CFGS LABORATORIO DE DIAGNSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO.

TEMA 1. INTRODUCCION A LA BIOQUMICA.

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TEMA 1. INTRODUCCIN A LA BIOQUMICA

1.
Concepto de Bioqumica Clnica.
2.
Etapas de un Anlisis Bioqumico.
3.
Tcnicas y mtodos de Anlisis Bioqumico.
4.
Control de Calidad en el Laboratorio.
5.
Automatizacin en el Laboratorio.
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1. CONCEPTO DE BIOQUMICA CLNICA.
Introduccin:
Los seres vivos se caracterizan por contener multitud de molculas complejas y por su alto grado de
organizacin. Adems presentan la capacidad de extraer y transformar la energa de su entorno, a partir de
materia primaria sencilla y emplearla para mantener sus propias estructuras.
Pero el atributo ms extraordinario de los seres vivos es su capacidad de producir una rplica exacta de
s mismos.
--> La bioqumica es una ciencia muy joven que deriva de 2 lneas matrices:
1- De la medicina (anatomia, fisiologa, patologa,..)
2- De la qumica orgnica (estructura de los compuestos orgnicos).
La bioqumica clnica se ocupa del estudio de los aspectos qumicos de la vida humana, en la salud y en la
enfermedad, mediante la aplicacin de los mtodos qumicos de laboratorio para el diagnstico (Dx), el
seguimiento, el control del tratamiento (tto), la prevencin y la investigacin de la enfermedad. Los aspectos
qumicos de la vida humana comprenden el estudio de los procesos metablicos en relacin a los cambios
fisiolgicos, patolgicos e inducidos por maniobras teraputicas.
Los objetivos de la bioqumica clnica son:

Diagnstico: es una hiptesis que se confirma en funcin de los resultados obtenidos en una
analtica de laboratorio: un aumento de la enzima GOT indica, por lo general, afectacin del hgado.

Seguimiento y evolucin: se establecen valores de referencia a los que se les hace un control
peridico.

Control del tto: valorar la eficacia de determinados frmacos segn sus niveles en sangre, su
toxicidad, efectos secundarios, etc.

Prevencin de enfermedades: se establecen seales de alarma que suelen preceder a los signos y
sntomas clnicos; tambin los programas de deteccin precoz de enfermedades como la diabetes,
la fenilcetonuria etc.

Investigacin de enfermedades: imprescindibles!

Los conceptos de salud y de enfermedad son relativos; por ello los datos clnicos han de interpretarse
comparndolos con unos que se toman de referencia.
En este proceso de interpretacin clnica por comparacin se puede actuar de forma ms o menos
formalizada; algunos diagnsticos pueden hacerse de manera intuitiva, basndose en la experiencia clnica,
pero generalmente se recurre al uso razonado de los avances de la tecnologa sanitaria.
Para los anlisis clnicos es muy importante disponer de valores de referencia para cada prueba bioqumica
que se solicita. Antes se utilizaba el trmino valores normales y actualmente usamos el de valores de
referencia, de los que existen dos tipos:
1.
2.

Basados en un individuo: son datos previos del mismo individuo obtenidos cuando se encontraba en un
determinado estado de salud y que sirven para valorar la evolucin de ese paciente.
Basados en una poblacin: se obtienen por procedimientos estadsticos a partir de una poblacin de
sujetos bien definidos (edad, sexo, estado de salud establecido mediante determinados criterios, etc).

Estos son los valores a los que se alude en las tcnicas de laboratorio como ndices de intervalo en el que se
considera que los individuos son saludables con respecto a ese dato clnico.

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El futuro de la bioqumica clnica pasa por:

Disminucin de la demanda de anlisis generales y aumento de los especficos.

Aumento de los programas de deteccin precoz de enfermedades, sobre todo en el recin nacido.

Aumento de la automatizacin de los laboratorios.

Aumento de las analticas a la cabecera del enfermo con el avance de la llamada qumica seca
mediante el uso de tiras reactivas.
Es importante que el TEL realice su trabajo con:
Ciencia: para la comprensin suficiente del trabajo y su disciplina, es necesario formacin tericoprctica.
Conciencia: los tubos son pacientes y de un resultado puede depender su salud.
Paciencia: ser meticulosos y crticos con el mtodo clnico.
Instrumentacin: desarrollando un conocimiento bsico de aparatos e instrumentos cada vez ms
sofisticados acortando el tiempo y aumentando la sensibilidad.
2. ETAPAS DE UN ANLISIS BIOQUMICO.
Repasar los apuntes de MBH; aquello de peticin de pruebas y su documentacin, la extraccin de sangre,
los colores de los tubos, la toma de muestras de orina, etc.
3. TCNICAS Y MTODOS DE ANLISIS BIOQUMICOS.
En el laboratorio clnico se realizan diferentes tipos de anlisis en diferentes muestras biolgicas para
detectar la presencia de determinadas sustancias (llamadas analitos) y establecer siempre que sea posible su
cuantificacin; como los resultados se aplican a un paciente han de ser estudiados antes de implantar un
determinado mtodo, para tener la garanta de que los datos que proporciona son fiables.
Cules son esos mtodos y sus caractersticas?
3.1. Por el tipo de medida que realizan:
a) Mtodos cualitativos: slo detectan la presencia o no del analito; por ej: sangre oculta en heces.
b) Mtodos semicuantitativos: indican el rango aproximado de concentracin del analito; ej: tiras reactivas
de orina que utilizan una escala de color.
c) Mtodos cuantitativos: expresan la concentracin del analito en la muestra, con > < exactitud ; ej:
determinacin de glucosa en suero.
3.2. Por el procedimiento Fsico-Qumico que utilizan:
Unas emplean mtodos mas o menos mecnicos para separar sustancias y otras utilizan procesos de
anlisis mas especficos:
a) M. mecnicos: algunos de ellos son:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Filtracin, ultrafiltracin y dilisis: dependen de la exclusin por el tamao a travs de los poros de
determinadas membranas.
Centrifugacin y ultracentrifugacin, flotacin y decantacin: se separan las sustancias segn el
tamao, la masa, la densidad.
Destilacin: separa por evaporacin.
Electroforesis: las partculas segn su carga elctrica y su masa, emigran cuando son sometidas a
un campo elctrico.
Cromatografa: los componentes de la muestra, son separados entre dos fases.
Extraccin con disolventes, etc.

