BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

TRANSGÉNICOS

Blga. Maribel Huatuco Lozano

 PRINCIPALES TÉCNICAS DE BIOTECNOLOGÍA
VEGETAL

 Las técnicas empleadas en la generación de

plantas transgénicas son diferentes si se pretende
expresar genes exógenos en la planta o si, por el
contrario, se busca alterar la expresión de genes
del organismo.
 Para conseguir una transformación eficiente de un
tejido vegetal es preciso satisfacer los siguientes
requisitos:
 TÉCNICAS PRINCIPALES DE BIOTECNOLOGÍA
VEGETAL

 Debe existir un método eficiente de introducción de

ADN en el tejido vegetal.
 Debe existir un marcador que permita seleccionar
eficazmente los tejidos transformados.
 Debe ser técnicamente posible la propagación y la
regeneración del tejido diana, y posteriormente de
plantas fértiles a partir del tejido transgénico.
Cultivo in vitro.
 Proceso de transformación simple, eficaz,
reproducible, económico e independiente del
genotipo del organismo utilizado.
 Proceso corto en el tiempo para evitar en lo posible
la variación somaclonal y la esterilidad.
 ADN EXÓGENO

 Preparación del ADN exógeno

Requiere los siguientes

componentes:
 Transgen
 Promotor
 Marcador de selección
 Marcador testigo
 MÉTODOS DE TRANSFORMACIÓN

A.- Métodos de Transformación Biológica

Transformación con Agrobacterium:
 Agrobacterium tumefaciens

 Agrobacterium rhizogenes
Otro método que se desarrolló, esta basado en una estrategia para el
control de plagas.
El objetivo esta en proveer resistencia a las plantas, incorporando
genes de la toxina natural de la bacteria Bacillus Thuringiensis (Bt).
Esta toxina proteica afecta a ciertas larvas que tienen aparato bucal
masticador y producen graves daños a los cultivos, causando su
parálisis y muerte.
Cuando la planta posee ese gen, produce la toxina y, de esta forma,
se protege ante el ataque de los insectos.

Este es el porqué al
maíz modificado
genéticamente se le
llama maíz Bt.
 MÉTODOS DE TRANSFORMACIÓN

B.- Métodos Físicos de Transformación

Transformación de Protoplastos:
Los protoplastos son células desnudas que han perdido la
pared celular. Pueden aislarse generalemnte de cultivos de
callos. La entrada de ADN exógeno en el protoplasto puede
conseguirse utilizando diversos métodos:
 Electroporación
 Tratamiento con Polietilenglicol
 Transformación con Liposomas
 Biolística
 Transformación mediada por láser
 Femtoinyección
 Abrasión con fibras
 TRANSFORMACIÓN BIOLÓGICA CON AGROBACTERIUM

 Transformación de la célula vegetal con el plásmido Ti

de A. tumefaciens
 TRANSFORMACIÓN BIOLÓGICA CON AGROBACTERIUM

Agrobacterium tumefaciens es patógena de plantas. Produce tumores

Agrobacterium
núcleo
Plásmido Ti
inductor de tumores cromosoma
contiene oncogenes
(genes onc)

cromosoma

célula
Ingeniero vegetal
genético natural
tras sutitución de
genes onc por tumores
genes de interés Proliferación de
hormonas crecimiento.
Se forman tumores en
las zonas de la lesión
TRANSFORMACIÓN BIOLÓGICA CON AGROBACTERIUM
TRANSFORMACIÓN BIOLÓGICA CON AGROBACTERIUM
 TRANSFORMACIÓN BIOLÓGICA CON AGROBACTERIUM

Transformación de la célula vegetal con el plásmido Ti

de A. rhizogenes

A. rhizogenes es un patógeno vegetal que da lugar a una

proliferación radicular anormal en las plantas infectadas.
 MÉTODOS FÍSICOS DE TRANSFORMACIÓN
o Electroporación

Se basa en la aplicación de pulsos

eléctricos cortos y de alto voltaje
en la membrana celular, esto hace
que aparezcan de forma temporal
poros que van a permitir la entrada
en el interior de la célula de
macromoléculas presentes en la
solución extracelular. Este proceso
permite a las células suspendidas
en un tampón con plásmidos de
DNA incorporar al interior celular el
ADN tras la electroporación,
resultando en una trasformación
transitoria o estable.
 MÉTODOS FÍSICOS DE TRANSFORMACIÓN

 Tratamiento con Polietilenglicol (PEG)

Un agente fusagénico que modifica químicamente

las membranas al interaccionar con los fosfolípidos
que las componen, permite la entrada del ADN
exógeno en suspensión presente en el medio. El
mecanismo de la captación de DNA implica la
contracción del volumen del protoplasto debido a la
alta presión osmótica originada por el PEG, seguido
de la creación de vesículas endocíticas que
incorporan el complejo catión/DNA.
 MÉTODOS FÍSICOS DE TRANSFORMACIÓN
 Biolística
La técnica consiste en bañar
partículas esféricas de oro o tungsteno
(aproximadamente de 0,4-1,2
micrómetros de diámetro, o del tamaño
de algunas células bacterianas) con
DNA, el cual ha sido precipitado con
CaCl2, espermidina o polietilenglicol.
Las partículas bañadas con DNA son
aceleradas a altas velocidades (300-600
metros / segundo) con un equipo
especial llamado pistola de partículas (o
pistola de genes).
 MÉTODOS FÍSICOS DE TRANSFORMACIÓN
 Biolística
Los proyectiles acelerados van a
penetrar la pared celular y la
membrana de la célula, aunque la
densidad de partículas utilizadas
no va a resultar significativamente
dañina para la misma. El alcance
de la penetración de las partículas
en las células vegetales puede ser
controlada variando la intensidad
del estallido, alterando la distancia
que las partículas han de
atravesar para alcanzar la célula o
utilizando partículas de diferentes
tamaños.
 MÉTODOS FÍSICOS DE TRANSFORMACIÓN

 Transformación con liposomas

Se emplean liposomas artificiales en cuyo interior
viaja la suspensión de moléculas de ADN.
 Transformación mediada por láser
Esta técnica supone la apertura de microorificios
mediante un haz de láser, por los que se facilita la
penetración de ADN desnudo en el interior de la
célula.
 Abrasión con fibras
Consiste en la apertura de entradas permanentes en
las paredes y membranas celulares mediante la
mezcla a alta velocidad de células vegetales y fibras
abrasivas, generalmente de carburo de silicona,
recubiertas de ADN.
 MÉTODOS FÍSICOS DE TRANSFORMACIÓN

 Femtoinyección
La transferencia del transgén es mediante una
microinyección de ADN con una femtojeringa de
expansión con galinstano, que consiste en un
microcapilar de borosilicato o cuarzo sellado y cuya
punta tiene un diámetro de tan solo 0.1 µm.
ADN ENDÓGENO

 Silenciamiento génico
Son técnicas capaces de impedir la expresión de un gen
endógeno.
Pueden destacarse las siguientes:

 ARN antisentido.- Consiste en la síntesis de ARNm

complementario al del gen cuya expresión se desea inactivar.
Apartir del ARN antisentido se generan moléculas de ARN
bicatenario que son escindidas y actúan como ARNm que no
pueden ser traducidos.

 Ribozimas.-Por ingeniería genética se sintetiza ribozimas

especificas capaces de degradar ARNm de cualquier gen que se
desea silenciar en forma especifica.