EVALUACIÓN DE SEMEN PORCINO Y DETERMINACION MORFOLOGICA

DE ESPERMATOZOIDES
Informe de Laboratorio– Biotecnología Animal 3777
Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE.

1 INTRODUCCIÓN
El análisis morfológico de espermatozoides puede usarse como un indicativo de la fertilidad o infertilidad
in vivo. Producto de esto se obtiene normalmente la proporción de espermatozoides normales en todas sus
características y los anormales. Las anormalidades no deben ser mayores al 30% de los defectos totales, es
decir un semen normal debe tener un mínimo de 80% de espermatozoides morfológicamente normales
(Bohórquez, 2000).
Para la evaluación de la morfología se usa la técnica de coloración de un solo paso para evitar el daño de la
muestra por manipulación, los colorantes más usados son: tinta china y eosina. Además, se necesita tomar
en cuenta los parámetros para que un espermatozoide sea tomado como normal (va a depender mucho de
la especie animal), aunque en morfología no hay mucha diferencia entre la mayoría de espermatozoides
(Gimeno, 2014).
El espermatozoide maduro es una célula altamente diferenciada. Está formado por: 1. cabeza, que contiene
el núcleo y aporta la información genética. 2. pieza intermedia, que contiene las mitocondrias, fuente de
energía. 3. flagelo, que proporciona la movilidad necesaria para el traslado al lugar de fecundación y
asegura la adecuada orientación de la cabeza para penetrar las cubiertas del ovocito. En la morfología
también es clave analizar el acrosoma, una estructura membranosa, situada entre el núcleo y la membrana
plasmática, con forma de capuchón. Contiene una enzima proteolítica llamada acrosina, involucrada
directamente en la fecundación por reconocimiento y penetración del espermatozoide a través de las
envolturas del ovocito (Nallela, Sharma, Aziz, & Agarwal, 2014).
Las anormalidades radican en la cabeza (acrosomas desprendidos, protuberantes, defecto del cráter, cuello
torcido o roto), pieza media (gota citoplasmática proximal, unión al cuello, mitocondrias alteradas), cola
(gota citoplasmática distal pero suele ser aceptado como normal, cola torcida, cola enrollada) y acrosóma
(integridad) (Katz, Diel, & Overstreet, 1982).
Y su clasificación integra Anormalidades primarias: ocurren durante espermatogenesis (dentro de los
tubulos seminíferos), suelen ubicarse en la cabeza y porción media del espermatozoide, aunque pueden
observarse 16. Anormalidades secundarias: son problemas en la maduración del mismo espermatozoide
ocurre durante el tránsito a través del sistema de ductos del testículo y epidídimo (gota citoplasmática)
(Reyes, 2004).
La colección del semen debe hacerse en una sala de colección o en el corral del cerdo en cuestión. La
colección puede hacerse con vagina artificial (VA) o manualmente, ya sea con mano enguantada (el llamado
método japonés) o introduciendo el pene en un cilindro de goma descartable (IMV, Francia). Normalmente
se usa un potro de metal para la colección, al cual los cerdos entrenados montan sin mayores problemas. o,
El eyaculado del cerdo es fraccionado y consiste de una primera fracción que en principio solo contiene
secreción de la próstata y algo de gel de las glándulas bulbouretrales (acuosa, translúcida a opaca en color).
La segunda porción del eyaculado, fácilmente identificable por su color blanco a lechoso, se llama fracción
rica en espermatozoides a la que le sigue otra fracción (post-espermática) donde el número de
espermatozoides disminuye rápidamente y donde la secreción creciente de las vesículas seminales y de las
glándulas bulbouretrales dominan (la fracción post-espermática vuelve a ser translúcida u opaca
(Rodríguez-Martínez, 2008)

2 OBJETIVOS
General
Obtención y evaluación de las de semen porcino
Específicos

 Determinar los principales parámetros de viabilidad de semen.

 Identificar las principales anormalidades presentes en espermatozoides porcinos.
 Estimar la viabilidad y el recuento total de espermatozoides en la muestra de semen porcino.

