Clonación y transgénesis en mamíferos

Dr. Jaime Ruiz Béjar

Clonación y Transgenesis en CS
 Utilidad

Multiplicación de animales de alta productividad

Conservación de especies y razas en peligro de extinción
Producción de proteínas para uso farmacéutico: biorreactores
Resistencia a enfermedades
 Vacas Transgénicas

BIOSIDUS (ARGENTINA) : DESARROLLO DE PRODUCTOS BIOLÓGICOS

Y FARMACÉUTICOS EN VACAS TRANSGÉNICAS

 1990-1995: Desarrolla tecnología de transformación genética y clonación de

vacas.
 2002: Nace primera ternera transgénica en América Latina con el gen de la
hormona de crecimiento humano (hGH).
 2003: Pampa Mansa, vaca transgénica inicia la producción de hGH en la
leche (5g/l).
• 2004: Nace Pampero, primer bovino transgénico macho para procrear un
rebaño de vacas transgénicas con el gen hGH.
 2005: La meta es 10 terneras transgénicas como biofábricas de hGH.
 2006: Proyecto avanzado para la producción de insulina humana en leche de
vacas transgénicas y clonadas.
 2007: Nace primer ternero transgénico con el gen de la insulina humana.

FUENTE: www.biosidus.com.ar y www.sidus.com.ar

 Establecimiento de líneas celulares

Toma de muestra de piel Cultivo celular primario

Establecimiento de líneas celulares

DMEM/F-12
10% Suero fetal
Sulfato de gentamicina
Establecimiento de líneas celulares

DMEM/F-12
Fibroblastos de alpaca 10% Suero fetal
Sulfato de gentamicina
10% DMSO

Fibroblastos de llama
 MEDIOS UTILIZADOS DURANTE EL ESTABLECIMIENTO DE
LINEAS CELULARES ADULTAS Y FETALES EN ALPACAS

SUPLEMENTOS

SUERO FETAL BOVINO (FCS)

DULBECO MODIFICADO (DMEM)
GENTAMICINA

HEPES

BICARBONATO DE SODIO
TRYPSINA (0.5%)
TRIPAN AZUL 0.4%
CRIOPRESERVACION DE LINEAS CELULARES
MEDIO DE CRIOPRESERVACIÓN

10% Dimetil sulfóxido (DMSO)

10% Suero Fetal Bovino (FCS)

10% Sultafo de Gentamicina

70% DMEM

18h a -20° C
 DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD POST-DESCONGELACIÓN

Baño Maria 37 ° C 50 ul de solución celular

10-15 Minutos 50 ul de trypan azul

%CV= 70 X 100
70+ 40
% células viables = células viables (sin colorear) X 100 CV=63.6

células viables+ células muertas (coloreadas)

 ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS PRIMARIOS A PARTIR DE CÉLULAS
SOMATICAS DE ALPACAS Y VICUÑAS

-Alpaca macho de 2 años de edad.

-Vicuña
- Células confluentes a los 14 días de haber
hembra de 6 años de edad
establecido el cultivo celular.
-Cultivocelular a los 7 días de haber
- 100% de confluencia celular
establecido el cultivo.

-100 % de adherencia celular.

 OBTENCION DE LINEAS CELULARES
Figura 1: FIBROBLATOS DE ALPACAS DE 3 AÑOS DE EDAD
COM PORTAMIENTO DEL CRECIMIENTO
CELULAR EN CELULAS SOM ATICAS

800000
700000
N° Células/m l

600000
500000
400000 Serie1
300000
200000
100000
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
N° pasajes

Figura 2: FIBROBLATOS DE VICUÑAS DE 6 AÑOS DE EDAD

Fibroblastos de vicuña 6años

1400000
1200000
1000000
N° Cel/ml

800000 N° Cel/ml vicuña

600000 6años
400000
200000
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
N° pasaje celular
 LINEAS DE CELULAS SOMATICAS

