Bioseparaciones

Dra. Sonia Herrera Monroy

Datos generales del docente

Dra. Sonia Herrera Monroy

Correo electrónico: sonia_herrera@uaeh.edu.mx

Celular: 553 605 4057

 Evaluación Parcial

• Autoevaluación 5%
• Coevaluación 10 %
• Tareas y trabajos 20 %
100 %
Heteroevaluación • Prácticas de laboratorio 20 %
• Exámenes 60 %
Tareas y trabajos para entregar:
Sonia Herrera Monroy
LIB, semestre 7
Fecha:

• Hojas recicladas o blancas. TAREA X:

TITULO DE LA TAREA

• A mano o computadora.
• Nombre completo, carrera y semestre, fecha
(esquina superior derecha).
• Número de tarea y nombre de la misma
(centrada, con negritas). Literatura Consultada
• En caso de revisar literatura; colocar citas y •
bibliografía de acuerdo al formato APA. •
•
Prácticas de laboratorio
• Viernes 8:00-11:00 Laboratorio de Física (8 agosto)
• Fecha de entrega: una semana después de llevarla a cabo
• Portada con nombre de la escuela, carrera, nombre y número de practica,
integrantes del equipo, fecha de entrega.
• Introducción elaborada por el equipo
• Objetivos
• Desarrollo de la práctica (si incluyen fotos, imágenes, cuadros… nombrar e
indicar en texto según formato APA)
• Respuestas de cuestionario con discusión sustentada en literatura y citada
(APA)
• Referencias bibliográficas consultadas (formato APA)
 Contenido temático

UNIDAD 1.Situaciones especiales de las fermentaciones

UNIDAD 2. Procesos de separación

UNIDAD 3. La estructura de las redes metabólicas

UNIDAD 1. Situaciones especiales de las
fermentaciones.
1.1. CONCEPTOS BÁSICOS.
• Los bioprocesos pertenecen a procedimientos de la biotecnología
donde se utilizan células vivas o alguno de sus componentes para
desarrollar productos de interés antropogénico.

Ejemplo: Uso de levaduras para producir alcohol

• Estos comprenden la producción de metabolitos primarios y
secundarios.

Primarios: aminoácidos, nucleótidos, vitaminas, Secundarios: antibióticos, hormonas,

solventes, ácidos orgánicos glicopéptidos.

• También la biotransformación para la producción de derivados de

metabolitos o células.
• De esta manera los bioprocesos se dividen en dos:

1) Operaciones previas (up stream)

 Preparación del medio
 Esterilización
 Preparación y funcionamiento del biorreactor

2) Operaciones posteriores (Down stream)

 Todas aquellas operaciones, reacciones y tratamientos que requiere el medio
de cultivo para la obtención del producto, en condiciones de pureza y
actividad deseada.
• Dentro de las operaciones posteriores encontramos a las
bioseparaciones.
Ejemplo: Proceso de obtención de
“Leche búlgara”

• Se usan búlgaros (colonias de

bacterias Lactobacillus acidophilus y
levaduras Kluyveromyces marxianus)
creciendo el leche.

• Se alimentan de lactosa y la
transforman en ácido láctico, alcohol
y.
• Algunos factores a considerar para el desarrollo de bioseprarciones
son:

Tipo de producto a obtener.

Naturaleza del material inicial.
Localización del producto (inter o extracelular).
Forma física y pureza.
Cantidad o volumen disponible.
Rentabilidad del proceso.
• En general se consideran cuatro operaciones básicas dentro de las
bioseparaciones y se conocen como RIPP:
TIPO MÉTODO PROPIEDAD DEL PRODUCTO
• Filtración Tamaño
Recuperación • Centrifugación Tamaño
• Rompimiento celular Estructura celular
• Extracción Distribución entre fases
Concentración • Adsorción Sorción superficial
• Destilación Presión de vapor
• Cromatografía Fases estacionarias
• Precipitación Solubilidad
• Ultrafiltración Tamaño molecular
Purificación o aislamiento • Osmosis inversa Difusibilidad y solubilidad
• Electroforesis Carga eléctrica y movilidad
• Diálisis Difusibilidad
• Electrodíalisis Carga eléctrica y movilidad
• Cristalización Punto de fusión o solubilidad
Acabado
• Secado Temperatura y humedad
• Momento de leer aplicaciones prácticas
1.2. CÉLULAS
1.2.1. Bacterias y consorcios microbianos

• Las bacterias son células procariotas, consideradas cosmopolitas

• Aparecieron en el planeta Tierra desde hace aproximadamente 3 500
millones de años
Morfología celular bacteriana
• La forma de las células bacterianas esta determinada por la rigidez de
su pared celular
• Se pueden distinguir cuatro tipos de formas básicas al microscopio:
a) Cocos
b) Bacilos
c) Espirilos
• Comas
• Espiroquetas
• Vibrios
d) Pleoformas
• La rigidez de su pared les permite
mantenerse unidas después de la
división celular, pero conservando
su independencia.

• Cuando muchas células,

provenientes de la división de una
sola, están compartiendo el
mismos espacio físico, se
conforma una colonia bacteriana.
• Bacilos
Pseudomona (bordes irregulares)

Ralstonia solanni (puntiforme)

• Además de las formas celulares y de las colonias que estas forman,
existen diferencias en la fisiología bacteriana.
• Encontramos dos principales diferencias: Gram (+) y Gram (-)
• En G(-) la pared es una
• La pared
capa de de
2 auna G(+) es una
7 nm,
capa homogénea
compuesta por de 20 a
80 nm de grosor,
Lipopolisacaridos que por
compuesta
rodean a una membrana
peptidoglicanos o varias
externa
capas de ymureína,
protegenademás
a la
contiene
célula deuna gran cantidad
esterilización.
de ácido teicoico y
lipoteicoico.
• Después de la capa
externa, encontramos al
• Ambos compuestos
periplasma, se usan
que contiene
para diferenciar
enzimas especies
hidrolíticas para
bacterianas, pues hay
transformar
diferencia en tipo de estos.
macromoléculas en
productos metabolizables
y peptidoglucanos
• La cápside o capsula es un componente vital, pues protege a la célula
de fagocitosis y le confiere virulencia, esta puede ser lisa o mucoide.