b) Tcnicas pticas: detectan la radiacin lumnica y entre ellas estn las de uso ms comn:
1. Espectroscopia de absorcin: se usa para Ca, Mg, Zn, Cu, Pb y otros metales y se basa en la
absorcin de luz por lo que la radiacin emitida ser de < intensidad que la inicial y % a la
concentracin de la sustancia en la muestra.

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Dentro

de ella tenemos:
E. de absorcin molecular UV-V e IR, segn la zona del espectro de REM en la que trabaje.
E. de absorcin atmica.
Resonancia magntica Nuclear: se coloca la muestra en un campo magntico externo y se
irradia con determinada radiofrecuencia; parte de los ncleos de E inferior la absorben; el
aparato de Resonancia magntica Nuclear detecta esta absorcin de E.
Etc.

2. Espectrofotometra o espectroscopia de emisin: cuando un tomo es excitado por una fuente de

energa, sus electrones pueden alcanzar niveles orbitales de energa mayor; cuando el electrn vuelve a
su estado de reposo emite una REM.
Dentro de ella tenemos:

Espectroscopia de emisin atmica o fotometra de llama: determina Na, K y Li en lquidos

biolgicos; se basa en la emisin de luz; cuando se ponen en contacto con la energa calorfica
de una llama cada elemento de una muestra, desprende una luz con una longitud de onda
diferente, tpica de cada uno, y con una intensidad luminosa directamente proporcional al n de
tomos, lo que es proporcional a la concentracin en la muestra.

Espectroscopia de fluorescencia o fluorimetra: la fluorescencia es la capacidad que tienen las

sustancias de emitir una luz visible cuando se las iluminan con radiacin UV; una molcula
absorbe luz de una determinada longitud de onda (energa) y emite luz de una longitud de
onda superior (< E); la intensidad de la radiacin es % a la cantidad absorbida que a su vez es
% a la cantidad de molculas que absorben.

Quimioluminiscencia: emisin de luz de diferentes sustancias al oxidarse; no precisan aporte

externo de luz.

Espectroscopia de fosforescencia o fosforimetra, espectroscopia de rayos X,

etc.
3. Espectrofotometra de dispersin: son principalmente dos tcnicas que se basan en el hecho de que
cuando un haz d luz choca con una partcula en suspensin, parte de la luz es dispersada, parte
reflejada, parte absorbida y parte transmitida.
Distinguimos:

Turbidimetra: disminucin de la intensidad de un haz de luz incidente cuando pasa a travs de

una suspensin de partculas; se usa sobre todo para la determinacin de proteinas en orina.

Nefelometra: medida de la luz dispersada en ngulos diferentes al de incidencia; uso principal

es en determinacin de protenas especficas.
4. Espectroscopia de reflexin o reflexometra: es la llamada qumica seca.
5.

de refraccin o refractrometra.
6.

de difraccin: difraccin de Rayos X etc.

c)

Tcnicas imnuno-qumicas: siempre sobre la base de una reaccin Ag-Ac.

Detectan seales de color, de radioactividad, etc.
Las ms importantes son : RIA, EIA, Inmunofluorescencia, inmunonefelometra etc.

d) Mtodos trmicos: como la osmometra, que detecta cambios en el punto de congelacin de una
solucin.
e) Tcnicas electroqumicas: detectan seales elctricas, como la Potenciometra, Conductimetra, etc.
f)

Tcnicas de Biologa molecular: basadas en:

- tcnicas de hibridacin de bandas de ADN, por ejemplo
- tcnicas de amplificacin, mediante PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa).

3.3. Por el uso al que se destinan:

a) Mtodos definitivos: se usan para calibrar materiales; tienen un error sistemtico muy bajo (gran
exactitud) y alta precisin.
b) Mtodos de referencia: son realizados por personal altamente cualificado en laboratorios clnicos o
industriales y con materiales calibrados para obtener valores estndar con los que comparar resultados
obtenidos con otros mtodos.
c) Mtodos de eleccin: son los que utiliza un laboratorio determinado para su trabajo de rutina.

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4. CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIO:

4.1. Conceptos relacionados con el Control de Calidad.
Se entiende por Control de Calidad a un conjunto de medidas sistemticas encaminadas a observar y a
conservar la fiabilidad de un mtodo analtico. Esto incluye una deteccin de los errores cometidos y una
prevencin de la aparicin de los mismos; su objetivo principal, es asegurar que los valores obtenidos con un
determinado mtodo, presentan una adecuada exactitud y precisin y que por tanto, son cientficamente
vlidos.
Algunos conceptos relacionados con el mismo son:
1.

