CONTROL DE CALIDAD EN INMUNOANLISIS

Q.F.B. Ricardo May Castillo.

Laboratorio Clnico es una especialidad que resulta indispensable en la medicina actual.

Tiene un papel esencial en el diagnstico y seguimiento de numerosas patologas.

Es responsabilidad del Laboratorio Clnico el garantizar la validez y la calidad de los resultados emitidos.

Minimizando la variabilidad errores derivados del anlisis.

los

Sistema para valorar la calidad de su trabajo

CONTROL DE CALIDAD

Se garantiza la calidad en los informes finales emitidos, controlando las condiciones de las distintas fases del proceso, preanaltica, analtica y postanaltica.

CONTROL DE CALIDAD

Control de calidad interno Control de calidad externo

Fase preanaltica
Es la etapa previa a la realizacin de un anlisis de laboratorio y esta sujeta a diversas fuentes de variabilidad.

1.- Variabilidad biolgica. 2.- Variabilidad debida a factores fisiolgicos del paciente. Tiene distintos orgenes 3.- Variabilidad debida a la extraccin de la muestra. 4.- Variabilidad debida a caractersticas de la muestra. Empleo de acciones preventivas y correctivas evita aquellos factores que puedan modificar las concentraciones de las hormonas a medir.

Fase preanaltica
Variabilidad biolgica Es la fluctuacin de una determinada magnitud alrededor de su punto de equilibrio homeosttico. Componente Aleatorio Componente Sistemtico Variaciones metablicas relacionadas con la homeostasis.

Variabilidad biolgica intraindividual

Debido fundamentalmente a los ritmos circadianos o a la edad.

2 niveles

Variabilidad biolgica interindividual

Los valores medios de las magnitudes de los individuos de una poblacin pueden ser diferentes entre s.

Fase preanaltica
El conocimiento de la variacin biolgica resulta imprescindible para la interpretacin correcta de los resultados de las pruebas de laboratorio.

Cuando la variacin biolgica intraindividual es mayor que la interindividual, los valores de referencia poblacionales son de utilidad.

Fase preanaltica
Variabilidad debida a factores fisiolgicos del paciente Debido al funcionamiento pulstil, rtmico y de rpida respuesta ante estmulos endgenos y exgenos. Edad y Sexo Diferente masa muscular y caractersticas sexuales. Estrs

Ejercicio fsico Aumento y modificacin de secreciones hormonales.

Ciclos biolgicos Variaciones circadianas.

Lugar de residencia y estacin Parmetros varan en funcin de la localizacin.

Embarazo Cambios metablicos efecto de dilucin.

Fase preanaltica
Variabilidad debida a factores fisiolgicos del paciente Administracin y consumo de drogas Alteran los niveles de hormonas sexuales en la mujer. Consumo de alcohol Inhibicin de la gluconeognesis.

Ingesta de alimentos

Fiebre Diferentes respuestas hormonales.

Consumo de caf y tabaco La cafena y la nicotina estimulan a la medula y a la corteza adrenal.

Fase preanaltica
Variabilidad debida a la extraccin de la muestra Es responsabilidad del laboratorio clnico el establecer una serie de normas y protocolos de extraccin. Tiempo de aplicacin del torniquete Dilatacin venosa y la trasvasacin de plasma.

Ayuno De 8 a 12 horas previo a la extraccin.

Pacientes con sueros teraputicos Se recomienda que la extraccin se realice en el brazo contrario al de la va intravenosa.

Fase preanaltica
Variabilidad debida a la extraccin de la muestra Efecto postural Las muestras deben obtenerse con el sujeto sentado evitando el efecto ortosttico.

Anticoagulantes y conservantes Debe utilizarse el anticoagulante adecuado. EDTA en forma de sal tripotsica y la heparina de litio.

En el momento de la extraccin cada muestra debe ser correctamente identificada y obtenida

Fase preanaltica
Variabilidad debida a caractersticas de la muestra Pueden dotar a la muestra de una serie de caractersticas que interfieren en el posterior procesamiento analtico

Hemlisis Lipemia Ictericia Alteraciones en las determinaciones hormonales.

Obturacin de autoanalizadores.

las

Fibrina sondas y

conductos

de

los

Fase preanaltica
Errores en la fase preanaltica. Transporte en condiciones inadecuadas.

