APLICACIONES DE LA

TECNOLOGIA DEL DNAr

 Sistemas biológicos de producción de
PR
 Bacterias
 E. coli
 B. subtilis
 Células eucariontes
Maximizar la
 Hongos
 Levaduras expresión de
 Saccharomyces cerevisiae proteínas
 Pichia pastoris y otros metilotróficos codificadas por
 Hongos filamentosos
genes clonados
 Células animales en cultivo
 Células de insecto en cultivo
 Plantas
 Vector de
expresión

Método de
Sistema de
transformación
Huesped Expresión
genética
Recombinante
conocido

PROTEÍNA
PR
RECOMBINANTE
 UN VECTOR DE EXPRESIÓN
GENÉRICO

Compatibles con el
huésped
Factores que afectan la expresión
que son dependientes del vector
 Número de Copias del vector
 Transcripción
 Promotor
 Fuerza del promotor
 Regulación
 Terminador
 Traducción
 Fuerza del sitio de unión al ribosoma (RBS)
 Eficiencia traduccional
 Conformación y estabilidad de la proteína
 Cómo es un promotor ideal para un
sistema de expresión recombinante ?
1. Promotor fuerte (no siempre es recomendado!)
• Fuerza para asegurar expresión > 10 % del total
de proteína celular.

2. Promotor regulado.
• La sobreexpresión de una proteína impone
carga metabólica a las células, bajando la
velocidad de crecimiento.
• Algunas proteínas recombinantes pueden ser
“tóxicas” para las bacterias.
• Necesario separar crecimiento de la expresión
del gen heterólogo.
• Reducir la expresión basal
Secuencia de consenso de un promotor
 El concepto de fuerza del
promotor
 Un promotor fuerte como el promotor recA tiene
pocas diferencias c/respecto al consenso
TTGATA -- 16 -- TATAAT
TTGACA -- 17 -- TATAAT

 Un promotor débil como el promotor araBAD

tiene varias diferencias
CTGACG -- 18 -- TACTGT
TTGACA -- 17 -- TATAAT
 
Es posible mutar un promotor para hacerlo
mas fuerte

lac
consenso
wild-type  TTTACA -- 18 -- TATGTT
lac UV5         TTTACA -- 18 -- TATAAT
                TTGACA -- 17 -- TATAAT
              
BACTERIAS TRANSGENICAS
PL: promotor del fago lambda
28-32°C temp.
permisiva
NO ocurre expresión del
gen controlado por el
represor cI

42°C temperatura
restrictiva
Fenotipo mutante
para el represor cI.
Ocurre expresión del
gen controlado por cI
Genoma

En vector

Razón de inducción >> de 1000 veces

 La insulina
 El problema de la insulina:

 El primer medicamento producido por ingenría

genética y con la primera licencia de ésta clase,
es la insulina humana, destinada al tratamiento
de la diabétes. Este producto reemplazó a la
insulina extraída del páncreas del cerdo y la
vaca. A pesar de que ésta molécula es
biológicamente activa en el hombre, su
secuencia en aminoácidos no es idéntica a
aquella de la molécula humana.
 pre-pro-insulina:

La insulina regula el metabolismo de los azúcares y es

normalmente secretada en la sangre por las células del páncreas.
Es una proteína de 108 aminoácidos, con una secuencia hidrofoba
ó secuencia señal (24 aminoácidos) que le permite atravezar las
membranas intracelulares y que se conoce como pre-proinsulina.

 pro-insulina y peptido C

A lo largo de su transporte, la secuencia señal de 24 aminoácidos

se separa de la cadena del polipéptido, formando la pro-insulina,
que se almacena en vesículas que se lian a las membranas de las
células pancreáticas.

La pro-insulina es entonces replegada ó comprimida como una letra

G, los 2 extremos del chorro sostenidos juntos por 3 puentes
disulfuros y entonces transformada en insulina dentro de las
vesículas pancreáticas mediante la excisión enzimática de un
segmento polipéptidico de 33 aminoácidos conocidos como péptido
C.
 insulina madura:
La insulina madura está formada de 2 cadenas
distintas, una de 21 aminoácidos (la cadena A) y
la otra de 30 aminoácidos (cadena B); unidas
por puentes disulfuros iguales.
 La insulina no contiene cadenas sacarídicas.
 La productción de la insulina usADNo E. coli :
El gen cromosómico de la insulina no puede ser utilizado
para el clonado de la insulina en la bacteria, puesto que
el codifica la pre-proinsulina que tiene una
subdependencia de secuencias promotoras eucariotas y
además contiene un intrón.

Es por eso que hubo que primero crear un ADNc de la

proinsulina (sin secuencia señal ni intrón) que pudiera
ser unido a la extremidad 5' de éste ADNc con un codón
metionina (ATG) sintetizado
 químicamente (en efecto, la AUG de la insulina
se encuentra dentro de la secuencia señal).
Este ADNc se inserta en un plásmido que tiene
un fragmento del gen lacZ compuesto de un
promotor y de una parte de la secuencia
codante de la ß-galactosidasa, creando así una
proteína de fusión.

Es éste plásmido recombinado el que es

introducido en la E. coli.
 En la célula bacteriana, y bajo
el control de secuencias de
regulación del gen lacZ, de la
ARNm es producido y
traducido en proteínas
constituídas una parte de ß-
galactosidasa fusionada por la
metionina suplementaria a la
proinsulina.
 La insulina se obtiene tratando
la proteína de fusión con
bromuro de cianógeno, un
reactivo que corta las uniones
peptídicas junto a los residuos
de metionina.
 La metionina no aparece en la
secuencia de la proinsulina
nativa.
 La insulina recombinada se
repliega en una estructura
tridimensional gracias a la
formación de puentes disulfuro
y el péptido C es cortado por
proteasas dando lugar a la
insulina humana pura.
Expresión del
Gen de la
Somatostatina
Levaduras transgenicas
 Las levaduras se multiplican
rápidamente :
ellas se dividen cada dos horas.
 Su genoma:
Las levaduras están bien caracterizadas
desde el punto de vista genético. Su
genoma mide 1,4 10 7 nucleótidos (osea
de 3 a 4 veces más que el de la E. coli).
Ha sido enteramente secuenciada.
Vectores
Esquema de mejora genética de levaduras vínicas
mediante el uso de técnicas de DNA recombinante
Produccion de vacuna a traves de
Saccharomyces cerevisceae
PLANTAS TRANSGENICAS

INGENIERIA GENETICA
VEGETAL
 PLANTAS TRANSGENICAS
 EL florecimiento de la IG vegetal se debe
principalmente a dos grandes avances de la
década de los 80:
 protocolos experimentales para la regeneración
de plantas completas fértiles a partir de cultivos
de células o tejidos in vitro;
 métodos para introducir el ADN exógeno, bien
sea de modo directo o indirecto, seguido de su
inserción en el genoma y su expresión.
¨agalla¨, ¨corona¨ tumor¨
 Agrobacterium tumefasciens
 Bacteria del suelo que lleva haciendo ingeniería
genética por su cuenta con las plantas desde hace
millones de años.
 La bacteria es un patógeno de plantas, induciéndoles
una malformación llamada tumor de la agalla.
 Establece con la planta una especie de "colonización
genética" que obliga a la planta a fabricar una
sustancia de la que sólo se puede nutrir esta
bacteria. El tumor es una especie de fábrica de esas
sustancias, para el solo beneficio de Agrobacterium.
 .
 La bacteria es atraída por sustancias que
la planta excreta en sus zonas abiertas
por pequeñas heridas. Por allí se
introduce, quedando en los espacios
intercelulares, y es entonces cuando
transfiere a la célula vegetal un trozo de
su material genético: una porción de un
plásmido (ADN circular extracromosómico
bacteriano), que se integrará en alguna
zona del genoma de la planta
Ciclo biologico de A. tumefasciens
Procesos celulares implicados
 El ADN de una célula de A. tumefaciens está
contenido en el cromosoma bacteriano y en otra
estructura llamada plásmido Ti (inductor de
tumores). El plásmido Ti contiene:
 un segmento de ADN llamado ADN-T (~20 kb
de largo) que es transferido a la célula de la
planta en el proceso de la infección.
 una serie de genes vir (de la virulencia) que
dirigen el proceso de la infección.
 Para utilizar A. tumefaciens como vector
del transgen, los científicos han eliminado
la sección de ADN-T inductora de tumores
y han conservado las regiones fronterizas
del ADN-T y los genes vir. El transgen es
insertado entre las regiones fronterizas del
ADN-T, desde donde es transferido a la
célula de la planta para integrarse en los
cromosomas de ésta.
 El ADN-T entra en la célula de la planta a través
de la lesión. No está claro cómo el ADN bacteriano
se traslada desde el citoplasma al núcleo de la
célula de la planta, ni cómo el ADN-T se integra en
el cromosoma de la planta. Recuerde que la
mayoría de las veces el ADN de la planta no existe
como una hebra expuesta sino que está envuelto
con las proteínas histonas y tiene una estructura
superarrollada. Una hipótesis es que el ADN-T
espera hasta que el ADN de la planta está siendo
replicado o transcripto y entonces se inserta en el
ADN expuesto de la planta
 Diagrama de la célula de
Agrobacterium tumefaciens
PLASMIDO Ti (inductor de tumor)
La región T está definida por dos repeticiones
directas de 25 pb altamente homólogas
 Mecanismos moleculares implicados en
la transformación por Agrobacterium tumefaciens
 Vectores a partir del plásmido Ti

 Suelen ser de uno de dos posibles tipos: 

 vectores binarios
 vectores recombinativos (cointegrativos)
PLASMIDO Ti
Gen quimérico en el plásmido: Ti
de Agrobacterium tumefaciens
Obtencion de plantas transgenicas Via
A. tumefasciens
Obtención de plantas transgénicas
via Agrobacterium tumefaciens
 Transgen via A. tumefasciens
 Del plasmido Ti se utiliza solo la región de DNA T
(borde derecho y borde izquierdo) .
 En la construccion del transgen se colocan genes
marcadores de seleccion: Gen de la proteina verda
fluorescente
 Un Promotor que permita determinar cuando y en que
momento se exprese el gen y El gen Inserto.
 Se introduce el vector (con la correspondiente
construcción genética) en una cepa de Agrobacterium
a la que hemos "desarmado" su plásmido Ti (con
objeto aprovechar sus funciones de transferencia del
ADN-T, pero inactivándole sus funciones patógenas).
 Ejemplo de uso: introducción del gen Bt que determina
la toxina antiiinsecticida de la bacteria Bacillus
thuringiensis
 Diseño de un transgen vegetal

 un gen, debe ser sometido a varias

modificaciones antes de que pueda ser
efectivamente insertado en una planta.


Representación simplificada de un transgen construido, que contiene
los componentes necesarios para la integración y expresión con éxito
 SECUENCIA PROMOTORA
 El promotor es la llave de encendido y apagado que
controla cuándo y dónde se expresará el gen en la
planta. Hasta la fecha, la mayoría de los promotores
en las variedades de cultivos transgénicos han sido
"constitutivos", es decir, que causan la expresión del
gen durante todo el ciclo biológico de la planta en la
mayoría de los tejidos, Ej. Gen 35 S.
 Otro promotor constitutivo usado comúnmente es
CaMV35S, proveniente del virus del mosaico de la
coliflor, que generalmente produce un alto grado de
expresión en las plantas.
 Otros promotores son más específicos y responden a
señales indicadoras en el medio interno o externo de
la planta. Un ejemplo de un promotor inducible por la
luz es el promotor del gen "cab", que codifica la
principal proteína fijadora de clorofilas a y b.
GEN MARCADOR O REPORTERO
 Se agrega un gen marcador seleccionable al
"constructo" génico con el fin de identificar las
células o tejidos de la planta que han integrado
con éxito el transgen.Se utiliza frecuentemente el
gen de la Proteina verde fluorescente GPVF.

 . Los genes marcadores seleccionables codifican

proteínas que proporcionan resistencia a agentes
normalmente tóxicos para las plantas, como los
antibióticos o herbicidas. sólo las células vegetales
que han integrado el gen marcador seleccionable
sobrevivirán cuando se las cultive en un medio que
contenga el antibiótico o herbicida pertinente.
GEN MARCADOR GPVF
Celulas transfectadas con GPVF
 METODOS DE
INTRODUCCION DE DNAr A
LA CELULA VEGETAL
 1.- Microbalística (biolística)
 Perlitas microscópicas de oro o tungsteno se
recubren del ADN de interés, y se disparan a gran
velocidad con una pistola especial. Las células en
la línea directa del proyectil pueden morir, pero a su
alrededor muchas células captan el ADN sin daños.
 Incluso se pueden transformar cloroplastos con
este sistema.
 Sirve para plantas que son más difíciles de
cultivarse sus tejidos (cereales, leguminosas),
aunque tiene el inconveniente de que el ADN
puede insertarse en copias, y puede ser inestable.
Microcañón con partículas
metálicas rodeadas de ADN
 2.- Electroporación

 El ADN se mezcla con protoplastos, y se

aplican corrientes elevadas, lo que
provoca la entrada de aquél.
ELECTROPORACION
3.- Co-cultivo de células o tejidos con
Agrobacterium tumefaciens
Transformación mediante cocultivo de A
tumefaciens y discos de hojas de tabaco
Regeneración de plantas completas-
Cultivo in vitro
 Para obtener plantas completas a partir de tejidos
transgénicos como los embriones inmaduros, se cultivan
éstos en condiciones ambientales controladas en una
serie de medios que contienen nutrimentos y hormonas,
proceso conocido como cultivo de tejidos.