3 METODOLOGÍA
Extracción del Semen
Se seleccionó el cerdo para la colecta, que estaba entrenado para realizar la monta en el caballete, una vez
encima de la monta artificial, se limpió la zona del pene con agua y papel, y se procedió a tomar el pene
con la mano enguantada, la primera porción del eyaculado se desechó, mientras que la segunda porción del
eyaculado fue recolectada en el envase especial, con la funda de recolección, se tomó la mayor cantidad de
semen posible (50 mL) y se almacenó en un cooler hasta llevar al laboratorio.
Motilidad de masa:
Se calentó un portaobjetos con ayuda del mechero hasta llegar a una temperatura de 37°C
aproximadamente. Con una pipeta Pasteur se tomó una gota de semen y se la colocó en el portaobjeto, luego
se lo observó en el microscopio óptico de campo claro a 10x. Este proceso fue llevado a cabo en pocos
minutos.
Motilidad individual
Se calentó un portaobjetos con ayuda del mechero hasta llegar a una temperatura de 37°C
aproximadamente. Con una pipeta Pasteur se tomó una gota de semen y se la colocó en el portaobjeto
cubriendola con un cubreobjetos. Se observó en el microscopio óptico de campo a 40x.
Determinación de porcentaje Vivos/Muertos
La determinación se realizó con la tinción de eosina, donde se emplea a una dilución 1:3. Es decir, 1 gota
de semen por 3 gotas de eosina.
Se realizó tomando una pequeña cantidad de la solución en un portaobjetos y con otro realizando un frotis.
El portaobjetos se observa en el microscopio a 40x y 100x.
Determinación de anormalidades
La determinación se realizó con la tinción de eosina, donde se emplea a una dilución 1:3. Es decir, 1 gota
de semen por 3 gotas de eosina. Se realizó tomando una pequeña cantidad de la solución en un portaobjetos
y con otro realizando un frotis. El portaobjetos se observa en el microscopio a 40x.
Determinación de la concentración con cámara de Neubauer
En placas de pocillos se adicionaron en orden, primero una cantidad de semen y a continuación una cantidad
de espermicida al 10% con una pipeta Pasteur, luego se succionó hasta la marca 0,5 de la pipeta de Thoma
la muestra de semen del un pocillo, luego se cambió al pocillo de espermicida y se continuó aspirando hasta
la señal 101. Colocando la pipeta en posición horizontal se homogeneizó el semen con el espermicida. Se
descartaron las 3 primeras gotas y la cuarta se colocó en los dos extremos del cubre objetos de la cámara
de Neubauer, Con el microscopio, se realizó el conteo de espermatozoides, en los cuadrados de los
extremos y el centro de la cámara par su conteo. El número promedio de espermatozoides contados se
aplicó en la siguiente fórmula para encontrar la concentración de espermatozoides por mL :
C=F* Numero total espermatozoides contados*50000
donde C es la concentración en espermatozoides por mL y F es el factor de dilución en este caso (100).
Determinación de la concentración mediante cámara de Karras
La cámara de Karras o espermiodensimetro permite determinar la concentración de espermatozides por
mililitro, basandose en la turbidez de la muestra vista en escala de densimetro. Se realizó una dilución 1:9
de la muestra con solucion salina estéril. Esta dilución se colocó en la cámara y se observó el valor aún
legible dentro de la escala graduada sobre un fondo blanco.
Determinación de la concentración mediante espectrofotometría
De la dilución 1:9 usada en la cámara de Karras se prepararon diluciones 1:1 seriadas de las cuales se
midieron las absorbancias en el espectrofotometro a una longitud de onda de 340 nm.

4 RESULTADOS
Valoración inicial
Volumen: 50 mL
pH: 7
Color: Blanquecino
Olor: ligeramente clorado
Motilidad individual: 85%
Motilidad en masa: 90%
Vivos: 90%
Normales: 80%

Determinación del número de dosis

𝟓𝟓𝟓𝒙𝟏𝟎𝟔 ∙ 𝟓𝟎 ∙ 𝟎, 𝟖𝟓 ∙ 𝟎, 𝟗 ∙ 𝟎, 𝟗 ∙ 𝟎, 𝟖
#𝑫𝒐𝒔𝒊𝒔 =
𝟐𝟓𝟎𝟎𝒙𝟏𝟎𝟔
#𝑫𝒐𝒔𝒊𝒔 = 𝟔, 𝟕𝟗 ~ 𝟕 𝑫𝒐𝒔𝒊𝒔
Valoración posterior a la preparación de dosis
Motilidad individual: 50%
Motilidad en masa: 30%
Vivos: 60%
Normales: 37%

Motilidad en masa de semen sin diluyente. Microscopio óptico de campo claro (10x).

