RA 4. ALUMNO/A…………………………………………………………………………………………………………….

16/04/23

¿En qué se basa la técnica de electroforesis?

1. Lee el siguiente texto y responde:

Se denomina electroforesis a la técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en disolución

cuando se ven sometidas a un campo eléctrico. Se trata de una técnica fundamentalmente
analítica, aunque también se puede realizar con fines preparativos

Cada molécula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rápidamente una velocidad
constante al equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo eléctrico) con la resistencia al
avance (fuerza de fricción o rozamiento) impuesta por el medio en el que se desplaza.

La electroforesis de macromoléculas se realiza normalmente aplicando un volumen pequeño de la

muestra en una matriz porosa. Bajo la influencia del voltaje aplicado, las diferentes moléculas
presentes en la muestra se moverán a través de la matriz a diferentes velocidades. Al final se
podrá observar la separación de las moléculas detectadas como bandas en distintas posiciones
dentro de la matriz. La matriz puede estar compuesta por diferentes materiales. En la unidad de
electroforesis, el gel se encuentra colocado entre dos cámaras que contienen buffer. La conexión
eléctrica ente las dos cámaras es a través del gel.

a) ¿Qué significa qué se puede utilizar con fines preparativos? Explícalo y pon un ejemplo de este fin.

Cuando se menciona que la técnica de electroforesis también se puede utilizar con fines
preparativos, se refiere a que se puede utilizar para separar y purificar las moléculas biológicas de
interés para su posterior uso en experimentos u otras aplicaciones.
 Por ejemplo, se puede utilizar la electroforesis preparativa para aislar una proteína específica de
una mezcla de proteínas en una muestra.

b) ¿Qué es el buffer? ¿Qué función tiene?

El buffer es una solución que se utiliza para mantener un pH constante y proporcionar un

ambiente adecuado para la separación de las biomoléculas en la técnica de electroforesis.

2. ¿Qué factores influyen en la movilidad electroforética de una partícula ? Enumeralos y explica

cómo afecta cada uno de ellos en ésta.

La movilidad electroforética de una partícula dependerá de su carga, de su masa, del medio en el que tiene
lugar la separación y del campo eléctrico.

La carga afecta de manera que a menor concentración de cargas, la partícula tiene una mayor libertad para
desplazarse por el medio.
Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, estas se moverán y deberán ir pasando por la
malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeñas se moverán mejor, más
rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.
El medio dependerá del pH del medio. Además, los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica
negativa, que los dirigirá al polo positivo,
3. ¿En qué se diferencian los medios restrictivos de los no restrictivos? Explícalo.

Los medios restrictivos de electroforesis contienen agentes que limitan la difusión de las
moléculas, lo que permite separarlas con mayor precisión. Estos agentes pueden ser geles,
membranas o matrices que restringen la movilidad de las moléculas en función de su tamaño,
carga y forma.

Por el contrario, los medios no restrictivos de electroforesis no limitan la difusión de las moléculas
y permiten que estas se muevan libremente. Estos medios son utilizados principalmente en la
electroforesis capilar, donde la separación se realiza en una columna capilar sin ningún tipo de gel
o membrana restrictiva.
a) Haz una tabla en la que se diferencien las ventajas e inconvenientes de los tipos de
medios restrictivo.
Caracter Medios

ística restrictivos Medios no restrictivos

Tipo de Gel, membrana

Columna capilar
medio o matriz

Difusión

de
Limitada Libre
molécul

as

Separaci

ón de Precisa y
Menos precisa
molécul controlada

as

Velocida

d de
Más lenta Más rápida
separaci

ón

Tipos de Electroforesis Electroforesis capilar

electrofo en gel
 resis

Gel de agarosa, Electroforesis capilar de zona,

Ejemplo
gel de electroforesis capilar de
s
poliacrilamida isoelectroenfoque

4. Observa las siguientes imágenes:

a) Identifica el tipo de electroforesis.

Electroforesis en capilar y la otra

en gel.

b) Explica hacia dónde migran las

moléculas. Los cátodos se dirigen

hacia el polo negativo, mientras

que los ánodos se dirigen hacia el

polo positivo, Los ánodos al ser más grandes se desplazan más lentamente.

c) Indica las ventajas e inconvenientes de ambos tipos.

Electroforesis en gel:
Ventajas:

- La separación es altamente controlada, lo que permite una separación precisa de moléculas según

su tamaño y carga.

- Se pueden utilizar diferentes tipos de geles, como agarosa o poliacrilamida, para separar

diferentes tipos de moléculas.

- Los geles son relativamente económicos y fáciles de preparar en el laboratorio.

- Permite la visualización de las moléculas separadas mediante tinción o transferencia a una

membrana.

Inconvenientes:

- La velocidad de separación es relativamente lenta debido a la naturaleza restrictiva del gel.

- La reproducibilidad de la separación puede ser variable, lo que puede dificultar la comparación

entre diferentes muestras.

- Es difícil separar moléculas muy grandes debido a las limitaciones del tamaño del poro del gel.