• Esta compuesta de proteínas y

polisacáridos y una vez que la bacteria
la pierde, también pierde su
virulencia.

• Otras estructuras de interés son los

pillis o fimbrias, que brindan
mecanismos de adherencia, además
les permiten el intercambio de
material genético (conjugación).
• Los flagelos son filamentos proteicos
helicoidales delgados y rígidos,
compuestos por flagelina que
confieren a las bacterias motilidad
(casi siempre horizontal).
• También funcionan como órganos de
reconocimiento y regulación génica
par detectar quimioatrayentes.
• Son sintetizados por los ribosomas
cuando las necesidades nutricionales
o estado energético de la bacteria lo
demanda.
Nutrición bacteriana
• Las bacterias se han adaptado a una gran variedad de ecosistemas,
por lo que su forma de obtener nutrimentos se ha modificado.

a) Bacterias fotoautótrofas:

• Su color va del naranja al marrón, rojo y púrpura, pues contienen

carotenoides, así como bacterioclorofila a y b.
• Son aerobias y habitan ambientes azufrados.

Bacterias purpureas del azufre

b) Bacterias fotoheterótrofas:

• Son aerobias y habitan ambientes no sulfurosos

• Son parecidas en color a las fotoautrótofas, pero estas se alimentan
por fagocitosis de moléculas orgánicas.

Ejemplo: Rodospirillum y Cloroflexus

c) Bacterias quimioautótrofas:

• Utilizan compuestos inorgánicos reducidos como fuente de energía y

el como fuente de carbono.
• Su importancia es que aportan nutrimentos al suelo que son utilizados
en la agricultura.

• Por ejemplo: las bacterias Nitrobacter hacen disponible el nitrógeno

pues oxidan y

Thiobacillus ferroxidans, hacen disponible el Fe

D) Bacterias quimioheterótrofas:

• Utilizan compuestos químicos como sacarosa o almidón.

• La mayor parte de las bacterias cultivadas en laboratorio o patógenas

son de este tipo.
Reproducción bacteriana
• Las bacterias generalmente se reproducen por bipartición
Reproducción parasexual
• Este tipo de reproducción implica el intercambio de
fragmentos de ADN por mecanismos de transferencia
horizontal de genes (HTG).
• Los fragmentos de ADN intercambiados son elementos
genómicos móviles como:

Plásmidos
Elementos integrativos- conjugativos
Transposones (genes saltarines)
 cromosomas (por medio de bacteriófagos)
Estos se transfieren por tres mecanismos:
• Transformación
- Una célula bacteriana absorbe
material genético exógeno, lo
incorpora y expresa.

- El material genético esta en el

ambiente y se introduce a través de
la membrana.

- Para que ocurra, la bacteria debe

estar estresada o en estado de
competencia.
• Conjugación
- Una bacteria donadora (), transmite un fragmento de ADN de su
plásmido a una bacteria receptora ().

- El intercambio ocurre a través de un pilli sexual y para que ocurra,

las bacterias deben ser de la misma cepa o filogenéticamente
próximas.
• La conjugación es más común en gram negativas (G-), pues en las gram
positivas (G+) no hay pillis, pero puede ocurrir cuando estas contienen
adhesinas.
• También puede ocurrir que la bacteria transfiera todo el plásmido y se
convierta en
• Dentro del proceso de conjugación hay una variante llamada
conjugación de alta frecuencia (Hfr).
• En ella, cepas de alta homología intercambian información por medio
de la integración de plásmidos completos o en fracciones,
directamente a cromosomas de una
• El plásmido se integra al cromosoma
y ambos se replican en una sola
unidad.
• Ahora habrá una célula , pero con
nueva secuencias que confieren
características adaptativas.
• El plásmido que se conjuga, es
llamado, episoma.
• Transducción
- Ocurre a través de un fago lítico que infecta bacterias y en el ciclo
lisogénico recombina su ADN con el de la bacteria lisada y otras que
infecto anteriormente.
- El fago funciona como un vector
intermediario.

- Existen fagos específicos para géneros

bacterianos, por lo que debe ocurrir
reconocimiento fago-bacteria.

- Este se da por señalizaciones de la pared

bacteriana gracias a los tipos de ácidos
teicoicos en G+ y lipopolisacáridos en G-
• Otros mecanismos de cambio genético

