República Bolivariana de Venezuela

Ministerio del Poder Popular para la Educación

Universidad Nacional Experimental “Francisco de Miranda”

Área: Ciencias de la Salud

Programa: Medicina

Unidad Curricular: Microbiología II

Técnicas comúnmente empleadas en el diagnóstico serológico de

infección viral.

Docente: Integrantes:

Dr. Christopher Hernández. Br. Dan Hernandez C. I. 28.738.923

Br. Josseilyth Maduro C.I. 30480317

Punto Fijo, de 2023

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 INDICE

1) Conceptos básicos__________________________________________ Pág. 3

2) Toma manejo y preservación de muestras para estudios virológicos. Pág. 4
3) Inmunoanalisis enzimatico (ELISA) directo e indirecto__________ Pág. 6
4) Aglutinación en látex_______________________________________ Pág. 9
5) Inmunofluorescencia indirecta (IFI)_________________________ Pág. 10
6) Western Blot / Inmunoblot_________________________________ Pág. 11
7) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)___________________ Pág. 13
8) Aislamiento viral _________________________________________ Pág. 15

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 1) CONCEPTOS BÁSICOS:

1.1 ENZIMOINMUNOANÁLISIS DE ADSORCIÓN (ELISA):

Es una técnica de laboratorio que usa anticuerpos ligados a enzimas a fin de

detectar y medir la cantidad de una sustancia en una solución, como el suero. La prueba
se hace usando una superficie sólida a la que los anticuerpos y otras moléculas se
adhieren. En la etapa final, se produce una reacción enzimática que causa un cambio
de color que puede leerse mediante el uso de una máquina especial.

1.2 INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI):

Es una de las técnicas más utilizadas en los estudios de autoinmunidad debido

a su fácil manejo y estandarización. La técnica se basa en el reconocimiento de los
anticuerpos que reconocen estructuras antigénicas celulares nativas. La interacción se
evidencia por medio de un anticuerpo antiinmunoglobulina humana, producido en
conejo, cabra o cobayo, dirigido contra las fracciones constantes (Fc) de las
inmunoglobulinas IgG, IgA y/o IgM. Este anticuerpo antiinmunoglobulina humano
está conjugado o acoplado a un fluoróforo (generalmente isotiocianato de
fluoresceína [FITC]).

1.3 WESTERN BLOT:

Western blot es una técnica de laboratorio utilizado para detectar una proteína
específica en una muestra de sangre o tejido. El método implica el uso de
electroforesis en gel para separar las proteínas de la muestra. Las proteínas separadas
se transfieren del gel a la superficie de una membrana. La membrana se expone a un
anticuerpo específico contra la proteína en estudio. La unión del anticuerpo se detecta
usando un marcador radiactivo o químico.

1.4 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR):

Las pruebas detectan el ADN o el ARN de un patógeno o células anormales en

una muestra. Son una forma rápida y muy precisa de diagnosticar ciertas
enfermedades infecciosas y cambios genéticos. Las pruebas PCR pueden encontrar

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 signos de una enfermedad en las fases más tempranas de la infección, ya que pueden
detectar una enfermedad cuando hay sólo una cantidad muy pequeña de patógenos en
su cuerpo.

1.5 AISLAMIENTO VIRAL:

Los virus requieren una célula hospedadora viva para su replicación, las células
hospedadoras infectadas (eucariotas o procariotas) pueden cultivarse y cultivarse, y
luego el medio de crecimiento se puede cosechar como fuente de virus. Los viriones
en el medio líquido pueden separarse de las células hospedadoras por centrifugación
o filtración. Los filtros pueden eliminar físicamente cualquier cosa presente en la
solución que sea más grande que los viriones; los virus pueden luego ser recolectados
en el filtrado. Se destaca la importancia que tiene el aislamiento viral para la detección
de anticuerpos, para la caracterización genotípica y fenotípica de la cepa y para probar
compuestos con potencial antiviral.

2) TOMA, MANEJO Y PRESERVACIÓN DE MUESTRAS PARA

ESTUDIOS VIROLÓGICOS

Un factor determinante para el aislamiento viral, es la obtención temprana de

una muestra adecuada, esto es debido a que la excreción del virus tiende a ser por pocos
días y la concentración de partículas virales disminuye progresivamente con el tiempo.
Si la concentración de virus en la muestra clínica es muy baja, se pierde fácilmente la
posibilidad de infectar células vivas y por tanto demostrarlo en los cultivos celulares.