Motilidad individual de semen sin diluyente. Microscopio óptico de campo claro (40x).
Determinación de porcentaje de vivos Muertos
Colorante: Tinta china
Vivo :64.70%
Muertos: 35.30%
Colorante: eosina
Vivo :75%
Muertos: 25%
Anormalidades
Colorante: Eosina

Normales: 37%
Anormales: 63%
Colorante: Tinta china
Normales: 24%
Anormales: 76%

Semen + eosina (%) Semen + tinta china(%)

Espermatozoides normales 37 24

Espermatozoides anormales Sin cola 9 8

Sin cabeza 7 11

Cola curva 44 53

Macrocefalia 3 4

Determinación de la concentración con cámara de Neubauer

El número promedio de espermatozoides contados fue de 28 y empleando la fórmula de cálculo de
concentración se obtuvo una concentración de 140 millones de espermatozoides por mL con un factor de
dilución de 100 (marca 1 de la pipeta de Thoma), se empleó este factor y no 200 (marca 0.5 de la pipeta de
Thoma) porque la muestra se encontraba muy concentrada por lo cual en la observación en el microscopio
se observaron los espermazoides agrupados en masa lo cual dificulto su conteó y de ahí el numéro bajo
obtenido en el conteo.
Determinación de la concentración mediante cámara de Karras:
La concentración de espermatozoides se determinó observando el último valor graduado de la cámara que
todavía era legible, contrapuesto sobre un fondo blanco. Se obtuvo un valor de 35 (figura 1). Luego se
encontró el valor de espermatozoides por mililitro correspondiente en la tabla para leer la densidad del
eyaculado, el cual fue de 425*10^6 células/ml.

Figura 1. Determinación de la concentración espermática mediante la cámara de Karras.

Determinación de la concentración por espectrofotometría:
Las absorbancias medidas a 340 nm y el número estimado de espermatozoides para cada dilución calculado
a partir de la densidad determinada en la cámara de Karras se presentan en la tabla 1.

Dilución Absorbancia # de
espermatozoides

0.05 1.554 2.13E+05

0.025 1.148 1.06E+05

0.0125 0.687 5.31E+04

0.00625 0.193 2.66E+04

0.003125 0.087 1.33E+04

Se realizó una regresión lineal usando la dilución como variable independiente y la absorbancia como
variable dependiente. Se determinó que la ecuación de la recta es y = 31.228x +0.1288 (figura X). A partir
de esta ecuación se estimó la absorbancia de la dilución 0.1 (1/10) que fue la usada para la determinación
de la densidad en la Karras obteniéndose un valor de 3.2516.

Figura x. Regresión lineal usando la dilución en el eje X y la absorbancia en el eje Y.

Se realizó una segunda regresión lineal tomando al número de espermatozoides como variable
independiente y a la absorbancia como variable dependiente, obteniéndose la ecuación y = 7*10-6x + 0.1288
(figura y). A partir de esta ecuación se calculó el número estimado de espermatozoides para la dilución 0.1,
dando como resultado 4.46*105 espermatozoides.

Figura y. Regresión lineal usando número estimado de espermatozoides en el eje X y absorbancia en el

eje Y.

