediante el uso de
hPSCs?
1. Utilizarse como fuente “ilimitada” de cualquier tipo de célula humana
 ¿Qué podemos hacer mediante el uso de
hPSCs?
1. Utilizarse como fuente “ilimitada” de cualquier tipo de célula humana

2. Estudiar el desarrollo embrionario humano

La diferenciación desde PSCs “imita” el desarrollo embrionario

 ¿Qué podemos hacer mediante el uso de
hPSCs?
1. Utilizarse como fuente “ilimitada” de cualquier tipo de célula humana

2. Estudiar el desarrollo embrionario humano

3. Explorar las bases genéticas la enfermedad humana

• Modelos de enfermedades monogénicas

iPSCs derivadas de pacientes Líneas hESCs bien caracterizadas

Células madre
embrionarias
(hESCs)

Introducir la mutación de interés

Utilizar clones no editados como
Corregir la mutación para generar controles isogénicos
controles isogénicos
✂️
CRISPR+/-HDR
CRISPR+HDR

• Estudiar el componente genético de las enfermedades poligénicas

o Descifrar el impacto de los SNPs identificados por GWAS

Las variantes genéticas que influyen en el
riesgo de enfermedad son muy jóvenes en el
"tiempo evolutivo", con orígenes específicos en
Homo sapiens
 Modelado del desarrollo del páncreas humano
Stage1 Stage2 Stage3 Stage4 Stage5 Stage6

PSCs DE PP EP BLC
Pluripotent Definitive PG PF Pancreatic Endocrine Beta-like
Stem cell endoderm progenitors progenitor cells
PG: primitive gut
PF: posterior foregut Día 0 Día 4 Día 7 Día 9 Día 13 Día 17 Día 23
ActivinA RA EGF T3, T3,
FGF7
Wnt3a SHH inh FGF7 ALK5 inh ZM
Vit C
ALKinh NOTCH inh NAC
TPB Heparina Heparina
ROCK inh ITS
Zn2+ Oligoelementos

PDX1 NGN3
SOX9
PDX1
PDX1 NGN3 NGN3
SOX9
PDX1 SOX9
SOX9 NGN3

β-like cells,
Gut tube/foregut Pancreatic Endocrine
hPSCs Endoderm islet-like
progenitors progenitors
clusters

SOX17 FOXA2 SOX9 INS INS

DAPI PDX1 NKX6.1
DAPI DAPI
 Modelado del desarrollo del páncreas humano
Introducir variante de interés Ampliar los clones PSC
PSCs
Pluripotent
Utilizar clones no editados como Control de calidad
Stem cell controles isogénicos (pluripotencia, off-targets,
CRISPR+/-HDR cariotipo...)

Stage1 Stage2 Stage3 Stage4 Stage5 Stage6

PSCs DE PP EP BLC
Pluripotent Definitive PG PF Pancreatic Endocrine Beta-like
Stem cell endoderm progenitors progenitor cells

Día 0 Día 4 Día 7 Día 9 Día 13 Día 17 Día 23

ActivinA RA EGF T3, T3,
FGF7
Wnt3a SHH inh FGF7 ALK5 inh ZM
Vit C
ALKinh NOTCH inh NAC
TPB Heparina Heparina
ROCK inh ITS
Zn2+ Oligoelementos

IF
PDX1 INS
HNF1B NKX6.1
PTU4 FOXA2 (GFP) WB
GATA4 NKX2.2 GCG
NANOG SOX17 HES1
GATA6 NEUROG3 TSM qPCR
SOX2 CXCR4 SOX9
CHGA MAFA
AFP Flow cyt.

Secreción de insulina
Proliferación,
Para cada estudio usamos entre 3-5 líneas estimulada por glucosa
apoptosis
editadas más un numero similar de controles
isogénicos Trasplante en ratones
 Estudios descriptivos y mecanicistas sobre
genes/loci de interés

CRISPR-Screening 1. 2. 3.