- La sensibilidad de la detección puede ser limitada debido a la tinción del gel.

Electroforesis capilar:
 Ventajas:

- La separación es rápida y eficiente debido a la naturaleza no restrictiva de la columna capilar.

- Es posible separar una amplia gama de moléculas, desde pequeñas moléculas hasta

macromoléculas.

- La sensibilidad de la detección es alta debido a la naturaleza no tóxica de la detección basada en

fluorescencia.

- La separación es altamente reproducible, lo que permite la comparación de muestras entre

diferentes experimentos.

Inconvenientes:

- Requiere equipos especializados y costosos.

- La preparación de las muestras puede ser más compleja que en la electroforesis en gel.

- Las condiciones de separación pueden ser más difíciles de optimizar que en la electroforesis en

gel.
- No permite la visualización directa de las moléculas separadas, lo que requiere técnicas

adicionales de detección.

5. Después de ver el vídeo (núm 1)que explica la técnica de electroforesis.

Responde:
-Indica todo el equipamiento y los pasos que va realizando.

1. Preparación del gel: Preparar el gel de agarosa disolviendo la cantidad adecuada en un tampón de

electroforesis. Se agregará un agente intercalante de ADN, como el bromuro de etidio, para

visualizar las moléculas en el gel.

2. Preparación de la muestra: Mezclar la muestra con un tampón de carga que contenga un agente

reductor. Calentar la mezcla a 95-100°C por unos minutos para desnaturalizar las proteínas y

desdoblar el ADN.

3. Carga de la muestra: Cargar la muestra en los pocillos del gel con una micropipeta y tomar

precaución para no romper el pozo. Añadir un marcador de peso molecular, para poder

determinar el tamaño de las moléculas en la muestra.

 4. Electroforesis: Colocar la cámara de electroforesis en el aparato que permita aplicar una corriente

eléctrica a través del gel. Asegurarse de que las puntas del gel y de la cámara de electroforesis

estén sumergidas en el tampón de electroforesis para evitar la evaporación. Aplicar una corriente

eléctrica a baja intensidad, según el tamaño del gel y el tipo de moléculas que se estén separando.

5. Tinción y visualización: Una vez que la electroforesis ha finalizado, teñir el gel con una solución de

bromuro de etidio. Exponer el gel a una fuente de luz UV para visualizar las bandas de ADN.

6. Análisis de los resultados: Analizar las bandas de ADN obtenidas en el gel y comparar con el

marcador de peso molecular para determinar el tamaño de las moléculas. Se pueden utilizar

programas informáticos para analizar las imágenes del gel y cuantificar las bandas.

- Con ayuda de éste explica paso por paso el siguiente dibujo.

1. Se le añade el gel de agarosa a la cubeta de electroforesis

2. Se le añade el gel de agarosa hasta que se enfríe

3. Las distintas muestras de ADN se le añaden a los distintos pocillos

4. Las distintas muestras se desplazan al añadirle una corriente eléctrica, las distintas bandas de ADN

se desplazan hacia los polos positivos.

- Explica también los pasos para preparar el gel.

1. Pesar la cantidad adecuada de agarosa según la concentración que se desee obtener.

2. Agregar la agarosa a un matraz de vidrio y agregar el tampón de electroforesis que se va a

utilizar. Es importante que el tampón de electroforesis contenga una cantidad adecuada de

iones, como el tampón TAE o el tampón TBE, para que la electroforesis funcione

correctamente.

3. Calentar la mezcla en el matraz en un microondas o en un baño de agua caliente hasta que

la agarosa se disuelva por completo. Si se utiliza un microondas, es importante calentar la

mezcla por intervalos cortos y removerla con frecuencia para evitar que se sobrecaliente.

4. Dejar enfriar la mezcla a unos 55-60°C para que no dañe las muestras a cargar.

5. Añadir cualquier aditivo adicional, como colorante o un agente intercalante de ADN, como

el bromuro de etidio, en la cantidad adecuada.

 6. Verter la solución de agarosa en una bandeja de gel y dejar enfriar hasta que se solidifique.

-Que sucedería si colocásemos tampón en lugar de agua destilada en la solución de la cuba o en la

del gel?

Si se utilizara tampón en lugar de agua destilada en la solución de la cuba o en la del gel, se estaría

alterando el pH de la solución y se podría afectar la separación de los componentes de la muestra

en la electroforesis.
6. Observa la siguiente imagen. Explica qué describe y razona dónde debe situarse una
biomolécula que tenga carga negativa cerca del cátodo ó ánodo.

Se trata de de una película donde se pueden visualizar las bandas de ADN, por el cuál este ha
andado desde el polo negativo hasta el polo positivo, una carga negativa deberá situarse cerca del
ánodo para que pueda correr hacia el cátodo.
6. ¿Qué inconveniente tiene utilizar el bromuro de etidio?

Es altamente tóxico, puede causar irritación en la piel y los ojos, y es un carcinógeno conocido.

7. Realiza la práctica de CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL .