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Cultivo de fibroblastos 3,
7 das
Frascos de Roux
Primeros
tiempos:
No haba
vectores ni
marcadores
selectivos
Transfeccin de ADN
Mtodos fsicos
Mtodos
qumicos
Vectores virales
Microinyeccin
Electroporacin
Microproyectiles
Fosfato clcico
Policationes
Lpidos
Liposomas
Membranas derivadas de
eritrocitos
Retrovirus
Adenovirus
o
virus
asociados (AAV)
Herpetovirus
Transfeccin estable
La incorporacin el ADN se lleva a cabo en forma similar a los ensayos transient.
Pero hay integracin del ADN al genoma (evento poco frecuente)
Se selecciona el evento con un marcador de seleccin
Tet-Off
Dox - +
Tet-On
- +
Coprecipitado
LacZ
Solucin de
fosfato
GAPDH
Liposomas
Electroporacin
Mezcla de lpidos policatinicos y neutros que forma
liposomas con carga neta positiva (por los grupos
amino)
Mtodo de eleccin cuando se usan Carriers en
transfecciones de rutina por su simplicidad,
reproducibilidad y alta eficiencia
Electroporacin
Mtodo verstil porque sirve para un gran nmero de tipos celulares:
Cultivos primarios, aislamientos de tejidos, protoplastos de plantas,
bacterias, levaduras.
Se pone a punto variando la fuerza del campo elctrico y el tiempo
Es factible ponerlo a punto para prcticamente cualquier tipo celular
Vectores virales
Molecular
pharming:
Tambo
farmacutico
Transferencia
nuclear
Ovejas transgnicas
promotor de la Beta lactoglobulina
Activo en tejido mamario
Microinyeccin en el vulo
Transplantar y testear por PCR
Altos niveles del producto del transgn
en la leche
Knockouts en ratones:
Crear el targeting vector
con la mutacin.
Recombinacin homloga
en clulas en cultivo
Seleccionar
recombinantes/knockouts:
G418 (Neo) elimina
clulas sin insercin, el
ganciclovir elimina clulas
con integracin ectpica
(que contienen el gen tk).
(depende del
sentido y
localizacion de
los Lox
Terapia gnica
La TG puede realizarse por tres mtodos distintos:
Ex vivo, cuando la correccin del defecto gentico se realiza en el laboratorio en las
clulas extradas del paciente y que posteriormente son reintegradas dentro del
organismo (por ejemplo, el sndrome de inmunodeficiencia combinada severa producida
por deficiencia de la adenosin desaminasa, ADA, en los llamados nios burbuja)
In situ, cuando la modificacin gentica de las clulas del paciente se realiza
introduciendo el ADN (los genes teraputicos) directamente en el propio rgano
defectuoso del individuo (por ejemplo, en el caso de la fibrosis qustica, la distrofia
muscular de Duchenne o la supresin de tumores por suicidio celular)
In vivo, cuando se hace llegar en vectores adecuados los genes teraputicos a las
clulas defectuosas a corregir a travs del torrente circulatorio (por ejemplo, por
inyeccin intravenosa). Otra posibilidad sera la de utilizar las clulas de la piel con un
propsito bien distinto: la sntesis y secrecin de protenas que son producidas
normalmente en un tipo de clulas pero que son transportadas en el plasma sanguneo
para uso de otras clulas. As, en principio, implantes de clulas de la piel podran
corregir enfermedades tales como la hemofilia por ejemplo.
Terapia
gnica
con
clulas
troncales
(madre)
Retrovirus
Vectores
Retrovirales
Pfeifer & Verma (2001). Ann Rev Genomics Hum Genet 2:177-211
Vectores adenovirales
No hay envoltura
Respuesta inmune fuerte
Evolucin
No hay integracin
Hay integracin
Con envoltura
Pfeifer & Verma (2001). Ann Rev Genomics Hum Genet 2:177-211
Terapia gnica:
SCID (inmunodeficiencia severa combinada) o nios
de burbuja defecto en la ADA (adenosina deaminasa
sangunea)
Ashanti de Silva
Slo un 15% de los pulmones cedidos de forma altruista son aptos para trasplante.
"Utilizamos un adenovirus (un virus al que le retiramos todos los genes) y le insertamos un gen
beneficioso, en este caso el IL-10 o interleukina 10, una sustancia que reduce la inflamacin y
que
frena la respuesta del sistema inmune, lo que disminuye las posibilidades de rechazo
una vez realizado el injerto. Lo inyectamos en los pulmones mediante un broncoscopio", indica
el doctor Keshavjee. Cuando se trasplantaron los pulmones de cerdo a los animales receptores,
aquellos que tenan el gen mostraron mejor funcionamiento. "En el caso de los humanos, los
rganos
no se trasplantaron, una de las limitaciones del estudio. Pero en la mquina ex vivo observamos
que aquellos rganos con el gen IL-10 restituan su funcin y presentaban menos inflamacin,
seala el autor.
FUENTE | El Mundo Digital 29/10/2009
Tipos de vacunas
Vivas
Inactivadas
Atenuacin
Exotoxinas bacterianas
(ttanos)
Cepas homlogas/
sustitucin gnica
Produccin
Reversin de la virulencia/patogenicidad
Mtodos fsicos/qumicos
Pasajes en cultivos
celulares
Solventes orgnicos
CTAB
Ultracentrifugacin
Tercera generation
Segunda generacin
Primera generacin
Vacunas a DNA
Vacunas a DNA
Genetic Vaccines
Nature Review Genetics
Vacunas a subunidades
Vacunas a DNA
Pros
Contras
Limitadas a inmungenos
proteicos (polisacridos)
Requiere altas dosis en su aplicacin
intramuscular
Indu ce elevada
resp uesta inmunolgica
sin riesgo
Monmero Capsmero
VLP
VLPs conjugados
carriers de
antgenos
Vacunas
recombinantes
Baculovirus
Sistema de Baculovirus