Identificacin incorrecta de las muestras.

Alteraciones en el registro de datos.

Las demoras excesivas entre procesamiento de las muestras.

la

llegada

el

Fase analtica
Incluye al conjunto de operaciones relacionadas de forma directa con la realizacin de las mediciones de los analitos.

El inmunoanlisis es el mtodo de mayor difusin para realizar determinaciones hormonales.

El principio de los inmunoanlisis se basa en la reaccin de unin que tiene lugar entre la sustancia a determinar, que acta como antgeno, y un anticuerpo especfico contra dicha sustancia.

Fase analtica
Tcnicas de inmunoanlisis Todos requieren el uso de material marcado para medir la concentracin de antgeno o anticuerpo presente.

Los ejemplos de marcas incluyen un compuesto radioactivo, una enzima que hace que cambie el color de una solucin, o una sustancia que produzca luz. Efecto de la unin INMUNOANLISIS Heterogneos Homogneos Competitivos No competitivos

Disponibilidad del reactivo

Fase analtica
Inmunoanlisis homogneos No requieren la separacin de los complejos no unidos de los complejos unidos.

Reactivo de fase slida como una partcula magntica o una esfera plstica

Inmunoanlisis heterogneos Requieren la separacin de los complejos no unidos.

Fase analtica
Inmunoanlisis competitivos El analito del espcimen que se desea valorar, compite con un antgeno marcado por un nmero limitado de lugares de unin al anticuerpo.

Menor concentracin de antgeno marcado unido indica mayor concentracin de antgeno presente en la muestra.

Fase analtica
Inmunoanlisis no competitivos El analito cuyos niveles van a ser determinados es fijado por un nmero ilimitado de lugares de unin de anticuerpos, marcados y no marcados.

Los formatos de ensayo no competitivos proporcionan el nivel ms alto de sensibilidad y especificidad.

El marcaje que se obtiene en este tipo de ensayos es por tanto directamente proporcional a la concentracin de hormona del espcimen.

Fase analtica
Tcnicas de inmunoanlisis Radioinmunoanlisis (RIA) Utilizan istopos radioactivos como marca y la concentracin de radioactividad medida indica la concentracin de analito presente. Heterogneo no competitivo

Heterogneo competitivo Anlisis inmunorradiomtricos (IRMA) El analito cuya concentracin se quiere medir se une a 2 anticuerpos especficos, uno marcado radiactivamente y otro no marcado.

Debido a las complicaciones inherentes al manipuleo y desecho de los materiales radioactivos en el laboratorio clnico, ya no se emplea con frecuencia.

Fase analtica
Tcnicas de inmunoanlisis Enzimoinmunoanlisis (EIA) Emplean la capacidad cataltica de las enzimas como marcador inmunoqumico para la valoracin de la unin Ag-Ac.

Es realizada por tipos de mtodos.

dos

Mtodos de Punto Final Mtodos Cinticos

Homogneo Competitivo

Fase analtica
Enzimoinmunoanlisis (EIA)
Existen multitud de variantes del enzimoinmunoanlisis. Inmunoensayo por micropartcula (MEIA)

Utiliza el aislamiento de complejos Ag-Ac en una superficie de fase slida de pequeas esferas denominadas micropartculas. Homogneo Competitivo

Fase analtica
El fluoroinmunoanlisis (FIA) Se basan en la utilizacin de compuestos fluorescentes para el marcaje de los inmunocomplejos.

Inmunoensayo por Polarizacin de Fluorescencia (FPIA) Unin competitiva, el antgeno de una muestra y el reactivo marcado antgeno-fluorescena compiten por los puntos de unin en el anticuerpo Homogneo Competitivo

Fase analtica
Luminoinmunoanlisis Se basan en la utilizacin de sustancias luminiscentes como marcadores para detectar la formacin del complejo Ag-Ac. Ofrece alta sensibilidad y especificidad. Inmunoanlisis magntico quimioluminiscente (CMIA)

Micropartculas magnticas con Ac de captura en su superficie ligan el Ag a determinar y Ac marcados para el revelado de la reaccin.

Fase analtica
Electroquimioluminiscencia (ECL) La emisin de luz tiene lugar de la oxidacin del tris (bipiridil) de rutenio en la superficie de un electrodo, en presencia de tripropilamida, para formar especies de rutenio (II) excitadas, las cuales vuelven a su estado basal emitiendo luz a 620 nm.

Fase analtica
En la ECL estn implicadas 2 sustancias con actividad electroqumica: el complejo de rutenio y la tripropilamina (TPA).

El rutenio y la TPA y Ru(bpy)3 3+ reaccionan entre s, se forma un estado excitado por la transferencia de energa.

Este estado excitado es inestable y decae al estado original con la emisin de un fotn a 620 nm.

Fase analtica
En la Clula de medicin ECL se lleva a cabo la separacin del material fijado y no fijado.

Se aplica un voltaje al electrodo

Fase analtica
Funcionamiento del equipo y el mtodo Sensibilidad Expresa la capacidad de la tcnica para detectar pequeas concentraciones del analito.

Especificidad Expresa la capacidad de la tcnica para diferenciar el analito especifico de otros presentes.

Linealidad del mtodo Es el intervalo de concentracin en el que los resultados emitidos son fiables, y no requieren ningn tipo de modificacin.

Calibracin

Fase analtica
Funcionamiento del equipo y el mtodo Los calibradores son soluciones con valores conocidos que establecen la relacin entre la cantidad de seal producida en el ensayo y la concentracin de analito.

Al comparar con esta curva de calibracin los niveles de seal producidos por las muestras de un paciente, se puede determinar el valor de concentracin de analito de un paciente.

Fase analtica
Limitaciones del inmunoanlisis Las tcnicas de inmunoanlisis se ven afectadas en su conjunto por una serie de limitaciones propias de la reaccin Ag-Ac. Efecto matriz

Interferencias

Problemas relacionados con la especificidad de los anticuerpos

Efecto Hook o gancho

Debidas a sustancias presentes en la propia muestra o que aparecen durante alguna etapa de su desarrollo.

Fase analtica
Limitaciones del inmunoanlisis Efecto matriz Se define como el conjunto de alteraciones ocasionadas por los diversos componentes de la muestra, a excepcin del analito a determinar.

Factor reumatoide Interfieren de forma an no conocida determinaciones de hormonas tiroideas.

con

las

Complemento elevado en las enfermedades inflamatorias y que puede bloquear el sitio de unin de los anticuerpos. Lisozima Puede formar puentes entre el anticuerpo unido a fase slida y el anticuerpo marcado y dar lugar a resultados falsamente elevados.

Fase analtica
Limitaciones del inmunoanlisis Protenas de unin endgenas variaciones extremas de la albmina pueden alterar la medida de las concentraciones de hormonas tiroideas libres

Anticuerpos heterfilos son anticuerpos anti-IgG de animal Pueden interferir en los mtodos competitivos y no competitivos

Autoanticuerpos presentan mayor afinidad por la hormona que el anticuerpo del reactivo.

Fase analtica
Limitaciones del inmunoanlisis Problemas relacionados con la especificidad de los anticuerpos Depende principalmente de las caractersticas de los anticuerpos utilizados.

Falta de especificidad Cuando utilizamos anticuerpos policlonales, stos pueden presentar reactividad cruzada con otros componentes de la muestra de estructura qumica similar.

Excesiva especificidad Se presenta con relativa frecuencia cuando se utilizan anticuerpos monoclonales y la hormona presenta heterogeneidad molecular.

Fase analtica
Limitaciones del inmunoanlisis Efecto Hook o gancho La concentracin de antgeno a determinar es inusualmente elevada y uno o ambos anticuerpos quedan saturados antes de que se forme el sndwich.

La curva dosis-respuesta tpica es lineal hasta una concentracin determinada en que se produce una meseta, la curva inicia una pendiente negativa hasta alcanzar valores bajos.

Control de calidad interno

Tiene como principal objetivo la deteccin de errores en el trabajo diario del laboratorio.

Para determinar si los resultados obtenidos para un analito concreto son correctos o incorrectos, se hace necesaria la definicin del error mximo permitido (EM).

Control de calidad interno

Cuantificar el error total (ET) presente en el laboratorio para el analito, mediante el clculo del error sistemtico (ES) y error aleatorio (EA).

Para que un resultado se considere aceptable, el ET presente en el laboratorio ha de ser inferior al EM definido.

Control de calidad interno

Error aleatorio (EA) Tambin conocido como Imprecisin, se define como la dispersin de resultados de medidas independientes obtenidas bajo condiciones especficas.

Sesgo

Bias

Puede expresarse como desviacin estndar (DE) o como coeficiente de variacin (CV).

Control de calidad interno

La descripcin de este tipo de distribuciones puede ser realizada en base a estadstica paramtrica.

1.- Conocer la media. 2.- Conocer la desviacin estndar y el coeficiente de variacin.

Intradia 20 corridas mismo da

Interdia 20 corridas diferentes das

La desviacin estndar (s) cuantifica el grado de dispersin de los puntos de los datos cerca de la media.

El coeficiente de variacin (CV) es una medida de variabilidad.

Control de calidad interno

Podemos definir la probabilidad de que una medicin concreta se encuentre entre un intervalo de valores concreto.

La estimacin del EA viene dada por la DE o el CV multiplicado por una constante k, que define los intervalos de confianza de la distribucin gaussiana.

Control de calidad interno

Propuesta por Levey y Jennings en la dcada de los 50, basado en la representacin grfica de los resultados analticos de controles a lo largo del tiempo.

La media del valor control es el valor central de la grfica, y el intervalo comprendido entre la media y dos DE limita el intervalo dentro del cual el proceso analtico se considera correcto.

Control de calidad interno

Perfeccionado en 1970 con las reglas de Westgard, aplicacin minimiza los falsos rechazos y potencia la deteccin de errores.

1-2s: Detecta error aleatorio. 2-2s: Detecta error sistemtico.

1-3s: Detecta error aleatorio.

R-4s: Detecta error aleatorio. 4-1s: Detecta error sistemtico. 10-X: Detecta error sistemtico.

Como norma general, la regla 1-2s se considera de aviso, el resto se consideran criterio de rechazo.

Control de calidad interno

Error sistemtico (ES) Se define como la diferencia entre la media de un nmero infinito de mediciones de un analito y el valor verdadero. Se le conoce como veracidad

Desplaza a la media de su valor real.

Para su determinacin es necesario disponer de los datos proporcionados por programas de garanta externa de calidad.

Control de calidad interno

Error sistemtico (ES) Valoran los resultados obtenidos por varios laboratorios sobre los mismos materiales de control.

Valor diana la media del conjunto de todos los laboratorios.

Compara los diferentes resultados aportados y verifica la homogeneidad entre los mismos.

Control de calidad interno

Error total (ET) Es la discrepancia entre el resultado de una nica medicin y el valor verdadero de la magnitud biolgica medida.

Su clculo terico es el resultado de la suma del EA y ES.

Para que un resultado se considere aceptable, el ET del laboratorio ha de ser inferior al EM.

Control de calidad externo

Los programas de evaluacin externa de la calidad tienen como principal objetivo la reduccin de la variacin de los resultados entre laboratorios de un rea geogrfica determinada.

Complemento del control interno de la calidad. Ayudan a: Establecer el error sistemtico caracterstico de un mtodo. Clasificar los mtodos existentes en funcin de su nivel de calidad. Escoger un mtodo entre varios o descartar un mtodo por su nivel de calidad.

Control de calidad externo

Se distribuyeron entre los participantes 5 lotes de suero comercial liofilizado con diferentes concentraciones de PSA (ng/mL), y se calcularon para cada lote, la Media de consenso (Mc), y su Desviacin Estndar consenso (DEc).

Los resultados permitieron evaluar y comparar mtodos de inmunoanlisis.

Control de calidad externo

Comportamiento de los equipos con respecto a el mtodo empleado.

Se observa que entre el 88,9 y 100% de los metodos obtienen un CV < 15% aceptable en todos los lotes.

Control de calidad externo

Se distribuyeron entre los participantes 3 lotes de suero comercial liofilizado con diferentes concentraciones de T4L (ng/mL), y se calcularon para cada lote, la Media de consenso (Mc), y su Desviacin Estndar consenso (DEc).

Los resultados permitieron evaluar y comparar mtodos de inmunoanlisis.

Control de calidad externo

Comportamiento de los equipos con respecto a el mtodo empleado.

Se observa que entre el 41% de los mtodos obtienen un CV < 15% aceptable en todos los lotes.