Exactitud: es el grado de concordancia entre el valor de concentracin de la sustancia problema, que se

ha determinado con una tcnica analtica, y el valor real (el obtenido con una tcnica de referencia) de esa
concentracin.
Puede calcularse mediante la siguiente frmula:
E %= V VR / VR

. 100

E %= Exactitud en %; V= el valor q yo obtengo; VR= Valor real. A + cerca d 0 + exacta.

Suele aceptarse una E % < 10% para sustancias no enzimticas y < 20% para las enzimticas; de todos
modos en los protocolos, vienen indicados dichos lmites.
Cuando la inexactitud es constante y de similar cuanta, se conoce como sesgo.
2.

Precisin: es el grado de dispersin encontrado entre los valores obtenidos al repetir una misma
determinacin sobre la misma muestra; en el laboratorio clnico se usa ms el trmino contrario, es decir,
imprecisin, que se define como la variabilidad que se obtiene al repetir las medidas de una muestra.
Para calcularla se utiliza principalmente el Coeficiente de Variacin.
CV = DE / X x 100 de unas 20 o 30 determinaciones de la misma muestra y que no debe ser > del 5%.

3.

Sensibilidad: es la capacidad para diferenciar dos seales muy parecidas del mismo analito; tambin se
define como la capacidad de un mtodo para producir un cambio en la seal ante un cambio definido de la
cantidad.
No slo depende de la tcnica sino del equipo instrumental, del tipo de analito y de la muestra.
Relacionado con este concepto:
Lmite de deteccin: es la ms pequea concentracin de analito que puede ser detectada por un
mtodo.
Lmite de cuantificacin: es el resultado ms pequeo que puede diferenciarse del blanco.
Sensibilidad tambin es la capacidad que tiene un mtodo analtico para detectar el analito (o sea, dar
un resultado positivo verdadero) en todas las muestras que realmente lo contengan.

4.

Especificidad o Selectividad: es la capacidad de un mtodo para determinar exclusivamente el analito

en cuestin sin reaccionar con otras sustancias similares que se pueden encontrar en la mezcla; por ej, un
mtodo para determinar glucosa, ser especfico si solo determina glucosa aunque en la muestra se
encuentren otras hexosas.
Las tcnicas inmunoqumicas, son las ms especficas, siempre y cuando el Ac no de reacciones cruzadas
apreciables con molculas parecidas.
La especificidad analtica puede verse afectada por sustancias que se encuentran normalmente en suero o
plasma, como bilirrubina, Hb, lpidos etc que pueden interferir por su color, turbidez o por sus
caractersticas fisico-qumicas.

5.

Rango analtico o linealidad: es el valor mximo de la concentracin de un analito para el que la seal
registrada por el aparato y la concentracin son directamente proporcionales; es el rango de concentracin
de las muestras sobre el que se puede aplicar el mtodo, sin tener que hacer ninguna modificacin.
Para determinar el rango, se analizan una serie de muestras, normalmente patrones de varias
concentraciones y determinamos la curva de calibracin correspondiente.

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El ICA o intervalo de concentracin aplicable o intervalo de medicin, es el intervalo de valores en el que el

procedimiento de medida se aplica sin modificaciones y est comprendido entre el Lmite de deteccin o
cuantificacin y el Lmite de Linealidad.
6.

Medidas del blanco: son seales o lecturas (cantidad de absorbancia) observadas durante el proceso de
medida del analito, que se deben al reactivo o a los componentes de la muestra que se est observando,
pero no al analito.
Pueden obtenerse experimentalmente midiendo lo siguiente:
Un blanco de reactivo: es decir, los reactivos sin la muestra y hacemos una lectura inicial.
Un blanco de muestra: la lectura inicial se hace con el suero diludo en la misma % que se le va a
echar al reactivo, en un solvente inerte con el que no reaccione (es ms complicado).
En espectrofotometra UV-V estas medidas pueden anularse utilizando los blancos para calibrar la
absorbancia a valor cero, o utilizndolos en un sistema de doble haz.
Como es de esperar, cuanto ms bajos sean los valores del blanco de un mtodo, mejor ser la exactitud y
la precisin que se obtienen con ese mtodo.
Es importante que el TEL tenga en cuenta la magnitud de las medidas del blanco ya que stas contribuyen
al error total del proceso de medida.

7.

Interferencias: son el efecto producido por uno o ms compuestos sobre un analito, alterando la
exactitud de su medida.

4.2. Lquidos de referencia:

Concepto:
Son aquellas soluciones que contribuyen a asegurar la calidad de un procedimiento analtico;
pueden presentarse de forma lquida o liofilizado (ha de reconstituirse).
Los lquidos de referencia suelen tener las siguientes funciones:
1. Calibrar los instrumentos de medida.
2. Obtener resultados analticos, como las curvas de calibracin, sobre las que extrapolar nuestros
resultados.
3. Demostrar y controlar la fiabilidad d los resultados obtenidos en el lab, por ej, al ser analizadas junto
con las muestras.
4. Evaluar la validez de los procedimientos de medida.
Adems deben poseer las siguientes caractersticas:
1. Homogeneidad: ha de tener una composicin uniforme dentro de todo el envase que lo contiene y en
todos los envases que componen un lote.
2. Estabilidad: el/los analito/s que contienen deben mantener sus valores de concentracin estables
cuando stos se almacenan en condiciones adecuadas durante el tiempo especificado por el fabricante.
3. Reactividad: ha de contener los analitos que se pretenden evaluar y a la concentracin adecuada al
empleo que se le va a dar a tal lquido.
4. Conmutabilidad: los analitos que contienen deben comportarse de manera similar a los contenidos en
las muestras.

