PRACTICA N°12 PREPARACION DE CULTIVO DE TEJIDOS

I.- INTRODUCCION
La mayoría de las células animales y vegetales aisladas pueden vivir, multiplicarse, e incluso presentar
ciertas propiedades diferenciales, si se las cultiva en placas de plástico y con medios de cultivo adecuados.
Así, las células pueden ser observadas continuamente bajo el microscopio o analizadas bioquímicamente,
para estudiar los efectos del agregado o remoción de moléculas específicas, como hormonas o factores de
crecimiento. Además, se pueden estudiar las interacciones entre células, cultivando en la misma placa más
de un tipo celular. Cuando los experimentos se realizan con cultivos celulares, se los denomina ensayos “in
vitro” (“en vidrio”), para diferenciarlos de aquellos que se llevan a cabo en organismos completos, o
experimentos “in vivo” (“en organismo viviente”) . Los cultivos se establecen principalmente a partir de
suspensiones celulares generadas por disgregación de tejidos. A diferencia de las bacterias, la mayoría de
las células que forman parte de tejidos no pueden vivir en suspensión, y requieren una superficie sólida
sobre la cual crecer y multiplicarse. Este soporte generalmente es la base de una placa o frasco de plástico,
aunque a veces los requerimientos son más complejos y el plástico debe antes recubrirse con componentes
de la matriz extracelular (sustancia que rodea y contiene a las células en los tejidos, y con la cual
interactúan), como por ejemplo el colágeno y la fibronectina.

II.- OBJETIVOS

 Familiarizarse con el cultivo de líneas celulares, su mantenimiento y división. Analizar cultivos

con diferentes grados de confluencia.
 Preparar una placa de cantidad de células conocidas a partir del cultivo provisto

III.- MARCO TEORICO

Cultivos primarios.- Se denominan así a aquellos cultivos preparados directamente a partir de un tejido u
órgano. Pueden iniciarse con o sin fraccionamiento previo para separar los distintos tipos celulares. En estos
cultivos las células están vivas, conservan sus características originales y su proliferación es limitada.
Pueden ser removidas del recipiente de cultivo para formar cultivos secundarios
Cultivos secundarios En estas condiciones las células suelen multiplicarse hasta cubrir la superficie del
recipiente de cultivo, formando una monocapa (capa de una célula de espesor). Como consecuencia del
contacto entre las células se detiene temporalmente su proliferación, hasta que se las subcultiva a un
recipiente con medio fresco. Así, podrán subcultivarse durante semanas o meses. En este estadío, las células
frecuentemente mostrarán distintas propiedades según su origen. Por ejemplo, los fibroblastos (células que
sintetizan fibras y mantienen la matriz extracelular del tejido de muchos animales) secretarán colágeno, las
células derivadas de tejido muscular esquelético se fusionarán para generar fibras musculares con capacidad
contráctil espontánea, las células nerviosas extenderán prolongaciones (axones) eléctricamente excitables
que podrán conectarse (establecer sinapsis) con otras células nerviosas, las células epiteliales formarán
largas capas con varias propiedades de un epitelio intacto (Figura 2). Gracias a que estos fenómenos ocurren
en cultivo, es posible estudiarlos con diferentes metodologías, a veces no aplicables a tejidos intactos.

Cultivos contínuos o líneas celulares La mayoría de las células de los vertebrados dejan de dividirse
luego de un determinado número de divisiones en cultivo, por un proceso llamado senescencia celular. Por
ejemplo, los fibroblastos humanos normales se dividen solamente entre 25 y 40 veces en cultivo, antes de
detenerse. La capacidad limitada de proliferación puede ser el resultado de un acortamiento progresivo de
los telómeros (porción de ADN que se encuentra en los extremos de los cromosomas), o puede ser una
consecuencia de la activación de mecanismos denominados “puntos de control” (check points) del ciclo
celular. No todas las células humanas se inmortalizan de la misma manera. A los fibroblastos humanos se
los puede forzar a proliferar indefinidamente si se les provee el gen que codifica para la telomerasa. Otras
requieren para inmortalizarlas que se logre la inactivación de los check-points. Una forma de hacerlo es
introducir ciertos “oncogenes” (genes promotores del cáncer) que pueden obtenerse de virus que causan
cáncer, como algunas cepas del virus del papiloma humano, adenovirus, etc. Las líneas celulares son muy
útiles en la investigación celular, como fuente de un gran número de células uniformes, que pueden ser
conservadas y almacenadas en nitrógeno líquido (a -196 °C) por un período muy largo de tiempo, reteniendo
su viabilidad y siendo un buen modelo experimental para las primeras etapas de una investigación. A pesar
de la gran similitud que las células de una línea tienen entre sí, no son idénticas. La uniformidad genética
en una línea celular puede mejorarse por clonado celular, a través del cual se aísla una sola célula, la que
prolifera para formar una colonia de células clonales (idénticas). Algunas de las líneas celulares más
utilizadas se presentan en la


 HEP-2: Células heteroploides humanas derivadas de carcinoma laríngeo. Recomendadas para
RSV y ADENOVIRUS.
 MDCK: Línea celular diploide de riñón canino; para INFLUENZA y ocasionalmente
PARAINFLUENZA.
 LLC-MK2: Línea celular heteroploide de riñón de mono Rhesus. Se recomienda para el
aislamiento del virus PARAINFLUENZA. Requiere el agregado de tripsina cristalina al medio.
 MRC5: Línea celular diploide fibroblástica de pulmón embrionario humano. Se recomienda
para el aislamiento de CITOMEGALOVIRUS, HERPESVIRUS. Entre las líneas celulares que
se emplean con más frecuencia están las células Hep-2, HeLa y Vero, en cuanto a células
diploides las más utilizadas son las líneas de fibroblastos de pulmón (MRC5) que se usan para
el aislamiento de citomegalovirus (CMV). El cultivo primario más utilizado es el riñón humano
embrionario (RHE) que es permisible a los virus de circulación frecuente como el herpes
(HSV), adenovirus (ADV), enterovirus, virus sincicial respiratorio (RSV) etc. En todo caso la
elección por una u otra línea celular dependerá del virus que se quiera evidenciar.

IV.-MATERIALES Y EQUIPO

 Medios y soluciones (medios de mantenimiento y multiplicación va llevar unas soluciones

a base de sales).
 Estuche de Disección (estéril).
  Matraz Tripsinizador.
 Agar.
 Tripsina
 Pipetas
 Placas y frascos.
 Suero de ternero
 Solución de Hanks Completo (750 ml)
 Solución A:
 NaCl (80 g.), KCl (4 g.), CaCl2 (1.4 g.), MgSO2.7H2O (2g.):cada solución
que se va pesando se va diluyendo en 450 ml. H2O.
 Solución B:
 Na2PO4 (0.6 g.), KPO4(0.6 g.), glucosa (10 g.), H2Odestilada (450 ml.).
 Solución C:
 Rojo de Fenol 1% (16 ml.)
 El medio de multiplicación lleva solución Hans (770ml )y lleva hidrolizado de
lactoalbumina preparado al 5% en Hans( 100 ml ),suero de tarnero (100 ml), extrato de
levadura (2 ml ),penicilina ,y streptomina ( 10 ml ),nistatina 10 ml rojo fenol 1% (10ml) .
 Solución Buffer Fosfato (PBS): NaCl: 8 g, KCl: 0.2 g, Na2PO4: 1.15 g, H2O bidestilada:
1000 ml.

V.-PROCEDIMIENTO:

 Para un cultivo de fibroblasto empleamos embrión de pollo entre 11 días hasta 13 dias.
 Colocar los huevos seleccionados sobre un porta huevos con la cámara de aire hacia
arriba.
 Llevar los huevos a la cámara de flujo laminar (en el caso de la práctica, entre dos
mecheros).
 Limpiar la cáscara en su mitad superior, primera solución de alcohol yodado y después
con alcohol.
 Colocar las pinzas y tijeras en un vaso con alcohol y agua hirviente.
 Con la tijera larga punta curva estéril recortar el casquete o la cáscara correspondiente
a la cámara de aire (las tijeras se enjuagan con el H2O hirviente y vuelven al alcohol
para volver a usarlas).
 Coger las pinzas largas y con la punta retirar la cáscara rota así como la membrana de
la cámara de aire (esterilizar las pinzas para volver a usar).
 Con las pinzas curvas, coger al embrión del cuello y llevarlo a una placa estéril (esta
operación repetirla con todos los embriones).
 Con una tijera (estéril) eliminar la cabeza, las alas y las patas; abrir el embrión con un
corte en cruz y retirar las vísceras.
 Lavar con solución buffer fosfato por un par de veces.
 Luego, empezar a cortar lo que quede del embrión en pedazos cada vez más pequeños,
hasta formar una especie de papilla.
 Luego lavar los trozitos de carne en la placa por 2 veces con solución Buffer Fosfato
(PBS).
 Luego, llevar al matraz Tripsinizador y se agrega tripsina 25%: 4 ml. por embrión y se
deja durante 10 minutos con movimientos giratorios, para esto se pone en un agitador
magnético. Esto se puede repetir 2 veces.
 Transcurrido este tiempo el sobrenadante se vierte a un matraz, se guarda en
refrigeración (previo agregar solución de PBS) .
 Se vuelve a tripsinizar el sedimento, utilizando igual cantidad de tripsina.
 Lo que se tiene en refrigeración, se pasa por filtro (capa de gasa y algodón) a otro
matraz.
 El filtrado se centrífuga a 1 000 rpm por 5 min. luego se refrigera.
 Se elimina el sobrenadante y se queda el sedimento.
 Lavar células con PBS y luego centrifugar a 1 000 rpm por 2 veces mas.
 Se resuspende en el medio de multiplicación.
 Se recogen 10 a 15 ml. y se lleva a una placa estéril, luego se agrega el suero de feto
bovino (estimulará el crecimiento).
 Incubamos a 37°C.
 Las células caen al fondo en la placa, se multiplican por el medio y llenan los espacios
vacíos y forma la monocapa.
  Se elimina el medio de multiplicación.
 Cuando se tiene la capa de células homogéneas, ya está listo para el cultivo y aquí se
agrega se puede inocular el virus (cuando está, recién se inocula el virus).

VI.-CONCLUSIONES

 No se llegó a realizar la práctica debido a la falta de medios y de los instrumentos, como

microscopio invertido y el suero de ternero, sin embargo se cumplio el objetivo de
reconocer y familiarizarnos en la preparación de cultivo de tejidos (cultivo primario de
fibroblastos).
VII.-REFERENCIAS

 Cunnigham, H.C. 1971. Virología práctica. Acribia, España

 Davis, B. “Tratado de Microbiología”. 2º Ed. Editorial Salvat Editores S. A. 1980

 PRESCOTT L., J. HARLEY, D. KLEIN (1999). Microbiologia. 8º edic.Edit. Mc Graw

Hill Mexico D.F
 Shors, T. (2009). Virus: Estudio Molecular con Orientación Clínica. 1ª ed.Argentina.
Editorial Médica Panamericana.