2.1 TOMA Y MANEJO DE LA MUESTRA

Las muestras se deben tomar en las condiciones de mayor esterilidad posible,

identificada con el nombre del paciente, lugar de procedencia, el tipo de muestra, la
fecha y hora de la toma y un resumen corto de la historia clínica con la solicitud de
examen que se desea Para una muestra clínica es necesario tener en cuenta factores
adicionales, tales como:

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  Temperatura: Las muestras no se deben dejar a temperatura ambiente o en
incubadora, tampoco es recomendable congelar y descongelar las muestras,
pues así se podría alterar la estructura del agente viral.
 Tiempo de transporte de la muestra: El traslado al laboratorio debe
efectuarse entre 24 a 48 horas como máximo para que la muestra sea útil para
el aislamiento viral. Sin embargo, de no poder trasladar la muestra en el tiempo
establecido, la misma debe ser congelada a-70°C para la conservación de la
partícula presente en la muestra.
 pH: Mantenerlas a pH 7.

2.2 PRESERVACIÓN DE LA MUESTRA

Para evitar su desecación se utiliza una solución denominada medio de transporte

de virus, estos pueden ser:

 Solución Salina de Hanks.

 Solución Salina Tamponada.
 PBS (sólo útil para colectar virus influenza).
 Medio Esencial Mínimo (MEM): se obtienen mejores resultados, aunque
resulte más caro.

Estos medios de preparación requieren de la adición de los llamados

estabilizadores, que no son más que proteínas las cuales protegen la partícula viral
presente en el material infeccioso. Se añaden al medio de transporte al 0.5%. entre los
estabilizadores más utilizados comúnmente están: suero bovino fetal, albúmina bovina
fetal, lactoalbúmina

La adición de antibióticos es obligatoria, por cuanto previenen la contaminación

bacteriana que puede surgir durante la colecta y manipulación. Otro aspecto importante
a considerar es el empleo de fungicidas para prevenir la contaminación por hongos, el
más comúnmente usado es la anfotericina B. Por lo general las concentraciones
recomendadas de antibiótico para el medio de transporte son las siguientes:

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  Penicilina: 200 unidades por mL.
 Estreptomicina: 200µg/mL.
 Anfotericina B: 5µg/mL.

Es necesario tener en consideración que el empleo de concentraciones muy

superiores puede provocar un efecto tóxico en el cultivo celular inoculado, ocasionando
un falso positivo.

3) INMUNOANALISIS ENZIMATICO (ELISA) DIRECTO E

INDIRECTO

La técnica ELISA ("Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay" Ensayo

inmunoabsorbente ligado a enzimas) se basa en la detección de un antígeno
inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente
producen una reacción cuyo producto, por ejemplo, un colorante, puede ser medido
espectofotométricamente.

ELISA directo; técnica de elección para analizar la respuesta inmune a un

determinado antígeno, por ejemplo, en los procesos de producción de anticuerpos o en
procedimientos de diagnóstico.

 ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se
preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se
encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la
presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles
negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,)
pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado.
Asimismo, se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el
antígeno buscado, o bien se le ha añadido).

ELISA indirecto: ensayo de elección para determinar la concentración total de

anticuerpos en una determinada muestra.

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  ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la
anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de
detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno, y uno
secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad
por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más
anticuerpo secundario por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es
la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un
mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos.

3.1 TABLA DE VENTAJAS Y LIMITACIONES DEL DIAGNÓSTICO

SEROLOGICO ELISA

ELISA VENTAJAS LIMITACIONES

ELISA directo  Simple y rápido.  Puede dar mayor
 No hay posibilidad ruido de fondo, ya
de reactividad que otras proteínas
cruzada con el presentes en la
anticuerpo muestra (además
secundario. del antígeno de
 Menor interés) pueden
probabilidad de adherirse a la
error debido al uso placa.
de un menor  No hay
número de amplificación de la
reactivos y pasos señal, lo que
en el reduce la
procedimiento. sensibilidad del
ensayo.
ELISA indirecto  Alta sensibilidad el  Protocolo más
por uso de complejo, incluye

7
 anticuerpos pasos de
secundarios. incubación
 Alta flexibilidad. adicionales con el
 El anticuerpo anticuerpo
primario mantiene secundario.
intacta su  El uso de
inmunoreactividad anticuerpos
al no ir conjugado. secundarios puede
dar lugar a
reactividad
cruzada.