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Los lquidos de referencia puede ser destinados a diferentes usos:

1.

Como patrn o estndar: se usa para obtener resultados analticos ya que contiene el analito a una
concentracin conocida; se usa sobre todo en las determinaciones espectrofotomtricas a punto final,
para calcular la concentracin de los analitos en las muestras, por comparacin de las diferentes
absorbancias obtenidas en stas y en el estndar.
Tambin se pueden utilizar varios patrones, que contienen el analito a diferentes concentraciones de
valor conocido, para construir curvas patrn que sirvan posteriormente para interpolar los valores de
absorbancia medidos en las muestras y determinar las concentraciones que les corresponden.

2.

Como calibrador: se emplea para ajustar los resultados proporcionados por los aparatos de medida a
los que tericamente debieran dar, segn la informacin facilitada por el laboratorio comercial que
prepara el calibrador utilizado; esta calibracin debe hacerse diariamente y antes de comenzar las
determinaciones de las muestras.

3.

Como control: es un lquido biolgico (suero, plasma o sangre total) procesado por un laboratorio
comercial y del que se conocen las concentraciones de cada uno de los analitos que contiene; puede ser
normal si contiene los analitos a unas concentraciones fisiolgicas, o patolgico si estn por encima
o por debajo de lo que se considera fisiolgico.
El control puede ser utilizado para las siguientes funciones:
Evaluar la validez de un procedimiento de medida.
Validar los resultados obtenidos en el control de calidad interno del laboratorio; para ello se
introducen junto con las muestras y se procesan igual que stas; as verificamos los resultados,
ya que si los ofrecidos por el control son precisos y exactos, los de las muestras procesadas con
l, tambin.
Estudiar comparativamente los resultados obtenidos en el control de Calidad externo en
diferentes laboratorios.
Los criterios para la eleccin de la muestra control son:
a.

b.
c.

d.

Las muestras control deben ser semejantes a las muestras de los pacientes (muestras
problema). Si vamos a utilizar un mtodo en suero, el control debe ser lo mas semejante al
suero posible (suero humano o animal liofilizados o preparados artificiales de proteinas), si se
va a analizar Hemoglobina, el control debe ser sangre total, etc.
Actualmente los controles se compran en el mercado a empresas que los fabrican a partir de
grandes cantidades de suero; suelen venir de forma liofilizada, lo que alarga su periodo de
caducidad, aunque existe alguna presentacin en forma lquida.
Deben utilizarse por lo menos dos sueros para el control de cada analito, uno dentro de los
valores de referencia (Control normal) y otro fuera de estos valores (Control patolgico); por lo
general un 20% de las muestras procesadas son controles.
Es conveniente contar con cantidad suficiente del mismo lote de controles para
aproximadamente 1 ao; las mediciones al inicio de cada lote se hacen estableciendo los
rangos blanco o estadsticos de referencia con los que se hacen las grficas de control; se
analizan durante 1 mes (1 vez al da o 1 vez por turno) y se establece la media y la desviacin
estndar y se elabora una grfica base sobre la que se anotarn los resultados del resto del
ao.
Deben estar fraccionados para su uso diario, en alcuotas en tubos Eppendorf o similares.

Clasificacin de muestra control: Dependiendo del conocimiento que el analista tenga de la muestra
control, los controles se clasifican en:
a.
b.
c.

Ciegos: cuando la muestra control pasa completamente desapercibida para el analista, quien no
conoce la muestra control ni sabe el valor de los constituyentes de la misma.
Semiciegos: conoce la muestra control, pero no sus valores.
Abiertos: conoce el control y sus valores.

Con estos controles el laboratorio puede validar sus resultados para un parmetro, una tcnica y
unas condiciones analticas concretas al demostrar, que si el anlisis de la muestra control da lugar
a resultados exactos y precisos, las concentraciones de las muestras problema, realizadas en las
mismas condiciones, tambin sern reales.

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4.

Pool: consiste en la mezcla de diversos sueros o plasmas, realizada en el propio laboratorio analtico;
los valores son desconocidos, pero se aproximan a los que se consideran normales; es el lquido de
referencia mas parecido a las muestras.

4.3. Grficas de control:

Para hacer el seguimiento de la precisin en el laboratorio de Qumica Clnica se utilizan
fundamentalmente procedimientos estadsticos que se reflejan en varios tipos de grficas: de Levey-Jennings,
de Youden .
1. Grfica de Levey-Jennings: consiste en una curva de distribucin normal dibujada de lado, en la que
se marcan puntos especficos correspondientes a los valores de la media ms y menos una, dos y tres
desviaciones estndar, que se prolongan hacia la derecha formando la grfica en la que se representarn
ms tarde los valores obtenidos cada da para el control
Cuando se utilizan estas grficas para el control de calidad, hay que preparar una para cada control de
cada parmetro bioqumico.

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En una hoja de papel milimetrado, dispuesta de forma apaisada, se traza un eje de coordenadas,
de manera que en el eje de ordenadas se sitan los valores de concentracin del analito (muestras
cobtrol) y en abscisas los das correspondientes al periodo de seguimiento.
La escala de unidades de concentracin se traza de manera que queden dentro del ancho del papel
los valores comprendidos entre la media (que se sita en el centro de la hoja) y cuatro desviaciones
estndar por arriba y por debajo del valor de la media. Se marcan los trazos correspondientes a los
valores de la media, en lnea contnua, y 1DE, 2DE, 3DF, -1DE, -2DE y -3DE, en lneas discontnuas.
Una vez que se ha preparado la grfica, se anota el resultado del control diario y se aplican los
criterios que haya adoptado el laboratorio para aceptar o rechazar los resultados del anlisis.
2. Grfica de Youden: es el resultado de superponer dos grficas de Levey-Jennings de forma
perpendicular entre s.
En este tipo de grficas se pueden reflejar los valores de dos controles de diferente
concentracin de un mismo analito, utilizando, por ejemplo, el grfico horizontal para valores
clnicamente normales y el vertical para valores patolgicos.

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Cuando se establece en un laboratorio clnico un programa de control de calidad, lo que se pretende

es tener un instrumento que haga posible tomar decisiones inmediatas con respecto a la validez de los
resultados obtenidos para las muestras de los pacientes, basndose en la observacin de que los valores del
control permanecen dentro de unos lmites previamente establecidos. Si el valor del control se encuentra dentro
de esos lmites, se supone que los resultados de las muestras de los pacientes que se analizaron en el mismo
lote que ste, son valores correctos.
El lmite que se acepta con ms frecuencia es que los valores del control han de encontrarse
comprendidos dentro del intervalo de confianza del 95,5%, es decir, estos valores han de ser prcticamente
iguales al 95,5 % de los datos obtenidos con el control durante el periodo en el que se estableci el valor
medio.
De acuerdo con este criterio se considera que un valor de control es aceptable si se encuentra dentro del
rea comprendida entre la media y 2DE en la grfica de LeveyJennings, o en la de Youden. Si un valor del
control no cumple esta condicin, los resultados de los anlisis del lote no se aceptan.
Aunque las grficas de Levey-Jennings son fciles de interpretar y proporcionan una buena
representacin visual de la precisin, tienen el inconveniente de que se necesita mucho tiempo para anotar
todos los resultados da a da en ellas, ya que son necesarias dos o tres para cada parmetro bioqumico (una
por control).
Modificaciones frecuentes en los grficos de control:
9

Dispersin: cuando los errores aleatorios o la imprecisin aumentan

Tendencia: es la desviacin sistemtica de los valores observados cuando el mtodo analtico

sufre un problema en desarrollo progresivo.

Desviacin: es una modificacin abrupta o brusca con respecto al valor medio establecido.

Para hacer de forma ms prctica la toma de decisiones, se han ideado otras alternativas. La ms
utilizada es el sistema de reglas mltiples de Westgard:
1: 3 SD una observacin supera la media el lmite de 3SD
2: 2 SD dos observaciones consecutivas superan la misma media 2SD
R: 4 SD dos observaciones consecutivas se diferencian ms de 4SD
4: 1 SD cuatro observaciones consecutivas superan la media 1SD
10: MEDIA diez observaciones consecutivas caen a un mismo lado de la media.
Las reglas 1:3SD y R: 4SD generalmente sugieren un error aleatorio. Las reglas 2:2SD, 4:1SD y 10:
MEDIA suele ser un error sistemtico.

4.4. Protocolo de bsqueda de errores.

Hasta en los laboratorios ms experimentados y capacitados se producen en ocasiones, situaciones en las
que los resultados de los controles se encuentran fuera de los lmites permitidos. En estos casos lo importante
es averiguar las causas y resolverlas rpidamente, por lo que si se tiene establecido un protocolo de bsqueda
de errores la tarea se facilita considerablemente.
A continuacin, de forma esquemtica y sin pretensiones de haber abarcado todas las situaciones posibles
se indica un ejemplo de cmo se puede establecer una pauta a seguir en estas situaciones que en la prctica,
no resultan nada fciles de investigar. El ejemplo se centra en la preparacin y desarrollo
tcnicas
espectrofotomtricas U V V:
1. Bsqueda de errores en la preparacin del anlisis:
1.1. Reactivos:
en la conservacin:
9 se ha sobrepasado la fecha de caducidad o la estabilidad?
9 se han guardado hermticamente cerrados, en ausencia de luz y a la temperatura
adecuada?
9 si no se est seguro de que todo esto se ha hecho bien, desechar el kit y coger uno nuevo.

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en
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9
9
9
9

el tratamiento:
se ha utilizado agua de calidad apropiada para su preparacin?
los reactivos preparados han pasado x material volumtrico sucio?
se han diluido con la cantidad correcta de diluyente?
dejan residuo slido?
se han disuelto sin prdida de sustancia?