Exhaustivo estudio Caracterización de la Generar modelos de

bibliográfico, explorar dinámica de expresión pérdida/o ganancia de
bases de datos para durante el proceso de función para investigar el
encontrar eQTL (expression diferenciación de hPSCs papel del gen en el
quantitative trait loci) desarrollo

6. 5. 4.

Estudios traslacionales en Encontrar SNP(s) causales Estudios mecanicistas:

pacientes para el efecto de expresión, mecanismos moleculares
determinar el papel asociados con alteraciones
regulador de estos en el desarrollo del páncreas
endocrino
 Estudios descriptivos y mecanicistas sobre
genes/loci de interés: NOTCH2 y T2D
1. Estudio bibliográfico/bases de datos

SNPs en el locus de NOTCH2 La señalización Notch es fundamental

locus para el desarrollo del páncreas

Duct Endocrine
alpha
Stem Ngn3 beta
/progenitor
Notch active
cell delta
Pdx1
-Shh Sox9 Notch
? Pdx1
Sox9
Pdx1 inactive
Pdx1 Sox9
Sox9
Pancreatic
progenitors

Ptf1 Exocrine

Experiencia previa en Notch signaling

• Bartolomé et al., 2019 JCI

• Bartolomé et al., 2022 JCI Insight

TD2 GWAS: Zeggini et al., Voight et • Zhu, C., . Bartolomé, A., et al., 2018 Sci Transl Med
al., Maharahan et al., • Zhu, C., . Bartolomé, A., et al., 2020 J. Hepatol
Sparling et al., Xu et al., • Yu, J., .. Bartolomé, A., et al., 2021 Sci Transl Med
among others… • Kang, J, . Bartolomé, A., et al., 2023 JCI Insight
 Estudios descriptivos y mecanicistas sobre
genes/loci de interés: NOTCH2 y T2D
1. Estudio bibliográfico/bases de datos

160 kb, 34 exones

NOTCH2

rs10923931
Mayor riesgo de T2D SNP líder
OR: 1.04-1.11

GTEx: Genotype-Tissue Expression

No hay información en las bases de
datos sobre la asociación de SNPs con
eQTL (expression quantitative trait loci)
efectos de expresión durante el
Alelo asociado a T2D: menor expresión de desarrollo
NOTCH2 en páncreas (efecto más significativo en bases Notch signaling, papel crítico en el
de datos)
desarrollo
G G T
G T T T risk-SNP

Hipótesis: NOTCH2-risk SNP, alelo hipomórfico,

¿predictor genético de menor masa de célula β?
 Estudios descriptivos y mecanicistas sobre
genes/loci de interés: NOTCH2 y T2D
2. Estudio descriptivo del gen usando PSCs y protocolos de diferenciación

PPs
Mayor expresión de
NOTCH2 y otros
componentes de señalización
en la etapa de progenitores
pancreáticos (PPs).
NOTCH2
DAPI

3. Generar modelos de pérdida/ganancia de función: estudiar diferenciación

PSC clones

NOTCH2 CRISPR/Cas9
NOTCH2

NOTCH2 -/-
46
ex7 20 XY
Kb ACTI
MEL1 INS WT/GFP N
NOTCH2 +/+ NOTCH2 -/-
NOTCH2 +/+ NOTCH2 -/-
β like-cell stage:
deficiente
generación de INS
INS
células INS+ a locus NKX6.1
partir de GFP DAPI
NOTCH2 -/- PSCs
 Estudios descriptivos y mecanicistas sobre
genes/loci de interés: NOTCH2 y T2D
3. Generar modelos de pérdida/ganancia de función: estudiar diferenciación

GSIS (secreción de insulina)

(mU/L)/content (mU/L)
NOTCH2 +/+

hINS secretion
NOTCH2 -/-

Proliferación, GSIS (secreción de

apoptosis insulina)

ELISA: hINS / mINS Transplante en ratones

Wk 1 post Tx
Semana 1-12: determinación de hINS

IVIS-Lumina II
Semana 12: in vivo GSIS
Unidad de
bioluminiscencia Semana 13-16: capacidad para mantener
IIBm normoglicemia tras ablación de células β
murinas (STZ)

MEL1 INSWT/GFP GAPDHWT/Luciferase Tras inyección de D- Semana 16: SAC, histología

luciferina
 Estudios descriptivos y mecanicistas sobre
genes/loci de interés: NOTCH2 y T2D
4. Estudios mecanicistas: causas de la diferenciación alterada

RNAseq
PPs Eje
NOTCH-RBPJ

SOX9-PDX1

NEUROG3

RBPJ ChIP
SOX9 ChIP
ATAC-seq

Hipótesis de Diferenciación endocrina acelerada

NGN3
partida:
Pdx1
A consta de reducir la expansión de Pdx1 Sox9
NOTCH Sox9 Menor
progenitores pancreáticos Pdx1
Sox9 proliferación en el
estadio PP
Ahora: Pdx1 Menor diferenciación
Pdx1 Sox9
Expansión de Sox9
Pdx1 endocrina NGN3
progenitores y Sox9

¿La activación de NGN3 requiere de NOTCH/SOX9?

 Estudios descriptivos y mecanicistas sobre
genes/loci de interés: NOTCH2 y T2D
5. Estudio sobre los SNPs: conexión a efectos de expresión y riesgo de T2D

158 Kb NOTCH2 rs835575

NOTCH2 SNPs linkage
disequilibrium (LD)
rs10923931

1
93 Ref: G linked Ref: C

5
3

57
92

35
10 Alt: T linked Alt: A

rs8
rs
3’-UTR
3’-Untraslated region

rs835575

Efecto de high-LD SNPs en:

- ChIP-seq (FOXA2, GATA6,
ONECUT, TEAD1...)
- Enhancers (H3k27ac/H3K4me)
- Chromatin loops (HiCseq) LD>0.99
 Estudios descriptivos y mecanicistas sobre
genes/loci de interés: NOTCH2 y T2D
5. Estudio sobre los SNPs: conexión a efectos de expresión y riesgo de T2D

Secuencia de consenso asociada a m6A en 3’UTR destruida por SNP (rs835575)

3’UTR m6A (N6-methyladenosine)

Cas9 C/C Non-risk
gRNA +
HDR
template A/A T2D-risk

(A/A mut)
46
XY

Ausencia de metilación en RNA

(resolución a nivel de nucleótido) Reducción marginal de la expresión de NOTCH2, PDX1 y proliferación de PPs

GGA*(C/A)T SNP NOTCH2 PDX1

3 1.2
** 1.2 *** * *
2.5
1 1
mRNA (AU)

2
mRNA (AU)
dCT (no RNA )

1.5 0.8 0.8

1 0.6 0.6
0.5 0.4 0.4
0 0.2 0.2
0
C/C A/A C/C 1 u t
K-/-
n O 0
C/C A mA/A co
C C/C 2
M
MEL1
C/C mutA/A mock
C/C
E L1 ite
d A C
T
C
H
(C/C)1 (A/A) (C/C)ited
M n ed ol N
O
EL ed l
U n tr M Un ntro
co co
 Take-home messages

• Las células β pancreáticas tienen un papel central en la fisiopatología de la

diabetes
• Los factores genéticos son claves para comprender el riesgo diferencial de
T2D. Teniendo estos un rol determinante respecto a desarrollo y función de
la célula β.
• El desarrollo prenatal condiciona el mayor o menor riesgo de
enfermedades metabólicas como la diabetes.
• Podemos explorar el desarrollo humano mediante el uso de células madre
pluripotentes y protocolos de diferenciación, modelos que nos permiten
interrogar la genética humana.
 DIABETES TIPO 2 Renta por hogar

DETERMINANTES GENÉTICOS
CONOCIDOS (T2D-GWAS)

DETERMINANTES GENÉTICOS
DESCONOCIDOS

DIETA Incidencia de diabetes

ESTILO DE VIDA

CÓDIGO POSTAL
 abartolome@iib.uam.es

bartolomelab.com

“Development of Pancreatic Islets and Beta

Cell Mass Lab”