- Mutación: no hay intercambio genético, pero se modifica por sustitución de

nucleótidos, inversión, traslocación, duplicaciones, deleciones o adiciones
durante el proceso de copiado.
- Este mecanismo también se
considera HGT, pero este puede
ser reversible en condiciones de
humedad, temperatura, nutrición,
etc.
- Es decir, cuando hay reversión de
fenotipo, la bacteria se deshace
de secuencias y puede perder
virulencia.
Mecanismos de protección
• Además de la ganancia o pérdida de material genético, existen
mecanismos con los que las bacterías se protegen del estrés
ambiental.
• Formación de biofilm: es un conglomerado de células delimitadas en
una matriz de polisacáridos, polímeros orgánicos, así como ADN y
proteínas bacterianas.
• Quorum sensing: mecanismo de
comunicación bioquímica coordinada
célula- célula, donde se expresan
caracteres genéticos en una densidad
poblacional alta, para secretar
autoinductores y sobrevivir.
• Los biofilm son el hábitat primario para las bacterias en la naturaleza y
en artificiales.
• Su función física es de protección a estrés del medio ambiente y
antibióticos, así como interacción con defensas de hospederos.
• Se relaciona con ocurrencia de enfermedades y su eliminación es muy
difícil.
• Este mecanismo es el responsable de la persistencia de bacterias aun
después de procesos de desinfección.
• Etapas de la formación de biofilm
1)
5) Adhesión:
Maduraciónse y secretansalida desustancias
células
químicas y se reconocen por bacterias
para
4) Formación
enformar
un procesonuevo
dedecanales:
biofilm:secuando
“censado”. produceel
biofilm
la diferenciación
alcanzacelular un de espesor
2) División celular y formación de
la zona
determinado,
basal y la apical
colonias: ocurre
iniciadel mismo.
diferenciación
la formación de micro
de colonias
las células quededirigen
la zona y apical
regulandella
formación
mismo
Ocurre lisis de de unaqueestructura
células, mueren
portridimensional.
Éstas la células
falta deseoxígeno
desprenden
y nutrientes,
de la
3) Secreción:
matriz
después dese aexopolímeros,
travéscanales
crean de la síntesis
para
si sonde
la
polisacáridos extracelulares, proteínas
flageladas
recircularización
comienzan
y ácidos nucleicos del(ADN
medio
ay ARN).
moverse
de cultivoy
migran
permitiendo
hastala nutrición
alcanzar del
un biofilm
nuevo
soporte
en todas sus
al capas
quecelulares.
se adhieren
El proceso es regulado por quorum
reiniciando el proceso
sensing
Aislamiento bacteriano
• El aislamiento, identificación y conservación-multiplicación son
procesos importantes para obtener metabolitos de interés.
• Los mecanismos más utilizados son:
a) Aislamiento directo de tejido/sitio sintomático
b) Macerado de tejido/muestra
c) Punción
d) Inmersión de muestra en buffer o agua estéril
e) Siembra directa en medio de cultivo (agar ó medio especifico)
• Posterior al aislmiento-purificación, se debe garantizar la
homogeneidad genética de la cepa y así identificar de qué unidad
taxonómica se trata.
• Para esto se realizan identificaciones mediante pruebas químicas
(siembras en medios específicos) o secuenciación del gen 16 s
(conservado dentro de taxones, pero distinto entre ellos).
• El gen 16 s tiene 9 regiones hipervariables (OTU´s) que se usan para
distinguir entre organismos.
• Para definir especies se acepta 97 % de similitud entre secuencias del
16 s y mayor a 70 % de hibridación ADN-ADN.
1.2.2 HONGOS
• Los hongos surgen a partir del grupo Opisthokonta desde hace 1080-
890 millones de años.
• Son seres cosmopolitas, unicelulares o pluricelulares.
• Se ubican en el reino Eukarya, pero recientemente se han agrupado
en tres taxones, ampliando el concepto “hongo” a “organismo
fungoso”:

a) Fungi o Eumycota
b) Amoebozoa
c) SAR (Stramenophiles, Alveolata,
Rhizaria), dentro de estos
Alga
grupos encontramos
oomycetes relacionados con
algas cafés, parásitos y
endoparásitos.

Hongo
• En este curso solo hablaremos de forma general de los organismos fungosos del
grupo Eumycota.
• Este reino incluye 12 phyla, tres de los cuales están bien definidos y el resto aun
se esta reclasificando:
Ascomycota
Basidiomycota
Dikarya
Blastidiomycota
Chytridiomycota
Cryptomycota
Microsporidia
Mucoromycota
Nephridiophagidae
Olpidiomycota
Sanchytriomycota
Zoophagomycota
• La gran diversidad de estos organismos obedece su gran capacidad
para habitar el planeta, sin embargo solo abordaremos las
definiciones generales que definen a un “hongo verdadero”.
• Para diferenciar un hongo verdadero de un organismo fungoso,
trataremos cinco componentes:
1) Célula
2) Fisiología
3) Cuerpo o talo
4) Reproducción
5) Relación con otros organismos y distribución
1) Célula
Es la unidad del cuerpo o talo del
hongo y al ser eucarionte posee
núcleo delimitado por membrana y
mitocondrias.
• Las células fungosas pueden ser
multinucleadas o mononucleadas.
• El núcleo a su vez puede ser
homocariotico (misma
información) o heterocariotico
(núcleos distintos, pero
compatibles), además de hapliodes
(n) o diploides (2n).
• La pared celular de los hongos esta compuesta de quitina, -glucanos,
proteínas y glicoproteínas.

β-glucanos
Glicoproteínas
Proteínas
Quitina Membrana

• La proporción de los componentes varía según la especie y el medio

donde se desarrolla el hongo.
• Las células se agrupan por divisiones mitóticas y forman hifas así
como estructuras de reproducción y dispersión.
2 ) Fisiología
• Los hongos tienen mitocondrias, por lo que
son capaces de realizar respiración aerobia,
pero también existen anaerobios.
• Son heterótrofos y se nutren por absorción
(secretan enzimas para degradar
compuestos complejos y después absorben
moléculas más simples por ósmosis).
• Son saprobios, parásitos y simbiontes.
• Si las condiciones ambientales son
adecuadas, se desarrollará siguiendo las
etapas que a continuación se presentan:
 c)Antes
Fase de reproductiva:
que el hongo algunas
llegue hifas
a la
a) Fase lag o lack: la espora
del micelio
etapa final, puede
se diferencian
entrar en un en
comienza a absorber humedad,
estructuras
estado de latencia
sexuales
con (conidioforos,
metabolismo
e a activando su metabolismo e
ascas, apotecios…)
mínimo y formar clamidosporas
iniciando la germinación.
Si las condiciones
(esporas con pared ambientales
engrosada) parason
b) Fase exponencial: la espora
desfavorables,
resistir hasta que se las condiciones
formarán
forma un tubo germinativo y se
d estructuras
mejoren. de resistencia
b ramifica formando micelio para
(esclerocios)
alimentarse. A esta etapa se le
c e) Fase autolítica: las condiciones
conoce como periodo
d) Fase estacionaria:
mínimas para quelas estructuras
el hongo
vegetativo y es cuando se
reproductivas
sobreviva desaparecen,
maduran, por se lo
liberan
que
acumula la mayor cantidad de
esporas un
ocurre y el proceso
desarrolloautolítico
del hongoy
biomasa.
cesa, pues el alimento se agota.
muerte.
• Durante el periodo vegetativo
(fase a-c) ocurren
principalmente procesos
correspondientes a
metabolismo primario
• Este se relaciona directamente
con la adquisición de
nutrimentos para producir
metabolitos primarios y
biomasa.
• Después, en las fases c-e, ocurre metabolismo secundario, donde
algunos de los productos obtenidos son:

Antibióticos (penicilina, cefalosporina de

Penicillium y Acremonium)
Toxinas (aflatoxina de Aspergillus flavus y A.
parasiticus)
Alcaloides (ergotamina de Claviceps purpurea,
ácido iboténico, el muscimol, la muscarina y la
muscazona de Amanita muscaria)
Pigmentos ( melanina, caroteniodes)
Bioluminiscencia (luciferasa de Mycena sp.)
Antifungicos (Griseofulvina)
3) Cuerpo o talo

• Se refiere a todas las

estructuras formadas a partir de
hifas.

• Las hifas son agrupaciones

filamentosas que pueden ser
septadas o no (cenocíticas).

• Pueden formar estructuras

somáticas (vegetativas= micelio)
o sexuales (cuerpo fructifero).
• El desarrollo hifal siempre es radial (formación de aros de hadas) y
conforma tejidos como:

1) Prosenquima: hifas visibles, micelio,

tejido suave.

2) Pseudiparénquima: similar al
parénquima de plantas.

3) Plecténquima: tejido compactado

Asterina spp.
4) Reproducción,
• Los organismos fungosos poseen dos tipos de reproducción, según la
etapa de desarrollo en la que se encuentren o la especie y en ambos
se producen esporas.

a) Asexual: también llamada fase

anamorfa, la formación de estructuras de
propagación ocurre por mitosis.

• Los hongos que solo se reproducen de

esta manera son llamados hongos
imperfectos
• Se forman dos principales estructuras de propagación
I) Micelio
II) Conidios o células mitospóricas
• Lo conidios se forman a partir de células conidiogénicas llamadas
fiálides y conidióforos, que son extensiones de hifa con poros.
• Por lo general los hongos asexuales son microscópicos y producen
exudados mucilaginosos donde hay conidios para su dispersión.

Ergot del sorgo

• En la reproducción asexual la
variabilidad genética ocurre por
HTG gracias al ciclo parasexual.

• Primero pueden ocurrir

mutaciones.

• Después anastomosis (intercambio

de organelos con material genético
por plasmogamia positiva).
• Para que la anastomosis provoque plasmogamia positiva, las hifas que
se entrecruzan deben ser haploides y heterocariones, pero
compatibles.

• Puede ocurrir anastomosis

negativa, entonces los núcleos
no son compatibles y se lisan.

• El ciclo parasexual es poco

común (500-100 veces menos
frecuente que meiosis)
 b) Reproducción sexual
• Los hongos que tienen este tipo de reproducción son llamados
teleomorfos y también pueden tener fase anamorfa.
• Ocurre meiosis y se pueden obtener dos tipos de estructuras (esporas):
I) Ascosporas
II) basidiosporas

Ambos tipos de esporas son

haploides (n), pero en ellas
hay recombinación genética,
pues en la meiosis se forma
un dicarion (2n)
Formación de ascosporas
 1.2.3 Célula vegetal
• Según la teoría celular (Matthias Schleiden y
Theodor Schwann), todo organismo vivo esta
formato por células.

• Por lo tanto, la célula es la unidad fisiológica y

anatómica de todo ser vivo.

• La información genética necesaria durante la

vida y para producir nuevas células, se
transmite a través de mitosis o meiosis de una
generación a la siguiente.
 • Principales diferencias entre células
Célula animal Célula vegetal Célula hongo Célula procariota

Núcleo definido -
por membrana   

Mitocondria    

Lisosomas  -  -

Vacuolas -  

Cloroplastos -  -  /-

Pared celular -   cápside

Peroxisoma -  - -
Estructura de la célula vegetal
Pared celular
• Compuesta por:
a) Pared primaria
b) Pared secundaria
c) Lamina media y plasmodesmos.

• Células sin pared celular, serán llamadas

protoplastos
 a) Pared primaria
• Es la primera en ser secretada por la plasmalema (membrana
plasmática) y solo esta presente en células en crecimiento.
• Está compuesta de celulosas, hemicelulosas, sustancias pécticas, agua y
proteínas.
• También contiene en menor proporción
lignina, suberina y cutina.
• Tiene un grosor que varía entre 1-3 μm,
y entre un 9 y un 25% de celulosa
organizada en microfibrillas.
• El arreglo de las microfibrillas le da a la pared una apariencia
cristalina, y es responsable de su resistencia debido a la fuerza de los
de enlaces de hidrógeno.
• Las pectinas son hidrofílicas, y
favorecen la extensión y flexibilidad
de la pared.

• También existen proteínas

conocidas como extensinas, las
cuales tienen un importante papel
en el crecimiento celular.

• Otras proteínas tipo lectinas actúan

en el reconocimiento de moléculas
foráneas.
• Se forma durante la telofase por transcitosis (una célula excreta
azucares por aparato de Golgi y después ocurre endocitosis).
b) Pared secundaria
• Se deposita internamente a la pared
primaria, cuando la célula ha
detenido su expansión.
• Al final de la deposición de pared
secundaria, el protoplasma
desaparece.
• Es más gruesa que la pared primaria
y consta de 41-45% celulosa, 30% de
hemicelulosa, 22-28% lignina.
• En ella se diferencian tres capas: S1,
S2 y S3
• Cada capa que forma a la pared
secundaria se diferencia entre si
por el acomodo de las
microfibrillas de celulosa y su
grosor.

• Cuando se deposita la pared

secundaria, puede ocurrir
apoptosis
Apoptosis
• Es la muerte celular programada
• La pared secundaria es rica en lignina, la cual es un polisacárido
hidrofóbico que limita la absorción de agua por el apoplasto y la
plasmalema.
c) Lamina media y plasmodesmos

• La lamina media es el espacio intercelular que existe entre las paredes

primarias de las células.
• en ella ocurre el transporte vía apoplásto.
Plasmodesmos
• Son estructuras de transporte de macromoléculas, que conectan
células vecinas. Actúan como canales en el transporte vía simplasto y
permiten el paso de azúcares, amino ácidos, nucleótidos libres y hasta
partículas virales.
•• Los
Una célula plasmodesmos
puede tener
representan
entre 1,000 a canales 10,000
recubiertos por extensiones
plasmodesmos.
de la membrana plasmática
y atravesados por segmentos
• deLas retículo
paredes primarias
endoplásmico
tienen
que una alta densidad
se proyectan de
al interior
deplasmodesmos,
otras células, y que
a estasse
extensiones
forman al delfinalizarretículola
endoplásmico así sitios
mitosis, en los forradodesela
leplaca
llama desmotúbulo.
celular atravesados
por segmentos de retículo
endoplásmico.
Simplasto y apoplasto
• Simplasto: Conjunto de protoplastos interconectados mediante
plasmodesmos, que dan lugar al transporte vía simplasto. En el
simplasto abundan lípidos, sustancias hidrófobas, orgánulos y
partículas que aumentan la viscosidad del medio.
• Apoplasto: Espacio extracelular periférico al por el que fluyen agua y
otras sustancias como , nutrimentos disueltos y sustancias de
respuesta a estrés, lo que da lugar al transporte vía apoplasto.
• Está compuesto por el espacio libre aparente, el cual contempla los
espacios libres de la pared celular, los espacios intercelulares y los
espacios en el xilema.
Membrana plasmática
• Regula el flujo de sustancias disueltas dentro y fuera de la célula.
• Es una bicapa lipídica con una parte hidrofílica y otra lipofílica.
• Existen proteínas (aproximadamente un 50% de la membrana) que
flotan en el espacio lipídico de la membrana.
• Está formada por fosfolípidos (fósforo asociado con nitrógeno, más
dos cadenas largas de ácidos grasos).
• Provee una barrera con
permeabilidad selectiva.
• Transporte de solutos: La
maquinaria de transporte de la
membrana permite a la célula
acumular sustancias, como
azúcares y aminoácidos,
necesarios para impulsar el
metabolismo y construir
macromoléculas
• También es capaz de transportar
iones específicos, con los que
establece gradientes iónicos a
través de ella misma.
 • Tiene poros nucleares que son
Núcleo grandes complejos de proteínas
(nucleoporinas) que atraviesan la
envoltura nuclear y permiten el
transporte de moléculas solubles en
agua a través de la envoltura nuclear
(ARN y polimerasas).
• La envoltura nuclear es una doble
membrana que rodea al núcleo
celular, presente en la mayoría de los
eucariontes. Evita que las
macromoléculas difundan libremente
entre el nucleoplasma y el
citoplasma.
• El nucléolo es una estructura discreta que se tiñe densamente y no
está rodeado por una membrana. El principal papel del nucléolo es
sintetizar el ARNr y ensamblar los ribosomas.
Sistema de endomembranas
• Funciona en la formación de nuevos orgánulos y la síntesis de
materiales y su transporte dentro y fuera de la célula.
• Incluye al Retículo Endoplasmático (RE), la membrana nuclear, y la
membrana vacuolar.
• La membrana plasmática es considerada como una entidad aparte,
aunque crece gracias a las secreciones de las vesículas del Complejo
de Golgi (Dictiosomas).
• Las membranas internas y externas de las mitocondrias y el
cloroplasto tampoco se consideran parte del sistema de
endomembranas.
 Retículo endoplasmático
• Sistema de membranas paralelas que semeja un saco colapsado con
capas llamadas cisternas.
• La morfología del RE le permite funcionar
• como
El RE asociado
un con muchos
sistema de ribosomas
transporte
es llamado
intercelular RE aminoácidos
de azúcar, rugoso yy ATP es
adeterminante
los sitios de uso oenalmacenamiento.
la síntesis de
• Su extensa área superficial le permite
proteínas.
distribuir enzimas.
• • Su
El RE liso tiene
asociación conpocos ribosomas.
ribosomas indica Este
que
está
tipo deinvolucrado
ER participaenen la síntesis de
el metabolismo
proteínas.
de los lípidos, oxidación de ácidos
• grasos,
Otra funciónsíntesis
del RE es de fosfolípidos,
la construcción de
laglicolípidos
membrana plasmática y la pared
y esteroides.
celular.
Dictiosoma o Aparato de Golgi

• Formado por varios sáculos

membranosos, discoides, llamados
cisternas, también denominadas cuerpos
de Golgi. Se subdivide en tres
compartimentos (cis, medio y trans)
consistentes en uno o más cisternas.
• Su función es la de recibir productos elaborados, almacenarlos,
modificarlos y transportarlos al exterior de la célula o hacia otros
lugares de las membranas. Por lo tanto, el dictiosoma es un centro de
distribución aún mayor que el RE.

• El tipo de productos que los dictiosomas reciben o transportan

depende del tipo de célula.

• En algunas células los productos pueden ser compuestos de la pared

celular, en otras podrían ser proteínas, etc.
Vacuola
• En vacuola, la membrana es más delgada que la plasmalema (7.5 nm)
y se le llama tonoplasto.
• Transporta solutos dentro y fuera de la vacuola, y por tanto, controla
el potencial hídrico de la célula (turgor celular), lo cual es muy
importante en las células guarda de los estomas.
• También participan en el almacenamiento de sustancias y la lisis.
Mitocondria
• Tienen forma oval (reniforme) y una estructura interna compleja.
• Se originan por fisión, y se heredan vía materna.
• No forma parte del sistema de endomembranas de la célula.
• Poseen su propio ADN y sintetizan parte de sus proteínas, pero a la
vez dependen de proteínas originadas bajo control nuclear.
• Son centrales energéticas.

•• Activan enzimas.mucho a células

Se asemejan
procariotas.
• Producen ATP (36-38 ATP por ciclo
• Lynn Margulis ha sugerido que las
de glicolisis a partir
mitocondrias de respiración
originalmente eran
celular).
procariotas que invadieron
células eucariotas, aunque
• En la matriz mitocondrial
actualmente dependan ocurre de
proteínas
la oxidación sintetizadas en del
(lípidos) y el ciclo el
citosolcítrico
ácido (Teoría endosimbiótica).
(azucares).

• En la membrana interna ocurre el

transporte de electrones.
 Citoesqueleto
Formado por:
• Interviene en el movimiento celular-
• Microfilamentos
movilización (actina)
de vesículas de transporte,
orgánulos y ciclosis.
• Filamentos intermédios
• • Microtúbulos
Está vinculado con(tubulina)
otros procesos como
división celular, crecimiento y
diferenciación.

• Contribuye a dar forma a la célula.

• Los microtúbulos están involucrados en

procesos de motilidad y morfogénesis.
Son estructuras tubulares largas,
rígidas, formadas por cadenas lineales
de moléculas de alfa y beta tubulina.
Plastidios / Cloroplastos
• Son orgánulos celulares propios de
las plantas y algas.
• Su función principal es la
producción y almacenamiento de
importantes compuestos químicos
usados por la célula.
• Importantes en procesos como la
fotosíntesis, la síntesis de lípidos y
aminoácidos, determinando el
color de frutas y flores, entre otras
funciones.
• Proplastos: plástidos de células jóvenes.
• Etioplastos: estructuras cristalinas en ausencia de luz
• Cromoplastos: sintetizan y almacenan pigmentos como carotenos y
xantocianinas
• Cloroplastos: realizan la fotosíntesis
• Leucoplastos: son incoloros y almacenan sustancias en células no expuestas
a luz como tubérculos y raíces
• Amiloplastos: almacenan almidón en los tejidos de almacenamiento como
cotiledones, endospermo y células de la caliptra asociadas con el
geotropismo.
• Oleinoplastos o elaioplastos: almacenan aceites
• Proteinoplastos: almacenan proteínas
• Estatolitos: pueden moverse y responden a la gravedad
 Cloroplastos
• Están en células de parénquima
empalizada o esponjoso.
• Dentro tienen estructuras llamadas
tilacoides, inmersos en el estroma.

• El estroma es el equivalente a la
membrana externa mitocondrial y el
tilacoide a la membrana interna.

• En la membrana del tilacoide ocurre la

fase luminosa de la fotosíntesis
• En el estroma ocurre la fase oscura
(acoplamiento de sustancia con C y
formación de glucosa)
 Peroxisomas
• Orgánulos pequeños (0.2 a 1.5 μm de
diámetro).

• Rodeada de membrana simple.

• Contienen enzimas como oxidadas y

catalasas, que intervienen en la
degradación de compuestos
(transforman ácidos grasos en
glúcidos).
1.2.4 Vegetales y raíces transformadas
Cultivo de tejidos vegetales

• Es un proceso en el cual piezas pequeñas de

tejido llamadas explantes se aíslan de una planta
y se hacen crecer por tiempo indefinido en
medios de cultivo.
• En plantas, este proceso es más sencillo gracias a
la totipotencia de los tejidos.
• Se prefiere el cultivo de tejidos meristemáticos y
semillas, pues son regiones con alta tasa de
división celular, donde su tamaño no permite el
establecimiento de virus, bacterias u hongos.
Raíz: meristemo apical radical protegido por la cofia o
caliptra.
Especie: cebolla (Allium cepa).
Técnica: corte en parafina y tinción con orceína acética.
Proceso del cultivo de tejidos
Cultivo de protoplastos
1) Aislamiento: Se elige un protocolo de desinfección de tejido,
según la especie y el objetivo de los protoplastos.
2) Eliminación de pared celular.

a) Métodos mecánicos: restringido a especies con grandes

vacuolas y poco tejido meristemático (plantas viejas o de
lento crecimiento)

b) Métodos enzimáticos: incubación de células en mezclas

enzimáticas (hemicelulasa, celulasa, pectinasa)
3) Purificación: consiste en separar
protoplastos sanos de tejidos no digeridos
o protoplastos rotos.

• Para ello se somete a centrifugación,

filtración y lavado para obtener una
suspensión de protoplastos.

4) Búsqueda de líneas celulares estables:

5) Cultivo en medio especializado: se
se recomienda cultiva en medios solidos y
recomiendan medios suplementados con
después subcultivar seleccionando macro y
hormonas especificas para
microscópicamente la diferenciación
característica de
o conservación (AIA, ABA, citocininas...)
interés.
• Los protoplastos pueden fusionarse dando lugar a híbridos somáticos
heterocarones (AB) y homocariones (AA).
• Una vez que se han aislado, purificado y seleccionado, los
protoplastos pueden cultivarse y diferenciarse en tejidos (o no) para
la producción de compuestos biológicamente activos:

- Cultivo de raíces de Panax ginseng productoras de saponinas

- Raíces de Brassica oleracea productoras de insulina humana
 • Lo beneficios del cultivo de tejidos vegetales son:

- Suministro planificado de acuerdo a la demanda.

- Independencia del clima, suelo, enfermedades y
problemas ambientales.
- Optimización de recursos en el proceso de cultivo.
- Cortos periodos de tiempo de siembra a cosecha.
- Obtención de diferentes productos en un espacio
pequeño y usando las mismas instalaciones.
- Mejores condiciones para la extracción y
purificación.
• Algunas desventajas del cultivo del cultivo de tejidos son:

- Baja productividad por unidad (cuando se

trabaja con callos celulares o cultivos en
suspensión).
- Pérdida de capacidad para producir metabolitos
secundarios (por no expresión de genes).
- Mutaciones de tejidos.
- Costo de insumos.
- Dificultades técnicas.
• El cultivo de raíces para la producción de metabolitos secundarios es
preferida pues ofrece los beneficios del cultivo de tejidos, pero los
productos de interés se cosechan antes de ser traslocados.
• La diferenciación de protoplastos a tejidos se da por suministro de
diferentes proporciones de fitohormonas.

• 9 grupos de hormonas vegetales:

auxinas (IAA), giberelinas (GA),
citoquininas (CK), brasinosteroides
(BR), estrigolactonas (SL), etileno,
ácido abscísico (ABA), jasmonatos (JA)
y ácido salicílico (SA).
• Auxinas División, elongación y
diferenciación celular (formación de
haces vasculares), son la señal de
dominancia apical e inhibición de la
ramificación lateral, crecimiento del
fruto, favorecen ramificación radical
e implicadas en diversos tropismos
(por ejemplo, fototropismo o
gravitropismo).
Principal forma activa: ácido
indolacético (IAA).
• Giberelinas División y elongación celular, crecimiento de frutos,
desarrollo floral (inhibición de la floración en frutal, pero inducción de
la floración en especies anuales), crecimiento en longitud de la raíz
principal e inhibición de la ramificación radical, inhibición del
desarrollo de pigmentos en fruta, fotomorfogénesis y promueven
germinación de semillas.
Principales formas activas: GA₁, GA₃, GA₄ y GA₇.
• Citoquininas División celular, favorecen ramificación lateral, retraso de
la senescencia, favorecen la inducción y diferenciación floral, inhibición
del desarrollo de pigmentos en la fruta, síntesis de aminoácidos y
disminución del crecimiento radical.
Principales formas activas: trans-zeatina (tZ), cis-zeatina (cZ),
dihidrozeatina (DZ) e isopenteniladenina (iP).
• Brasinosteroides: División y elongación celular, fotomorfogénesis,
desarrollo de las partes reproductivas, respuesta a estrés, senescencia
de las hojas y germinación de semillas. Principales formas activas:
catasterona (CS) y brasinolido (BS).

• Estrigolactonas: Inhibición de la ramificación lateral, senescencia de

las hojas, simbiosis con hongos del suelo (micorrizas) y favorecen el
crecimiento radical, pero inhiben el desarrollo de raíces adventicias.
Principales formas activas: estrigol, orobanchol, sogolactona, etc.
• Etileno: Crecimiento radical, efecto final de la abscisión de órganos,
maduración y desarrollo de pigmentos en fruta, respuesta a ataque de
patógenos, germinación de semillas, respuesta a estrés y floración en
determinadas especies. Principal forma activa: etileno.
• Ácido abscísico: Cierre estomático, tolerancia a estrés abióticos
(hídrico o salino) pero también vinculado en algunos tipos de estrés
biótico (respuesta a ataques de patógenos), senescencia de hojas,
inhibición de la germinación de semillas, vinculado con las síntesis de
carotenos y promotor de la maduración de la fruta no climatérica.
Principal forma activa: ácido abscísico (ABA).
• Jasmonatos: Defensa de la planta a ataque de insectos herbívoros,
respuesta a ciertos ataques de patógenos mediante necrosis,
desarrollo de la parte reproductiva de la flor, apertura estomática,
inhibición del desarrollo radical y de la germinación. Principal forma
activa: jasmonoil-isoleucina (JA-lle).
• Ácido salicílico: Principalmente en resistencia sistémica adquirida
(SAR) contra patógenos, tolerancia a estrés abiótico como toxicidad
por metales pesados, implicado en desarrollo celular, de tricomas,
senescencia y apertura estomática. Principal forma activa: ácido
salicílico (SA).
• La diferenciación de tejido no es suficiente para obtener metabolitos
secundarios, pues el desarrollo y crecimiento es muy lenta.
• Por esta razón se prefiere la transformación genética.
• Es posible integrar a la constitución genética de organismos completos,
una secuencia especifica o genes, incluso en especies lejanas en la escala
evolutiva.
Transformación de tejidos vegetales
• Existen diferentes métodos para transformar genéticamente tejidos
vegetales:
a) Transferencia mediada por compuestos químicos (colchicina), fibras de
carburo de silicona.
b) Microinyección
c) Microlaser
d) Biobalística
e) Electroporación de protoplastos (CRISPR-Cas9)
f) Sonicación
g) Métodos biológicos (vectores virales, liposomas o vectores bacterianos)
Transformación por Agrobacterium tumefaciens o A.
rizhogenes
• El tejido transformado puede ser protoplastos, callos o ápices,
prefiriéndose las dicotiledoneas.
• Para facilitar la infección con Agrobacteium se promueve la ruptura de
paredes celulares o formación e heridas para la liberación de etileno.
• Una vez que ocurre la infección, el tejido vegetal comienza a sintetizar
aminoazúcares (opinas) utilizadas por la bacteria como nutriente.
• Después del establecimiento de la bacteria, se formarán tumores en el
tallo donde proliferarán raíces con el material genético inserto.
• Las raíces transformadas también son excelentes modelos para estudiar
e identificar nuevos genes.

• Esto debido a que al ser eucariontes, la expresión y función de genes, así

como el plegado de proteínas es más cercana que cuando se modelan
en bacterias.

• Otras aplicaciones de cultivos de raíces transformadas incluyen la

producción de proteínas de alto valor, vacunas terapéuticas y péptidos
antimicrobianos.
 1.3. Obtención de metabolitos
1.3.1 Productos extracelulares e intercelulares
•• Un
Como su nombre
metabolito lo indica,sustancia
es cualquier son componentes del metabolismo
que participa y se
en las reacciones
pueden que
químicas identificar como
tienen lugar en lassustratos,
células. metabolitos intermedios y
productos en las rutas metabólicas.

Ejemplo, la glucosa puede ser sustrato en la

glucogenogénesis, la ruta anabólica que transforma la
glucosa en glucógeno, o en la glucólisis, la ruta
catabólica que degrada la glucosa para formar ATP y
piruvato
• Podemos clasificarlos en dos grandes grupo:
a) Metabolitos primarios: involucrados de forma directa en el
crecimiento, desarrollo y reproducción normal de un organismo con
una función fisiológica importante.
b) Metabolitos secundarios: no están involucrados en estos procesos
de forma directa.

