5991-8064ES Agilent CE Hardware

Fundamentos de la
electroforesis capilar
Exclusivamente para fines educativos

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© Agilent Technologies, Inc. 2016
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Introducción
¿Para qué se utiliza la CE?
La electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación que permite analizar y
detectar de forma cualitativa y cuantitativa moléculas tanto pequeñas como grandes.
Con frecuencia se acopla a un espectrómetro de masas.
Tiene una amplia variedad de aplicaciones; aquí se muestran algunos
ejemplos:
• análisis de cationes/aniones
• compuestos polares (p. ej., fármacos básicos)
• productos naturales en matrices complejas
• análisis de compuestos quirales e isoméricos
• caracterización de proteína (p. ej., anticuerpos)
• análisis de péptidos, ADN, ARN, oligonucleótidos
• interacciones moleculares (p. ej., proteína-ADN)

Solo para uso en investigación. Prohibido su uso en procedimientos diagnósticos.
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Introducción
¿Para qué se utiliza la CE?
La versatilidad de la electroforesis capilar viene dada por sus numerosos modos de
funcionamiento.
Modos de funcionamiento
Separación basada en diferencias en velocidad zonal.

• Electroforesis capilar en zona (CZE)
Elución
• Cromatografía electrocinética micelar (MEKC)
• Electrocromatografía capilar (CEC)
Separación basada en el movimiento a través de una fase
Tamizado molecular estacionaria o inmóvil (gel) en función del tamaño y la forma.
• Electroforesis capilar en gel (CGE)
Separación mediante movimiento a través de un gradiente de pH

Enfoque isoeléctrico capilar (CIEF)
estacionario en el tampón de análisis.
Separación basada en un gradiente de campo eléctrico móvil desde

el electrolito frontal al terminal, lo que provoca que todas las
Isotacoforesis capilar (CITP)
moléculas de la muestra se muevan como zonas conectadas con
concentración constante a la misma velocidad.

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Introducción
La versatilidad de la CE
Electroforesis capilar en zona (CZE)
La CZE es la forma más sencilla de CE. En la CZE, se llena un
capilar con un electrolito (tampón de análisis), la muestra se
introduce en el inyector y se aplica el campo eléctrico.
Cromatografía electrocinética micelar (MEKC)

La MEKC (híbrido entre electroforesis y cromatografía) es un
modo de CE muy utilizado para productos biofarmacéuticos y
moléculas pequeñas. Es la única técnica electroforética que se
puede emplear para la separación de solutos tanto neutros como
cargados.
Electrocromatografía capilar (CEC)

La CEC es una forma de cromatografía de líquidos miniaturizada
que utiliza un campo eléctrico para bombear líquido a través de
una columna cromatográfica empaquetada mediante EOF, lo que
proporciona un número de platos muy elevado.

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Introducción
La versatilidad de la CE
Electroforesis capilar en gel (CGE) Isotacoforesis capilar (CITP)
La CGE es ideal para separaciones de La CITP es una técnica electroforética de

macromoléculas basadas en los tamaños “límite móvil”, en la que se emplea una
(proteínas, ácidos nucleicos). Durante la combinación de dos sistemas de tampón
migración de los solutos cargados a través de la para crear un estado en el cual los solutos se
red del polímero, estos se ven obstaculizados, mueven como bandas independientes pero
los solutos voluminosos en mayor medida que los conectadas, y a la misma velocidad. Las
más pequeños. El ADN y las proteínas saturadas zonas permanecen entre los denominados
con SDS no se pueden separar sin gel debido a electrolitos frontal y terminal. Se pueden
que la relación masa/carga es invariable. analizar cationes o bien aniones.
Enfoque isoeléctrico capilar (CIEF)

El CIEF es una técnica electroforética de “alta
resolución” utilizada para separar péptidos y
proteínas basándose en su punto isoeléctrico.

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Introducción
¿Qué aspecto tiene un electroferograma?
A diferencia de los bloques de gel, el resultado de un análisis CE produce un
electroferograma.
Migración diferencial de solutos superpuesta en flujo

electroosmótico en la CZE. El analito catiónico (1) es el que
posee la mayor movilidad, seguido de los neutros (n) y los
dos analitos aniónicos (2, 3).

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Instrumentos
Introducción de muestras
En la CE, se cargan únicamente volúmenes de muestra diminutos (normalmente de
1 a 50 nl) en el capilar para evitar la sobrecarga de muestra.
Los métodos de inyección más frecuentes:
• Hidrodinámico
- Aplicación de presión en el extremo de inyección del capilar y vacío en el
extremo de salida
- Mediante la acción sifón conseguida elevando el cartucho de inyección
respecto del cartucho de salida
• Electrocinética (electromigración)
- Sustitución del cartucho de tampón del extremo de inyección por el vial de
muestra y aplicando la tensión

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Instrumentos
Muestreador automático
Muestreador automático termostatizado

para viales de muestra y tampón.
Al girar el carrusel, el vial de

muestra de interés se mueve a la
posición de inyección.
Un sensor de viales lee las

posiciones de bandeja ocupadas.