 Una vez que se generan plantas completas y éstas

producen semillas, comienza la evaluación de la
progenie. Este paso de la regeneración ha sido un
obstáculo al producir plantas transgénicas en muchas
especies, pero ahora se pueden transformar y regenerar
variedades específicas de la mayoría de los cultivos
Etapas del cultivo in vitro
Cultivo in vitro etapas
CULTIVO in vitro
etapas
 Aplicaciones
 resistencia a condiciones adversas (sequías, frío, etc.);
 mejoras de rendimientos manipulando la respuesta a la
luz;
 manipulación genética de los microorganismos del suelo
que interaccionan con las plantas, para favorecer la
nutrición mineral,
 mejora de los mecanismos de defensa frente a hongos,
bacterias y nematodos patógenos, y quizá
 lograr nuevas especies fijadoras de nitrógeno (con lo
que disminuiría la actual dependencia de los abonos
químicos).
 -Incremento de la productividad al proteger los
cultivos contra: plagas, enfermedades

· herbicidas (tolerancia a los herbicidas para eliminar

las malas hierbas) sequías,salinidad elevada del suelo

 -Regeneración de suelos contaminados por metales

pesados con plantas transgénicas tolerantes a
concentraciones elevadas de estos elementos.
-Producción de medicamentos.

 En 1997 se investigaba la producción de anticuerpos

monoclonales, vacunas y otras proteínas terapéuticas
en plantas transgénicas de maíz y soja.

-Retraso de la maduración de los frutos para
conseguir dilatar el tiempo de almacenamiento
Semillas con modificacion genetica
ANIMALES TRANSGENICOS
DISENO DEL TRANSGEN
CONSTRUCCION DEL TRANSGEN
Etapas de clonacion
 Métodos de obtención de
animales transgénicos
 El primer paso consiste en identificar y aislar el
gen que se desea insertar en el genoma del
animal con el fin que manifieste un carácter
determinado o produzca la síntesis de una
proteína. Para introducir el gen existen distintos
métodos:
 Microinyección de ADN en el pronúcleo
de un zigoto
 Transferencia del gen empleando retrovirus como
vectores
 Transformación de células madre embrionarias
 Microinyección

 Se extraen los óvulos de hembras en la que se ha

inducido una superovulación, y se fecundan in vitro. Bajo
un microscopio, el óvulo fecundado se inmoviliza con
una micropipeta y se inyecta una pequeña cantidad de
una solución que contiene muchas copias del transgén
en el pronucleo masculino. Posteriormente, estos óvulos
fecundados se introducen en madres adoptivas,
previamente tratadas con hormonas que induzcan el
momento adecuado de su ciclo ovárico para recibir el
embrión y que progrese el embarazo.
 Transferencia del gen empleando
retrovirus como vectores

 En este método se emplea virus capaces

de transportar el transgén hasta las
células embrionarias e insertarlo en su
genoma. Al igual que la microinyección, la
inserción se efectúa al azar, por lo que
para tener lineas puras es necesario
proceder a una selección de la progeni
- Los primeros animales transgénicos producidos fueron
ratones, obtenidos mediante microinyección de cigotas
TRANSGENESIS EN BOVINOS
TRANSGENESIS EN PECES
TRANSGENESIS EN INSECTOS
TRANSGENESIS EN AVES
TRANSGENESIS EN CERDOS
Terapia genica
 Transformación de células madre
embrionarias

 Este método es menos aleatorio que los

anteriores y se utiliza para dirigir los transgenes
a lugares específicos del genoma. El proceso
consiste en transformar la células madre en
cultivo con el transgén utilizando los vectores
adecuados. Las células madre transformadas se
inyectan en embriones en fase de blastocito, y
se implanta en una madre adoptiva. Al igual que
en los métodos anteriores, sera necesario
proceder a la selección y cruzamiento para
obtener una línea transgénica pura.
 Los animales transgénicos se
están utilizando para:
Profundizar en el estudio del desarrollo y
fisiología del animal
Estudiar enfermedades y contribuir al
desarrollo de tratamientos más efectivos
Producir productos biológicos útiles
Ensayar la seguridad de vacunas y productos
químicos
Incrementar en animales de granja la calidad y
cantidad de sus productos
Conseguir órganos que puedan utilizarse en
transplantes
 . Estudio de enfermedades comprensión del
papel de los genes en el desarrollo de una
enfermedad, o para imitar enfermedades
humanas con el fin de investigar nuevos
tratamientos., como cancer, fibrosis
quística, artritis reumatoide y Alzheimer. El
inconveniente radica en que estos animales
no sean, probablemente, ni adecuados ni
relevantes como modelos humanos
 Producción de productos biológicos Se pueden
crear animales transgénicos que produzcan
productos biologicos útiles (medicinas, proteínas etc)
mediante la introducción de la porción de ADN que
codifica ese producto en particular

 . Ensayo de seguridad de vacunas y productos

químicosSe han desarrollado ratones transgénicos
para ensayar la seguridad de las vacunas antes de
suministrarlas a humanos

 . Donación de órganos Se han desarrollado cerdos

transgénicos con el fin de producir órganos para
trasplantes de forma que no exista rechazo por el
sistema inmunológico del paciente.
 . Incrementar en animales de granja la calidad y
cantidad de sus productos