5 DISCUSIÓN
El examen morfológico es una parte importante del análisis seminal para calificar la fertilidad potencial de
los machos (Alvarez, 2003). La evaluación morfológica es significativa porque la presencia de
anormalidades está relacionada directamente con la fertilidad (Flores, Contreras, & Carrera, 2000), lo cual
es de especial interés cuando se requieren machos reproductores. Aunque no siempre los espermatozoides
con apariencia normal en el microscopio pueden ser fértiles (Alvarez, 2003). Dentro del análisis se
encontraron las siguientes irregularidades de los espermatozoides: cola enrollada, súper enrollada y
aglutinaciones en la muestra tomada del parénquima, mientras que en el epidídimo se observaron
espermatozoides con gota citoplasmática distal (vacuola en cola), cola enrollada, cola partida, y cabezas
desprendidas. Algunos de los problemas mencionados anteriormente son manifestaciones de una
espermiogénesis irregular como las anormalidades de la cola, entre ellas se encuentran las colas abaxiales,
accesorias y múltiples (Flores, Contreras, & Carrera, 2000). Las colas múltiples se desarrollan en el
centriolo proximal y distal. Algunas de las colas enrolladas posiblemente se hayan desarrollado por shock
hipotónico, porque presentaron la forma de la cola como una curva pronunciada característica de este
fenómeno y sin gota citoplasmática. Estas manifestaciones se generan cuando los espermatozoides
permanecen demasiado tiempo en la eosina y generalmente cuando los cubreobjetos están fríos.
(Universidad Nacional de Córdoba, 2018).
Es normal encontrar las cabezas desprendidas en un número mínimo, el cual se debe a envejecimiento de
los machos o por defecto de la implantación de la cola basal. Pero si están en una cantidad considerable
espermatozoides sueltos en la muestra de semen pueden deberse a defectos en la termorregulación del
testículo y en consecuencia producidos por una espermatogénesis defectuosa. Las colas de los epidídimos
de los animales viejos tienden a acumular espermatozoides sin cola (Universidad Nacional de Córdoba,
2018). Se considera que un porcentaje entre 18 y 20% de anormalidades espermáticas se aceptan como
porcentaje satisfactorio en un espermiograma normal (Flores, Contreras, & Carrera, 2000). Dentro de la
evaluación al semen porcina, se tuvo procentajes de anormalidades relativamente altos, por lo que puede
deberse a una mala manipulación de las muestras, o a defectos en la espermatogénesis dentro del testículo.
El semen porcino se caracteriza por tener aspecto blanco lechoso, motilidad del 50 al 80%, y anormalidades
del 30 al 40 %, entre 12 y 30 millones de espermatozoides por eyaculado . (Martí, 2011). La motilidad
descendió abruptamente al utilizar el diluyente, por lo que se atribuye a una mala manipulación y
preparación durante este paso. El recuento de espermatozoides, se encuentra en un valor aceptable.

6 CONCLUSIONES
 Los colorantes eosina y tinta china permiten evaluar las anormalidades de los espermatozoides
porque facilitan la visibilidad de las estructuras en el microscopio de campo claro.
 Se diferenciaron las siguientes anormalidades espermáticas en semen porcino: cola enrollada, cola
múltiple, cabeza desprendida.
 La mala manipulación durante la preparación de la dosis, impidió conservar altos porcentajes de
viabilidad, por lo que se recomienda especial atención durante la elaboración de las dosis y
diluyentes.

BIBLIOGRAFÍA
Alvarez, E. (2003). Andrología Teoría y práctica. Madrid: Ediciones Diaz de Santos SA.
Bohórquez, F. (2000). Momento optimo para la inseminación con semen congelado. Madrid: Universidad
de La Salle.
Flores, J., Contreras, P., & Carrera, J. (2000). Archivos de Medicina Vetrinaria. Valdivia: Universidad de
Austral de Chile.
Gimeno, I. (2014). Morfología espermática y parámetros seminales básicos en varones normo y
oligoastenoteratozoospérmicos. Valencia: UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALENCIA.
Katz, F., Diel, L., & Overstreet, J. (1982). Differences in the movement and morphologically normal and
abnormal human seminal spermatozoa. Biology of Reproduction. Vol 26: , 566-570.
Martí, S. (2011). Reproducción y neonatología de animales de granja. Navarra: SERVET.
Nallela, K., Sharma, R., Aziz, N., & Agarwal, A. (2014). Significance of sperm characteristics in the
evaluation of male infertility. Fertility and Sterility, Vol, 85: 629-634.
Reyes, M. (2004). Temas De Reproducción De Caninos Y Felinos Por Autores Latinoamericanos.
Argentina: Grafica Latina S.A.
Rodríguez-Martínez, H. (2008). Evaluación de la calidad seminal en el verraco. Uppsala: Universidad
Sueca de Ciencias Agrícolas (SLU).
Universidad Nacional de Córdoba. (2018). Facultas de Ciencias Agropecuarias. Obtenido de
http://www.fca.proed.unc.edu.ar/mod/book/view.php?id=5335&chapterid=896