1.2. Controles:
en la conservacin: lo mismo que en los reactivos.
en el tratamiento:
9 se ha utilizado agua de calidad apropiada para su preparacin?
9 se han disuelto con la cantidad adecuada de agua?
9 se han disuelto sin prdida de sustancia?
9 se ha esperado el tiempo de reactivacin antes de usarlos?
9 se han congelado correctamente las fracciones?
9 se han congelado y descongelado reiteradamente?
9 se ha evitado la formacin de espuma?
2. Bsqueda de errores en la realizacin del anlisis:
2.1. Uso de pipetas:
se han utilizado pipetas sucias o desportilladas?
se han utilizado pipetas demasiado grandes para volmenes muy pequeos? (por ej, pipetas
de 5 ml para medir 500 microlitros)
se han utilizado pipetas hmedas?
era correcto el nivel del menisco observado a la altura de los ojos?
se han vaciado o llenado demasiado deprisa las pipetas automticas?
se ha ajustado correctamente el volumen en los dosificadores?
2.2. Temperatura y tiempo.
se han atemperado suficientemente los reactivos, controles y muestras?
se ha colocado correctamente la temperatura en el bao mara?
se ha tenido en cuenta que las cubetas de plstico necesitan ms tiempo para atemperarse
que las de vidrio?
se ha medido bien el tiempo de incubacin?
2.3. Fotmetro:
se ha ajustado bien el cero?
ha estado la lmpara encendida el tiempo suficiente?
ha habido fallos en el suministro de corriente elctrica?
ha entrado luz en el compartimento de pruebas?
ha envejecido la lmpara?
hace mucho tiempo que no ha sido revisado por el servicio tcnico?
2.4. Cubetas:
se han utilizado cubetas sucias o rayadas?
se han situado por los lados correctos en el paso de luz?
han estado hmedas por fuera?
han estado suficientemente llenas?
haba burbujitas en la cubeta?
2.5. Clculos:
se han hecho correctamente las operaciones con decimales?
se ha utilizado correctamente el factor?
se ha tenido en cuenta la dilucin?
se ha calculado en las unidades adecuadas?
se ha tenido en cuenta el blanco de reactivo o de prueba?
En ocasiones, aunque los controles dan resultados correctos, el valor encontrado para la muestra de un
paciente es incomprensible. Las causas suelen estar fuera del propio laboratorio, pero es a ste al que le
corresponde establecer relaciones con los dems servicios del hospital o de la institucin sanitaria en la que se
encuentra ubicado, de manera que se puedan organizar programas conjuntos de garanta de calidad que
aseguren que la obtencin, traslado, conservacin y preparacin de las muestras se han hecho correctamente.

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4.5. Validacin de resultados:

Consiste en la revisin global de los resultados encaminada a comprobar que el sistema analtico est bajo control y
que los resultados obtenidos con l, son coherentes o congruentes con las caractersticas clnicas del paciente.
Para realizarla:
1 se ha constatado que el control interno de la calidad y la validacin tcnica no ha detectado anomalas analticas y esto
se hace en base a los intervalos de decisin fijados para cada analito y en:
Informacin acerca del paciente: se conoce su procedencia (Atencin Primaria o Atencin Especializada), su
diagnstico y sus datos de filiacin, as como si hubo incidencias en la toma de la muestra.
Informacin acerca de la muestra: el TEL revisa la muestra antes de introducirla en el analizador y conoce los
ndices sricos y por tanto el grado de ictericia, hemlisis o lipemia de la muestra.
Informacin acerca del mtodo: diariamente se calibran los aparatos al comienzo de la jornada estableciendo
el control de calidad analtico para todos los componentes.
2 se procede a la revisin de todos los informes de resultados que realiza el facultativo responsable del laboratorio,
mediante un programa informtico; se clasifican en tres grupos:
Grupo I: informes estrictamente normales: todos los resultados de los parmetros estudiados estn
comprendidos en los lmites considerados normales y, adems, corresponden a sujetos que no padecen una
enfermedad conocida que pueda alterar estos parmetros.
Grupo II: informes anormales pero coherentes: los resultados estn fuera de los lmites normales pero son
coherentes con el estado de salud del paciente.
Grupo III: informes incoherentes: contienen resultados que por alguna razn no parecen tener conexin con
el estado de salud del paciente.
Terminado el proceso, el informe es enviado al peticionario.

5. AUTOANALIZADORES.
5.1. Antecedentes histricos
La Qumica Clnica hospitalaria inici un cambio hacia principios de los aos 60 por dos motivos
fundamentales:
-

La mecanizacin de las determinaciones

La produccin industrial de los reactivos

El primer autoanalizador se utiliz en los aos 50 y era un autoanalizador de flujo continuo para la
determinacin de Glucosa y Nitrgeno Ureico.
5.2.

Concepto de automatizacin

Se aplica a aquellos procesos donde el instrumento lleva a cabo una serie de test con un mnimo de
intervencin de los tcnicos. En el LDC los aparatos son regulados por los operarios, por lo tanto, se debera
hablar se mecanizacin y no de automatizacin.
El analizador automtico es un aparato que mecaniza las diferentes etapas del anlisis de la muestra.
Las ventajas del autoanalizador son:

5.3.

Elimina el factor humano en etapas repetitivas y delicadas del anlisis

Aumenta la precisin y la exactitud de los resultados.
Son de coste alto pero se compensa con el ahorro de personal y reactivos.
Etapas del anlisis de una muestra

Identificacin de la muestra
Preparacin de la muestra
Sistemas de carga de la muestra
Sistemas de dispensacin de la muestra
Reactivos y sistema de dispensacin de los reactivos
Sistema de mezcla de reactivos y muestra

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TEMA 1. INTRODUCCION A LA BIOQUMICA.