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Instrumentos
Capilar y casete
Detector
El capilar se instala en el casete

que se inserta en el sistema, justo
delante del detector.
Los extremos del capilar

van a los viales
Interfaz de alineación con ventana
de detección de autoalineamiento
Capilar enrollado

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Instrumentos
Capilar
En función de la aplicación, hay disponibles diferentes capilares.
Características
Los capilares CEP contienen un revestimiento polimérico permanentemente ligado
• Prevención de adsorción de la muestra.
Revestidos de CEP
• Eliminación de EOF (prácticamente).
• Se recomienda para la separación de ADN, aniones, y ácidos orgánicos.
Los capilares revestidos de PVA contienen una capa de alcohol polivinílico
permanentemente adsorbida.
Revestidos de PVA • Reducción de soluto hidrofóbico y electrostático/interacción con la pared.
• Eliminación de EOF.
• Se recomienda para análisis de proteínas y aminas.
Los capilares µSIL se revisten permanentemente utilizando procesos de reticulado
patentados para enmascarar los grupos silanol activos y proporcionar una elevada
µSIL-DB
estabilidad.
µSIL-WAX
• EOF reducido, para el modo cIEF.
µSIL-FC
• Recomendado para biomoléculas tales como fragmentos de PCR, proteínas,
péptidos, separación de carbohidratos.
Sílice fundida sin tratar Capilar de CE estándar sin revestimiento interior

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Instrumentos
Detección
Detector de array de diodos UV/VIS

integrado (190-600 nm)
Lámpara de deuterio
El detector tiene la temperatura

controlada

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Instrumentos
Detección UV/VIS
La absorción UV-visible es la detección más usada, debido a sunaturaleza
universal y a la detección en el capilar.
La absorbancia se relaciona con la concentración
mediante la ley de Beer-Bouguer-Lambert:
Paso de Luz
Capilar
e coeficiente de extinción o
absorción molar (lmol-1cm-1)
b paso óptico (cm)
c concentración Alineamiento
Férrula
El paso óptico corto (b) es el factor que más limita la sensibilidad

en la CE. Hay disponibles diseños de celdas de flujo con paso
óptico extendido (celda en Z y de burbuja; consulte la imagen).

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Instrumentos
Detección espectroscópica absorción ultravioleta (UV)
• Se dirige un haz de luz ultravioleta de
forma que atraviese una celda de flujo;
un sensor mide la luz que pasa a
través de la celda.
• Si un compuesto se eluye del capilar
que absorbe esta energía lumínica, la
cantidad de energía lumínica que llega
hasta el sensor cambiará.
Esquema de un detector de array de diodos (DAD)
• El cambio producido en la señal
eléctrica se amplifica y se dirige hacia
un sistema de registro o de datos. • Otras opciones:
• En ocasiones también se genera un - Detector selectivo de masas (MSD)
espectro ultravioleta, lo que puede - Detector de fluorescencia inducida por láser
ayudar a identificar un compuesto o (LIF)
una serie de compuestos. - Detector de conductividad sin contacto (CCD)

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Instrumentos
Sistema de reposición
La reposición de tampón es una parte integral
para el mantenimiento de una elevada
reproducibilidad del tiempo de migración La
electrolisis de una disolución puede alterar el pH
del tampón y, en consecuencia, alterar el EOF.
El sistema de reposición (cartucho
de tampón) se encuentra por
debajo del carrusel de muestra.
Mejora de la reproducibilidad en el tiempo de migración

utilizando reposición de tampón. Superposición de análisis
5, 10 y 15. A) reposición después de cada 5 análisis. B) sin
reposición.

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Abreviaturas
Abreviatura Definición Abreviatura Definición

b Paso óptico MEKC Cromatografía electrocinética micelar
c Concentración MS Espectrometría de masas
CE Electroforesis capilar nl Nanolitro
CEC Electrocromatografía capilar PVA Alcohol polivinílico
CEP TOF Tiempo de vuelo (espectrometría de

Polímero de polietileno entrecruzado
masas)
CGE Electroforesis capilar en gel
CIEF Enfoque isoeléctrico capilar
CZE Electroforesis capilar en zona
CITP Isotacoforesis capilar
EOF Flujo electroosmótico
(electroendoosmótico)
e Coeficiente de extinción o
absorción molar (lmol-1cm-1)

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Separación basada en diferencias en velocidad zonal.

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Cromatografía electrocinética micelar (MEKC)

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Al girar el carrusel, el vial de

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El capilar se instala en el casete

Los extremos del capilar

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Detector de array de diodos UV/VIS

El detector tiene la temperatura

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El paso óptico corto (b) es el factor que más limita la sensibilidad

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Mejora de la reproducibilidad en el tiempo de migración

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Abreviatura Definición Abreviatura Definición

CEC Electrocromatografía capilar PVA Alcohol polivinílico

CEP TOF Tiempo de vuelo (espectrometría de

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