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ESCUELA POLITCNICA DEL EJRCITO Departamento de Ciencias de la Vida Carrera Ingeniera en Biotecnologacnolo CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES Nombre: Lizzethe

Paz Curso: 6to B Fecha: 07/01/13 Tema: Mtodos que se utilizan para realizar transformaciones genticas en plantas 1. AGROBACTERIUM COMO MTODO DE TRANSFORMACIN: 1.1.- Agrobacterium tumefaciens Es una bacteria gram negativa que induce la formacin de tumores, denominados agalla de la corona, generalmente en la unin del tallo con la raz, en numerosas dicotiledneas y en muy pocas monocotiledneas y Gimnospermas. Infecta a dicotiledneas como parte de su ciclo vital insertando genes forneos en las mismas consiguiendo que se expresen en forma de protenas. Tras la transferencia se vio que el T-DNA (fragmento de DNA) se integraba en el genoma nuclear de la planta y su expresin induca el fenotipo tumoral. Agrobacterium crea un nicho favorable para s mismo, utilizando la maquinaria de la clula vegetal para producir sustancias que no va a utilizar esta pero que permiten el crecimiento de la bacteria (genes op permiten la produccin de opinas), produccin de hormonas como auxinas y citoquininas (genes onc). La induccin de los genes vir de Agrobacterium implica que el sistema de reconocimiento de la bacteria detecte los compuestos fenlicos producidos por la planta y transmita la informacin al interior de la clula bacteriana. Durante la insercin del T-DNA en el DNA cromosmico de la planta, ste a menudo experimente cortas delecciones debido al proceso de empalme entre ambos DNAs. La insercin del T-DNA es aleatoria mientras que los bordes presentan cierta homologa con aquellos lugares del DNA de la planta en los que se insertan. Tras la insercin se produce la activacin de numerosos genes como los onc y op.

Figura 1: Transformacin mediante Agrobacterium tumefaciens

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Los genes onc tienen que ser eliminados, as las clulas vegetales transformadas no proliferan en un tejido tumoral y pueden regenerar plantas normales. Pero esto acarrea un inconveniente y es que al no formarse los tumores, las clulas transformadas son fenotpicamente indistinguibles de las clulas normales, por ello deben usarse marcadores que permitan seleccionar las clulas transformadas. Tambin deben eliminarse los genes que codifican las opinas, ya que la planta desva parte de sus recursos para sintetizar estos compuestos y la produccin final obtenida es menor. - Los plsmidos Ti son largos para lo experimentos de recombinacin de DNA (200,800kb), luego los segmentos de DNA que no son necesarios para el clonaje se eliminan (desarme del plsmido Ti). Puesto que sin los genes vir estos vectores no pueden insertar por s mismos el TDNA en la clula vegetal, se han diseado dos tipos de sistemas de vectores derivados del plsmido Ti, estos sistemas son los que se utilizan en la actualidad: - Sistema de vector cointegrado ( sistema cis): se introducen nuevos genes en un plsmido Ti no oncognico mediante recombinacin homloga. El problema a la hora de utilizar estos vectores es que su gran tamao (normalmente mayor de 10 kb) dificulta su manipulacin in vitro. - Sistema de vector binario (sistema trans): los nuevos genes son clonados en un plsmido que contiene T-DNA no oncognico, este plsmido es posteriormente introducido en una variedad de Agrobacterium que posee un plsmido Ti con una regin vir intacta pero que carece de T-DNA. En cualquiera de los dos casos, el DNA de inters primero se clona en Echerichia coli y posteriormente se transfiere a Agrobacterium por conjugacin. 1.2 Agrobacterium rhizogenes Es otra familia de plsmidos de Agrobacterium que podra servir de vectores de genes para la obtencin de plantas sanas, genticamente modificadas. Provocan una proliferacin de las races denominada raz en cabellera, en la plantas infectadas por A. rhizogenes y se llaman plsmidos Ri (de root inducing). Las races, como el tejido de la agalla, crecen rpidamente en un cultivo libre de bacterias. Los procedimientos para transformar plantas utilizndolos son bastante similares a los de Agrobacterium. VECTORES VIRALES: Virus de DNA Geminivirus: Los geminivirus son una familia de virus patgenos de plantas que son transmitidos por insectos vectores a una gran variedad de plantas monocotiledneas y dicotiledneas. Son virus DNA de cadena sencilla que se replican en el ncleo de las clulas mediante un DNA intermediario de doble cadena. Copias clonadas de varios miembros de los geminivirus son transmisibles a un amplio rango de hospedadores, que incluyen tanto a monocotiledneas como a dicotiledneasSu desventaja se debe a que cuando se les introducen genes forneos que aumentan el tamao del genoma los virus quimricos tienden a eliminar ese DNA en un intento de recuperar su tamao original. Caulimovirus: El CaMV posee un genoma con DNA de doble cadena de aproximadamente 8 kilobases, y con un rango limitado de hospedadores, en su mayora crucferas como la coliflor y el nabo. Los fidos son los vectores de transmisin naturales; sin embargo, tambin se puede producir infeccin mediante inoculacin mecnica y agroinfeccin (uso de Agrobacterium como vector para facilitar la infeccin viral de plantas).