Sistema de incubacin
Cubetas de reaccin
Sistema de deteccin
Proceso de datos

1. Identificacin de la muestra: hay dos sistemas:

Directo: La muestra se une a unos identificadores que permiten asociarla con el paciente en
cualquier momento. Los identificadores ms comunes son los cdigos de barras, que permiten el
marcado electrnico de la muestra. Las etiquetas con el cdigo de barras se adhieren al tubo de
extraccin y tambin a los recipientes donde se coloca la muestra para el anlisis.
El problema de la identificacin es el de la separacin del suero en alcuotas, lo que requiere volver a
marcar los tubos (ms errores). Esto se puede solucionar utilizando el llamado tubo primario, que
consiste en realizar el proceso analtico a la muestra en el mismo tubo de la extraccin.

Indirecto: La muestra se relaciona con la posicin que ocupa en una secuencia analtica segn
indicar una lista de trabajo previamente realizada.

2. Preparacin de la muestra
La muestra ms frecuentemente utilizada es el suero, pero tambin se usan plasma, sangre total,
lquido cefalorraqudeo, orina y otros lquidos biolgicos (Ej. Sinovial).
Todas ellas, menos la sangre total, deben ser manipuladas previamente mediante diluciones,
centrifugacin, etc. Es importante en la obtencin del suero que la coagulacin sea completa y la
centrifugacin la adecuada para que no quede fibrina, que obstruye los sistemas de toma de muestra.

3. Sistemas de carga de la muestra:

Se suelen utilizar copas de plstico desechable, cuya forma y tamao depende del tipo del analizador.
Se deben fabricar en material inerte, que no absorba ni desprenda ninguna sustancia. Se debe evitar la
luz directa sobre las cubetas de carga porque pueden afectar a productos fotosensibles (Ej. Bilirrubina).
Se pueden colocar en gradillas, en bandejas circulantes o en cadenas transportadoras.
Actualmente es muy frecuente que se utilice el tubo primario en lugar de las copas de plstico.
Existen dos tipos de carga de muestra:
Se cargan las muestras en un dispositivo que se cambia cuando se han tomado todas las muestras.
Se cambian continuamente los contenedores de las muestras, a medida que se van tomando.
4. Sistemas de dispensacin de muestra
De Flujo Continuo: La muestra, impulsada por una bomba peristltica, es aspirada por una aguja hacia
una corriente continua de reactivo. La proporcin resultante entre muestra y reactivo viene dada
por la velocidad de flujo. La cantidad de muestra depende del dimetro interno del tubo.
Analizadores Discretos: La muestra es aspirada a travs de una aguja llamada jeringa de
desplazamiento lquido positivo y es colocada en una cubeta de reaccin, junto con el reactivo. Las
jeringas pueden ser de un volumen fijo o variable, dependiendo del autoanalizador. Si realizan poca
variedad de pruebas se podrn usar de volumen fijo, pero si tienen mltiples determinaciones
distintas, han de ser de volumen variable.

5. Sistemas de dispensacin de reactivos

Tipos de Reactivos:
-

Reactivos lquidos de reserva: Son los ms empleados. Son reactivos en estado lquido que se
adquieren de esta forma o en forma de polvos que se reconstituyen con agua o con buffers
(tampones). Se manejan en contenedores de vidrio o plstico. El volumen del contenedor
depende de la estabilidad del reactivo y de la capacidad de trabajo del autoanalizador.

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Reactivos de unidad: Se utilizan para una sola

autoanalizadores nuevos y son mucho ms caros.

determinacin.

Se

utilizan

ms

en

Dispensacin: Cada prueba utiliza 1 2 reactivos, aunque algunas permiten el uso de 3 ms. Se
pueden dispensar de forma continua discreta, igual que la muestra.
6. Sistemas de mezcla de reactivos y muestra
-

Analizadores de flujo continuo: Los reactivos y las muestras se mezclan por intersecciones en Y de
los tubos transportadores. Una vez en el mismo tubo se mezclan por accin del flujo.

Analizadores discretos: La mezcla tiene lugar en las cubetas de reaccin. El mezclado se puede
hacer por distintos mecanismos:
o
o
o
o

Por movimientos rotatorios de los contenedores

Por inyeccin de aire a presin
Mediante agitadores magnticos
Agitadores de barra, etc.

Analizadores centrfugos: La mezcla se lleva a cabo por accin de la fuerza centrfuga del
rotor.

Analizadores de qumica seca: La mezcla se produce por la difusin de la muestra a travs

de los reactivos.

7. Sistemas de incubacin
La incubacin pretende que la reaccin tenga lugar en un determinado tiempo y a una determinada
temperatura.
- Flujo continuo: Los tubos en los que transcurre la reaccin estn inmersos en unos bloques de
termostatizacin cuya temperatura se regula por la longitud del tubo y la velocidad del flujo.
- Discretos: La temperatura se puede alcanzar por baos de agua aire caliente a temperatura
controlada. En estos baos se encuentran introducidas las cubetas de reaccin.
- Centrfugos: Los rotores con las cubetas se reaccin se encuentran inmersos en baos de aire caliente.
- Qumica seca: Las tiras de reaccin se encuentran en contacto con superficies metlicas calientes.

8. Cubetas de reaccin y lectura

-

Flujo continuo: La reaccin se produce en los tubos y la lectura se produce en las cubetas de lectura o de
flujo. Por estas cubetas van pasando las soluciones para ser ledas.

Discretos: Las cubetas de reaccin pueden ser desechables o reutilizables. La lectura se realiza en las
mismas cubetas de reaccin.

9. Sistemas de deteccin
El sistema de deteccin ms frecuente es la espectrofotometra de absorcin. Tambin se pueden usar
medidas nefelomtricas y turbidimtricas, medidas de fluorescencia, electroqumica, qumica seca
(reflexin electroqumica), etc.

10. Procesamiento de datos

El detector crea una seal analgica que se transforma despus en digital. Transforma los datos
digitales en resultados que luego se imprimen.

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5.4. Tipos de autoanalizadotes:

Hay que definir una serie de conceptos para despus conocer los distintos tipos de autoanalizadores que
hay:
REPERTORIO DE PRUEBAS: Son las pruebas que puede llevar a cabo un autoanalizador. Hay que
distinguir entre:
-

Nmero de pruebas totales que el autoanalizador puede realizar.

Nmero de pruebas que puede realizar de forma inmediata, es decir, pruebas programadas en una
serie tanda de anlisis sin necesidad de cambiar reactivos ni otras condiciones del aparato.

TIEMPO DE RETARDO: Es el tiempo mnimo requerido para obtener un resultado despus del
procesamiento inicial de la muestra. Depende de la determinacin solicitada y del nmero de
determinaciones.
CAPACIDAD: Es el nmero de determinaciones que se pueden procesar en 1 hora. Depender del tiempo
de retardo.

Los tipos de Autoanalizadotes son:

Analizadores Selectivos: Tambin se llaman analizadores de acceso al azar. Pueden seleccionar para
cada paciente las pruebas que se deseen del repertorio total sin tener que ejecutar en una muestra
todas las determinaciones.

Analizadores Discretos: Cada muestra es transportada en contenedores individuales. Los reactivos se

adicionan discontinuamente por medio de dispensadores y utilizan para dispensar las muestras
jeringas de desplazamiento lquido positivo. Hay tres tipos:

Analizadores monoclonales por lotes: Realizan una nica determinacin de forma simultnea
sobre varias muestras.

Analizadores monoclonales selectivos: Realiza varias pruebas distintas, seleccionables sobre

cada muestra, pero solo tienen un sistema de muestra y un solo canal de lectura
espectrofotomtrica.

Analizadores multicanales: Realizan varias determinaciones simultneas en una misma muestra.

Analizadores de Flujo Continuo: Son instrumentos que bombean continuamente reactivos a travs de
tuberas para formar una corriente de flujo, bombeando despus la muestra a esta corriente. Para ello
se utilizan bombas peristlticas. #

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TEMA 1. INTRODUCCION A LA BIOQUMICA.

TEMA 1. INTRODUCCIN A LA BIOQUMICA.

1. Concepto de Bioqumica Clnica.
2. Etapas de un Anlisis Bioqumico.
3. Tcnicas y mtodos de Anlisis Bioqumico.
4. Control de Calidad en el Laboratorio.
5. Automatizacin
_____________________________________________________________________
1. Concepto de Bioqumica Clnica:
Introduccin: aspectos generales que justifican la importancia y la esencia de la Bioqumica.
Concepto de Bioqumica Clnica en s, de su futuro y de la concienciacin del trabajo del tcnico.
2. Etapas de un anlisis bioqumico.
3. Tcnicas y mtodos de Anlisis Bioqumico.
3.1. Por el tipo de medida: cuali, cuanti o semi.
3.2. Por el procedimiento fsico qumico:
o Mtodos mecnicos: filtracin, centrifugacin, electroforesis, cromatografa, etc.
o Tcnicas pticas:

E de absorcin: Absorcin molecular (UV-V), Absorcin atmica, RMN, etc

Espectrofotometra de emisin: fotometra de llama, fluorescencia, fluorimetra,

etc.

E de dispersin: turbidimetra, nefelometra.

E de reflexin: QS.

E de refraccin o refractometra.

E de difraccin: con Rx, etc

o Tcnicas inmunoqumicas.
o Metodos trmicos.
o Tcnicas electroqumicas.
o Biologa Molecular.
3.3. Por el uso al que se destinan: mtodos definitivos, de referencia, de eleccin.
4. Control de Calidad en el Laboratorio.
Conceptos relacionados con el Control de Calidad:
exactitud
precisin
sensibilidad (lmites de deteccin y de cuantificacin)
especificidad
rango analtico o linealidad.
Medidas del blanco.
Interferencias.
Lquidos de referencia: concepto y funciones, caractersticas y usos (patrn, calibrador,
control y pool).
Grficas de control:
Levey-Jennings.
Youden.
Toma de decisiones.
Protocolos de bsqueda de errores.
Validacin de resultados.
5. Automatizacin en el Laboratorio:
5.1.
Antecedentes histricos.
5.2.
Conceptos: automatizacin y autoanalizador y ventajas
5.3.
Etapas del anlisis:
1. Identificacin de la muestra
6. Sistem. de mezcla de reactivos y muestra
2. Preparacin de la muestra
7. Sistema de incubacin
3. Sistemas de carga de la muestra
8. Cubetas de reaccin y lectura
4. Sistemas de dispensacin de la muestra
9. Sistemas de deteccin
5. Sistemas de dispensacin de los reactivos
10. Procesamientos de datos
5.4.

Tipos de autoanalizadotes: selectivos, discretos y de flujo continuo.

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