3.2 UTILIDAD PRÁCTICA DE ELISA

Estas técnicas se utilizan ampliamente en el diagnóstico de hepatitis A y B,

rotavirus, el agente Norwalk, ADV, el RSV, parainfluenza, influenza A y B. En VIH
la demostración del antígeno p 24, es útil en el diagnóstico de la infección en niños y
en pacientes que se encuentran en ventana inmunológica, además es de gran utilidad
en el pronóstico y la progresión de la infección, así como en el control de la terapia
antirretroviral.

3.3 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS DE ELISA

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 4) AGLUTINACIÓN EN LATEX

La prueba de aglutinación de látex se basa en reacciones inmunológicas

antígeno-anticuerpo en las cuales las partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos
específicos provocan, al contactar con los antígenos correspondientes, una reacción de
aglutinación que se evidencia por la formación de malla o grumos visibles
macroscópicamente. Las partículas de latex spn esferas de poliestireno que se unen
fácilmente al fragmento cristalizable (Fc) de moléculas de inmunoglobulina G (IgG) o
inmunoglobulina M (IgM), esta última es mucho más eficiente en aglutinar partículas
naturales.

4.1 VENTAJAS, LIMITACIONES Y UTILIDAD PRÁCTICA DEL

DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE AGLUTINACIÓN EN LATEX

Ventajas Limitaciones Utilidad práctica

 Son técnicas  Presencia de  Demostración de

rápidas. reacciones antígenos de
 Fiables. cruzadas sobre rotavirus en
 Tienen un precio todo con otros materias fecales
asequible. antígenos en la
 Son fácilmente muestra.
realizables en
cualquier tipo de
laboratorio de
microbiología
clínica.
 Se pueden aplicar
prácticamente en
cualquier tipo de
muestra

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 La aglutinación con látex es utilizada para detectar anticuerpos contra leptospira
en sueros de humanos y de animales, para la detección de factor reumatoide en
pacientes con artritis reumatoide, con una sensibilidad del 93 % y especificidad 80 %.
A su vez, es utilizado también para el dengue, zika, echinococosis quística, destacando
que los estreptococos beta-hemolíticos se pueden identificar, rápidamente y con
exactitud con este método de diagnóstico.

4.2 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

En cuanto a la interpretación y lectura del resultado, si vemos se aprecia grumos

en la superficie, quiere decir que es positivo, si solo hay turbidez es no concluyente y
si no hay nada es negativo

5) INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)

Se utiliza un segundo anticuerpo fluorescente específico para el anticuerpo

primario con el fin de detectar el anticuerpo antivírico primario y localizar el antígeno.
Otra posibilidad, es la localización de un anticuerpo modificado por la unión de una
molécula de biotina (la vitamina), por su gran afinidad de unión a moléculas de avidina
o estreptavidina.

Una molécula fluorescente o una enzima, pueden modificar la molécula de

avidina o estreptavidinA, con el fin de facilitar su detección. Estas técnicas son útiles
para el análisis de muestras de biopsias tisulares, células sanguíneas y células de cultivo

5.1 TABLA DE VENTAJAS, LIMITACIONES Y UTILIDAD PRÁCTICA DEL

DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO IFI

Ventajas Limitaciones Utilidad práctica

 Se pueden obtener  Costo elevado.  Técnicas analíticas
resultados rápidos (cuali-y
cuantitativas) en

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  No es necesario  Requiere personal Química y
realizar cultivos. con mucha Bioquímica.
 Se puede experiencia.  Métodos
identificar  Los resultados no inmunológicos de
microorganismos son 100% diagnóstico
específicos en un específicos. médico.
grupo mixto.  Análisis
 Determina la poblacional de
identidad de un células
organismo muerto. (citofluorimetría
 Es sensible. de flujo).

5.2 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS DE IFI

 Treponema Pallidum: agente etiológico de la sífilis en la cual por la

inmunofluorescencia se aprecian en forma de espiroqueta.
 Virus del dengue: se aprecian células fluorecentes infectadas con el virus del
dengue. Infección evidenciada con anticuerpos monoclonales para cada
serotipo.
 Biopsias renales: Anticuerpos contra membrana basal glomerular de tipo IgG.

6) WESTERN BLOT / INMUNOBLOT

Las técnicas inmunológicas de Inmunoblot están encontrando amplias

aplicaciones en el diagnóstico virológico. Son particularmente útiles para el
diagnóstico del HIV. La técnica de WB se basa en la separación electroforética de
proteínas virales que son posteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa con
el objeto de determinar la presencia de anticuerpos específicos contra cada una de esas
proteínas. Esta técnica se realiza esquemáticamente en 3 pasos:

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 1) Se produce en cultivos celulares grandes cantidades de virus que luego son
tratados químicamente para su disgregación e inactivación. Los antígenos
resultantes del lisado viral se separan por electroforesis en gel de
Poliacrilamida.
2) Se realiza una transferencia (blotting o electrotransferencia) de la Ag separados
a membranas de nitrocelulosa.
3) Se coloca el suero del paciente sobre la membrana de nitrocelulosa.
Posteriormente se añaden anticuerpos anti-inmunoglobulina humana unida a
una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina) y, por último, se agrega el
substrato enzimático para la visualización de las bandas reactivas con un
producto final coloreado.
6.1 VENTAJAS, LIMITACIONES Y UTILIDAD PRÁCTICA DEL
DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO

Las ventajas de este método son:

 Rapidez y sencillez.
 Bajo coste económico.
 No requiere ningún equipamiento especial.
 Las membranas húmedas son flexibles y fáciles de manipular.
 Las proteínas bloqueadas en la membrana son accesibles para los diferentes
ligandos.
 Se necesitan pocos reactivos para el análisis.
 Se pueden mantener las membranas útiles durante más tiempo.

La principal limitación de este método, es que resulta difícil realizar comparaciones

entre laboratorios, principalmente debido a la heterogeneidad de las cepas y las
preparaciones antigénicas utilizadas.

Utilidad práctica

Este método se aplica en pacientes con cisticercosis, hidatidosis, fascioliasis

humana, VIH, enfermedad de Lyme.

12
6.2 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

7) REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Mediante esta técnica se pueden encontrar cantidades mínimas de un agente

infeccioso en una muestra clínica gracias a la amplificación selectiva y repetitiva de
una secuencia de nucleótidos de un microorganismo determinado que hace un proceso
de síntesis de ADN. La PCR consta de tres pasos:

1. La desnaturalización del ADN en la muestra, lo que se logra al someterlo a altas

temperaturas (95ºC) para lograr la separación de las cadenas.
2. La hibridización de los cebadores (a 55ºC) que son unos fragmentos cortos de
ADN complementarios a los extremos 5' y 3' de las secuencias por amplificar y
a partir de los cuales se inicia la síntesis, éstos son específicos de la secuencia
del microorganismo que ha de descubrir.
3. La extensión de estos cebadores por la enzima ADN polimerasa (a 72ºC)
termoestable (la taq polimerasa extraída de la bacteria Thermus aquaticus) que
produce dos bandas de ADN que son idénticas a la banda blanco original.

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 Estas reacciones se llevan a cabo de una forma automatizada en un equipo
denominado termociclador. Así, en cada ciclo de estos tres pasos, se duplica el material
genético en un factor de 2n (donde n es el número de ciclos) hasta que éste se evidencia
fácilmente en un gel de agarosa y se confronta con una sonda específica para confirmar
la identificación final del material encontrado.

4.1 TABLA DE VENTAJAS, LIMITACIONES Y UTILIDAD DE PCR

Ventajas Limitaciones Utilidad práctica

 Rápida (demora  Posibilidad de La PCR se utiliza
entre 6 y 8 horas) falsos positivos para descubrir:
 Puede evidenciar  la prueba se debe  VIH,
una infección efectuar en  CMV,
aunque el condiciones  virus de la
individuo se adecuadas de hepatitis B,
encuentre en astringencia, es  papilomavirus,
ventana decir, una hantavirus,
inmunológica temperatura, pH y  herpes 6 y 8.
concentración de Así como una gran
cebadores y variedad de patógenos
nucleótidos (bacterias, parásitos,
apropiados. etc.)
 Si hay fallas,
pueden ocurrir
amplificaciones
inespecíficas, y
contaminaciones
con ADN extraño.