800000
700000

N° DE CELULAS
600000
500000 N° PASAJES
400000
300000 N° CELULAS
200000
100000
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
N° PASAJES

Landeo 2010
Preparación de ovocitos receptores de núcleo
 Maduración in vitro de ovocitos
• Medio de maduración (MM):
TCM – 199 con Hepes
FSH
Piruvato de Na
Sulfato de Gentamicina
Suero Fetal Bovino (FCS al 10%)
Estradiol

Corpúsculo
polar

Ovocitos maduros de alpaca

Clonación
El micromanipulador
 Enucleación y transferencia de núcleos

Cultivar ovocitos 20 minutos

en SOF-HEPES con
5 μg/ml Citocalasina B
5 μg/ml Hoechst 33342
 Fusión ovocito-célula donadora

Cámara de electrofusión 1 ml Manitol 0,2 M

2 pulsos eléctricos de 140 volts por

40 μseg, separados por 1 segundo

SOF-HEPES por 2
horas en incubadora
 Activación química y cultivo embrionario

 Ionomicina de Ca: 4 minutos

 6- DMAP: 3 horas
 Evaluar división: a las 48 horas y blastocistos a
los 8 días.
Cultivo: SOF-IVC
 Usos de la activación química

Forma natural

Animales clonados

Embriones
partenogenéticos

Ca intracelular
Animales Transgénicos
Se reinicia la meiosis
 Activación Partenogenética

hepes L1
4min.
5min 500μl y 3ml
200μl
Cultivo: SOF - IVC 3horas
48 horas y 8 días IVC
L2

3ml
50μl 80-100μl
 Hand made cloning

No requiere micromanipuladores

Agujas de perforación BLS DN-09

Microcuchilla
 Hand made cloning

ovocitos con cono que contiene

Digestión con pronasa plato metafásico
Hand made cloning
Hand made cloning

2 1. electrodos
2. medio de fusión
1
3. Complejo citoplasma-célula-citoplasma
3 (fusión en forma de sándwich)

1
2008: Universidad de Concepción 2007: Universidad Austral de Chile

INIA: 2011 (Joya Verde)

Transgenesis
 GFP

Hexapéptido
fluoróforo

Aequorea victoria
Embriones Transgénicos

Observación de transfección: 24 horas

Selección de células: 1- 2 meses

Geneticina: muerte de células no transfectadas

Fibroblastos de vaca Fibroblastos de alpaca

 Transfección de Cultivo Primario de
Fibroblastos Adultos.
Dna Plasmidial Lipofectamina
(pEGFPN-1) 4μg en DMEM
1,2 μg en DMEM

Complejo
Reposo
25 min

Fibroblastos
en confluencia

2,4 mg/ml pEGFPN-1

8 µg/ml de lipofectamina
DMEM sin suero
Figura 2.Fibroblastos de piel de bovino adulto 48 h post transfección con GFP
bajo luz UV y filtro para FITC
Selección de células resistentes
a Geneticina

Cultivo sin Cultivo con

Geneticina Geneticina

DMEM con suero ≥ 90% de

37°C celulas resistentes
Figura 3. Cultivo de fibroblastos adultos transfectados, con 1.2 ug de Dna
plasmidial y 3 ul de lipofectamina 2000, después de dos meses de selección .
Fusión y activación de embriones transgénicos

Fusión Activación

 Ionomicina de Ca: 4 minutos

 6- DMAP: 3 horas
 Evaluar división: a las 48
horas y blastocistos a los 8
días.
PRIMERA TERNERA CLONADA NACIDA
EN ARGENTINA (PAMPA- 2002)

VACA TRANSGÉNICA. PRODUCE

EN SU LECHE HORMONA DE
CRECIMIENTO (PAMPA MANSA
-2002

TERNERA CAPAZ DE PRODUCIR

EN
SU LECHE INSULINA HUMANA
(PATAGONIA I- 2007)