ESCUELA POLITCNICA DEL EJRCITO Departamento de Ciencias de la Vida Carrera Ingeniera en Biotecnologacnolo CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES Virus de RNA: No existen ensayos de infecciones directas de las formas cDNA de los virus RNA. As, la infeccin mediante transcritos RNA sintetizados in vitro es la nica ruta obvia de disear virus de RNA. Tambin se ha sugerido que la elevada tasa de error durante la sntesis viral de RNA causara inestabilidad en genes forneos. Se inform de la expresin del gen bacteriano CAT mediado por transcritos de RNA de una protena de fusin de la cubierta del virus delmosaico de bromo en protoplastos de cebada, pero como se usaron protoplastos, es difcilcomparar los resultados con otros obtenidos con diferentes vectores de origen viral, por lo que se sugiere que los vectores de RNA son poco factibles por el momento. VECTORES TRANSPOSONES: Los transposones son fragmentos de DNA que pueden realizar saltos de una zona del DNA a otra in vivo. Se han clonado varios genes de plantas usando transposones. Un gen mutado portando un inserto transposn se aisla primero usando un transposn previamente clonado como sonda para encontrar el elemento y el DNA flanqueante; el DNA flanqueante se usa posteriormente como sonda para aislar el gen desde la lnea salvaje. A pesar de ello, su aplicabilidad como vectores no est del todo definida. 2. TCNICAS DE TRANSFERENCIA GNICA DIRECTA: Son e tcnicas basadas en la utilizacin de tratamientos qumicos, fsicos y elctricos para introducir DNA en las clulas. Las plantas monocotiledneas, incluidos los principales cereales (arroz, maz y trigo) no son transformadas fcilmente por Agrobacterium tumefaciens, emplendose asi dichas tcnicas Transferencia de DNA a protoplastos: La tcnica se basa en el principio de que la pared celular es la principal barrera para la captacin de DNA, as que se la puede extraer temporalmente (mediante enzimas de restriccin); posteriormente distintos mtodos simples pueden ser utilizados para la transferencia gnica. Para la transformacin, las clulas son obtenidas a partir de distintos tejidos, que dependern de la planta utilizada y del objetivo perseguido. Para la transformacin estable se necesitan clulas en divisin, por lo que el nmero de tejidos que van a servir como fuente de protoplastos es ms restringido. La subsiguiente captacin de DNA a los protoplastos aislados puede ser efectiva mediante distintos mtodos fsicos y qumicos que van a crear poros en la membrana o bien mediante mecanismos de endocitosis que permitirn el paso de molculas externas a travs de la membrana. El mtodo qumico ms efectivo es el mtodo que usa polietilen glicol (PEG) en combinacin con cationes divalentes (Ca++ o Mg++).La mayor alternativa al tratamiento con PEG para la transformacin de protoplastos es la electroporacin. La principal limitacin del uso de estas tcnicas es que en muchas de las especies vegetales en las que se aplican estas tcnicas de forma usual (i.e. aquellas especies recalcitrantes a la transformacin mediante Agrobacterium) la generacin de las plantas a partir de cultivos de protoplastos no es eficiente.