Es importante tener en cuenta que una PCR positiva no siempre indica infección
activa, pues demuestra material genético y se puede tratar de una infección latente o

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presencia de material genético de un agente no infectivo; por tanto su interpretación se
hace en el contexto clínico de la persona

4.2 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

8) AISLAMIENTO VIRAL

Los virus son microorganismos intracelulares y para evidenciarlos, se deben

utilizar sistemas basados en líneas celulares que permitan su desarrollo. La invasión
viral se evidencia a través de un cambio celular o efecto citopático (EC) y mediante
pruebas complementarias. Los sistemas de cultivo más utilizados son:

 Cultivos primarios. Se caracterizan por tener varios tipos de células. La

mayoría son de crecimiento limitado in vitro, generalmente resisten 5 a 10
subcultivos y son permisivas a un amplio rango de virus; p. e., células de riñón
embrionario humano (REH).
 Cepas de células diploides. Derivadas de tejidos normales, se utilizan en la
producción de vacunas, aislamiento viral y como sustratos para probar
materiales tóxicos. Están constituidas por un tipo de células que retienen su
número cromosómico diploide original; p.e., los fibroblastos de pulmón.
 Líneas celulares. Son células inmortalizadas en el laboratorio, resisten (n)
número de pases y se caracterizan por derivarse de tejidos normales o de

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 tumores malignos y se han pasado por los menos 70 veces in vitro; p.e., células
Vero (riñón de mono verde africano)

Para los cultivos virales se utilizan monocapas celulares adheridas al lecho de

un tubo, que requieren de sustratos esenciales para su mantenimiento, una solución
amortiguadora y un pH adecuado, además se deben suplementar con suero fetal
bovino, que contiene múltiples factores promotores de crecimiento celular.

8.1 TABLA DE VENTAJAS, LIMITACIONES Y UTILIDAD DEL

AISLAMIENTO VIRAL

Ventajas Limitaciones Utilidad práctica

 Posibilidad de Su eficacia depende  Aislamiento de:
obtener altas del momento en que Citomegalovirus
concentraciones  Tome la (CMV).
de virus completo, muestra,  Herpes (HSV),
para posteriores  Transporte  Adenovirus
estudios de óptimo y (ADV),
caracterización rápido  Enterovirus,
genómica y  Proceso suele  Virus Sincicial
antigénica, de ser lento. respiratorio
sensibilidad  Requiere el (RSV).
antiviral y para uso de
conservación en sistemas de
biorepositorios. cultivos
adecuados.

8.3 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Una vez que la monocapa se inocula con una muestra pretratada que proviene
de un individuo infectado, el virus se puede descubrir por el desarrollo de un efecto
celular EC morfológico degenerativo visible o éste puede aparecer después de 3 ó

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4 días. El tipo de EC que se observa es a menudo la clave para identificar el virus
infectante, el EC puede ser de varios tipos: la formación de sincicios, o de vesículas
o inclusiones o el redondeamiento y desprendimiento de la monocapa celular.

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 Referencias de fuentes electrónicas en línea

» ABYNETEK, (JUN 27, 2019). TIPOS DE ELISA ¿CONOCES LAS

DIFERENCIAS? https://www.abyntek.com/tipos-de-elisa/
» ABYNETEK, (JUL 11, 2019). VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS
DISTINTOS TIPOS DE ELISA. https://www.abyntek.com/ventajas-y-
desventajas-de-los-distintos-tipos-de-elisa/
» CRESPO ORTIZ, MARÍA DEL PILAR (MARCH 24, 2015). “EL
DIAGNÓSTICO VIRAL POR EL LABORATORIO”.
https://www.redalyc.org/pdf/283/28331306.pdf
» https://espanol.libretexts.org/Biologia/Microbiolog%C3%ADa/Microbiolog%C3%ADa_(O
penStax)/06%3A_Pat%C3%B3genos_acelulares/6.03%3A_Aislamiento%2C_Cultivo_e_Id
entificaci%C3%B3n_de_Virus
» D.F. Hernández Ramírez, J. Cabiedes / Reumatol Clin.(2010). “Técnicas
inmunológicas que apoyan el diagnóstico de las enfermedades autoinmunes”.
Editorial: ElSEIVER DOYMA
» MINISTERIO DE SALUD DE EL SALVADOR, (OCTUBRE 2013), “MANUAL
DE TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRAS DE LABORATORIO”.
» MedlinePlus en español [Internet]. Bethesda (MD): Biblioteca Nacional de
Medicina (EE. UU.) [actualizado 27 ago. 2019]. “PRUEBAS DE PCR”. Disponible
en: https://medlineplus.gov/spanish/pruebas-de-laboratorio/pruebas-de-pcr/
»

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