Bombardeo con Micro proyectiles (Biolstica): Es el mtodo alternativo al plsmido Ti ms importante para transferir DNA a plantas. El bombardeo con microproyectiles es utilizado para transferir DNA exgeno a suspensiones celulares de plantas, a cultivos de callos, a tejidos meristemticos, a embriones inmaduros y a polen adems, este mtodo a sido utilizado para transferir DNA a cloroplastos y mitocondrias La tcnica consiste en baar partculas esfricas de oro o tungsteno (aproximadamente de 0,4-1,2 micrmetros de dimetro, o del tamao de algunas clulas bacterianas) con DNA, el cual ha sido precipitado con CaCl2, espermidina o polietilen glicol. Las partculas baadas con DNA son aceleradas a altas velocidades (300-600 metros / segundo) con un equipo especial llamado pistola de partculas (o pistola de genes) los cuales van a penetrar la pared y membrana celular. Una vez dentro de la clula, el DNA se separa de las partculas y, en algunos casos,

ESCUELA POLITCNICA DEL EJRCITO Departamento de Ciencias de la Vida Carrera Ingeniera en Biotecnologacnolo CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES es integrado dentro del genoma de las plantas. La configuracin de los vectores que son utilizados en biolstica para introducir genes forneos a plantas influye tanto en la integracin como en la expresin de dichos genes. De este modo, la transformacin resulta ms eficaz cuando se usa DNA linear en vez de circular. El fragmento de DNAque se va a incorporar en el genoma de la planta es de gran tamao y va a ser introducido utilizando cromosomas artificiales de levadura (YACs), que estn diseados para contener marcadores de seleccin de la planta, as como marcadores de seleccin de levaduras. Como un sistema para verificar si la transformacin de las clulas vegetales a tenido lugar, distintas cantidades de DNA obtenidas de Cochliobolus heterostrophus son clonadas en el vector, de modo que la talla del YAC ser de 80 a 550 kb. Posteriormente, el vector con el DNA del hongo ser transferido a las clulas vegetales. Aquellas clulas transformadas resistentes al antibitico kinamicina sern aisladas. Se confirmar posteriormente la presencia en estas clulas del segundo gen marcador, el cual va a conferir resistencia al antibitico higromicina, y que se encuentra localizado en el otro brazo del vector YAC. La presencia de ambos genes marcadores en las clulas transformadas indican que el vector completo, as como el DNA forneo presente en el mismo, ha sido transferido de forma eficaz. Microinyeccin: Se refiere a la inyeccin de DNA en el ncleo celular, permitiendo la transferencia gnica a una clula concreta, compartimientos celulares. La clula continuar su desarrollo y el transgn expresado lo har tambin en su progenie. Esto constituye una poderosa herramienta para analizar la expresin gnica diferencial en distintos tipos celulares y para elmarcaje de clulas en el estudio de morfognesis vegetal. La dificultad para la microinyeccin se debe a la presencia de la pared celular. Macroinyeccin: Se refiere a la inyeccin de DNA en el interior de cavidades que contienen meristemos u rganos sexuales de la planta. La metodologa de esta tcnica es sencilla: la solucin que contiene el plsmido de DNA ser inyectado en la cavidad que rodea la inflorescencia en desarrollo. El inconveniente es que ser necesario utilizar una gran cantidad de plsmido. La potencial ventaja de esta tcnica es por tanto su simplicidad, ya que puede ser utilizada en todas las plantas sin necesidad de la preparacin de cultivos tisulares. Actualmente no existen evidencias de que la macroinyeccin sea una tcnica reproducible para la transformacin de plantas. Electroporacin: El principio de esta tcnica de transformacin se basa en el conocimiento de que la aplicacin en la membrana celular de pulsos elctricos cortos y de alto voltaje hace que en esta aparezcan, de forma temporal, poros que van a permitir la entrada en el interior de la clula de macromolculas presentes en la solucin extracelular. Los poros van a crearse en el componente lipdico de la membrana, por lo que tras el tratamiento, la membrana volver a su estado normal. Este proceso permite a las clulas suspendidas en un tampn con plsmidos de DNA incorporar al interior celular el ADN tras la electroporacin, resultando en una trasformacin transitoria o estable Electroporacin de polen y microsporas: Tras la electroporacin, existen dos mtodos para la obtencin de las plantas transgnicas: la induccin de la andrognesis in vitro en la se a conseguido llevar a cabo la integracin transitoria del transgn, pero de momento no ocurre la integracin permanente del mismo; y la utilizacin del polen transgnico para la fertilizacin normal de las plantas que aunque se han conseguido la integracin del transgn, no se ha conseguido evidencias de la transmisin de este a la progenie y la reproducibilidad del mtodo resulta complicada. Ultrasonidos o Sonicacin: Es un mtodo fsico para la transferencia de plsmidos de DNA a protoplastos y clulas intactas. Esta tcnica se basa en la aplicacin se ondas de ultrasonido que van a crear, en primer lugar, la formacin de burbujas, con la consecuente generacin de elevada presin y temperatura. Los ultrasonidos van a provocar la generacin de corrientes alrededor de las burbujas. La velocidad de estas corrientes estar relacionada con el efecto que va a

ESCUELA POLITCNICA DEL EJRCITO Departamento de Ciencias de la Vida Carrera Ingeniera en Biotecnologacnolo CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES producir el tratamiento con ultrasonidos; de forma general, el tratamiento fuerte con ultrasonidos se asocia con la inhibicin de la sntesis de polisacridos y protenas, as como con la destruccin de algunas macromolculas. El plsmido de DNA es transferido al medio de sonicacin , en el cual se encuentran ya resuspendidas previamente las clulas de inters. La mezcla es tratada con pulsos de ultrasonidos de una intensidad que previamente ha sido seleccionada y de una duracin que va a depender fundamentalmente del tipo de clula. El factor ms importante que afecta a la entrada de DNA en la clula mediante sonicacin es la composicin del medio de sonicacin as como la cantidad de plsmido. La desventaja es que las ondas de ultasonidos pueden causar dao en las clulas a causa de la elevada temperatura que produce, limitando el uso de esta tcnica. Transformacin gnica mediante lser: Este mtodo se basa en llevar a travs del objetivo pulsos de luz de alta energa a las regiones del tejido diana de menos de 1mm de dimetro. Esta tcnica resulta muy til para manipular componentes celulares y orgnulos, porque el rayo puede ser dirigido directamente a esta rea seleccionada. Con el lser, agujeros de dimensiones definidas pueden ser creados en la pared y membrana celular, permitiendo la entrada pasiva de DNA a travs de los al interior de la clula. Este mtodo comienza introduciendo agregados de cultivos en suspensin o explantos de tejidos en un medio hipertnico durante 1-3 horas, lo que va a inducir que las clulas situadas en la zona exterior de los agregados se plasmolicen hasta el 80-90% de su volumen total. Despus, los cultivos son filtrados y trasladados a una cmara de cultivo. El DNA, disuelto en medio lquido es aadido a las clulas, las cuales son inmediatamente irradiadas con el lser. Las clulas pre-plasmolizadas, cuando son introducidas en el medio hipotnico que contiene el DNA, introducen rpidamente el DNA a travs de las perforaciones hechas por el lser. Transformacin mediada por polen El objetivo del mtodo es que el DNA sea transportado durante la fecundacin al interior de los vulos, pues eneste estado el DNA tiene ms posibilidades de ser integrado. Un ejemplo fue la obtencin de la transformacin de maz dada porque el plsmido deDNA con el gen nptII fue aplicado a las flores tras la polinizacin. La transformacin fue confirmada por existencia a antibiticos o Southern Blot. Transferencia gnica por inbibicin: Es un mtodo en el que se va a introducir DNA durante la inhibicin de tejidos de plantas deshidratadas. Durante la deshidratacin ocurren cambios fsicos y qumicos como la expansin rpida de la clula, la rotura de la pared, los cambios estructurales en la membrana, etc., que sugieren que en estas condiciones el DNA puede ser captado. BIBLIOGRAFA: Carranza Diana, Ciencia en RED, Trasformacin de clulas vegetales, Obtencin de plantas transgnicas, [en lnea]. Disponible en: < http://ciencia-enred.uncachodeciencia.org/biologia/Transformacion%20de%20celulas%20vegetales%20obtencion%20de%20plantas %20transgenicas.pdf > [Consulta: 06 de enero de 2013].