• La ausencia de un metabolito primario suele conllevar la muerte

inmediata o a corto plazo mientras que la ausencia de un metabolito
secundario no.
 ¿Cómo diferenciar metabolitos primarios de
secundarios?

Primarios Secundarios

Ejemplos: Ejemplos: antibióticos,

-Presentes de forma abundante aminoácidos, esteroides, alcaloides,
en todos los organismos. azucares, taninos, terpenoides,
-Específicos de grupos de
- Son el resultado del carbohidratos, compuestos fenólicos,
organismos y presentes en carotenoides
metabolismo general. lípidos. pequeñas concentraciones.
-Las rutas metabólicas en las que -Resultado de metabolismo
participan, son iguales o muy especial derivado de
parecidas en todos los metabolismo primario.
organismos.
-Involucrados en la defensa
- Están involucrados de forma ante patógenos, predadores o
directa con el crecimiento, estrés.
desarrollo y reproducción.
 • Para la recuperación de metabolitos existe otra clasificación y ésta
obedece la ubicación del producto celular de interés:
a) Extracelulares: en el caso de organismos unicelulares, son aquellos
que excretan (todo lo que se encuentra fuera de la membrana
plasmática).
• Para los organismos multicelulares, se refiere a
todo lo que está fuera de una célula, pero aún
dentro del organismo.
• Los productos genéticos de un organismo
multicelular que se secretan de una célula al
fluido intersticial o sangre, por lo tanto, pueden
anotarse en este término.
• Ejemplos: Aminoácidos, ácido cítrico, alcohol, algunos enzimas
(amilasas y proteasas) y la mayor parte de los antibióticos (penicilina,
estreptomicina).
• En unos pocos casos se encuentran metabolitos tanto en las células
como en el filtrado del cultivo (vitamina B12).
b) Intracelulares: Son los que forman parte de la estructura celular
interna de los organismos (todo compuesto que está dentro de la
membrana plasmática).

Ejemplos: los ácidos nucleicos, las vitaminas, enzimas y ciertos

antibióticos como la griseofulvina
• La separación de los metabolitos extracelulares de las células
microbianas y sus metabolitos intracelulares se puede lograr
mediante técnicas sencillas como la centrifugación y la filtración
• Mientras que la extracción de los metabolitos intracelulares de las
células microbianas es un proceso complejo (extinción microbiana,
lisis química, métodos físico-enzimáticos, digestión proteolítica…)

Metabolitos intracelulares
Metabolitos extracelulares
Separación de los metabolitos extracelulares
• Los metabolitos extracelulares se producen como subproductos de
las actividades metabólicas de los microorganismos que crecen en un
entorno específico.
• Algunos factores ambientales que afectan la absorción y secreción de
metabolitos son: temperatura, pH, concentración de nutrientes y
otros.
• La obtención de metabolitos extracelulares, generalmente inicia con el
calculo y conteo de células necesarias para cosechar el metabolito.
• Concentraciones celulares de UFC/mL son recomendadas, pero esto
varía según el organismo y el metabolito a extraer.
• Posterior a el muestreo, se procede a la
separación del medio de cultivo y el
organismo por centrifugación y/o filtración
para frenar el desarrollo celular y reducir
contaminantes.
• Este paso también detiene la actividad
enzimática, pero si no sucede, es necesario
liofilizar el sobrenadante antes de la
derivación química.
• Cualquier restante de medio de cultivo sin
procesar puede guardarse en oscuridad a
temperaturas de -20 °C o menos.
• La derivación química se refiere a la separación del metabolito y el
medio de cultivo.
• Algunas opciones para la separación son:

a) Separación líquido-líquido. Los metabolitos de interés se separan

en un solvente inmiscible (poco recomendable).
b) Columna o matriz en fase sólida para atrapar los metabolitos.
c) Solubilización selectiva. Es la evaporación completa del solvente
para concentrar la muestra y los metabolitos luego se disuelven con
solventes adecuados
Separación de los metabolitos intracelulares
• Para separar un producto celular, es necesario frenar el crecimiento
de estas para evitar la degradación del metabolito (extinción celular =
templado celular= quenching).

• También es importante que se evite la exposición prolongada a la luz y

que las muestras se mantengan siempre a bajas temperaturas (<20
°C).
• Una vez que se ha detenido el crecimiento celular, se requiere
separarlas del medio de cultivo, para ello se emplean métodos de
filtrado, centrifugación o separación por polaridad.
Resumen de informes bibliográficos sobre métodos utilizados para extinguir
cultivos microbianos
Año Método de Organismo
enfriamiento
Dejar caer los cultivos de
Bacterias micelio en nitrógeno
1963 Solución de ácido (Aerobacter líquido o rociar el cultivo
perclórico
aerogenes ) 1998 en una solución fría de Hongos filamentosos
(Monascus ruber)
metanol (60 % v/v)
seguido de una
Filtración rápida centrifugación rápida
seguida de
1976 inmersión en Levadura
nitrógeno líquido
de la biomasa
Bacteria
Solución de Levadura 2004 Filtración rápida (Corynebacterium
1992 metanol frío (60 % (Saccharomyces glutamicum)
v/v) cerevisiae)

Solución Hongos Solución de metanol al

tamponada de 32,5% en agua Microalgas
1996 metanol (60 % filamentosos 2005 (Chlamydomonas
(Aspergillus niger) suplementada con
v/v) a −45 °C CaCl 2 , MgCl 2 y KCl reinhardtii)
 Inmersión de
matraces de cultivo en Protozoos ( Leishmania
2006 baño de hielo seco y donovani ) Bacterias y levaduras
etanol Solución salina de (Pseudomonas
2007 fluorescens , Streptomyces
glicerol fría
coelicolor y Saccharomyces
cerevisiae )
Solución de metanol
Bacterias ( Lactobacillus
2007 en frío al 60% v/v con plantarum )
diferentes aditivos
2008 Metanol puro a −40 Levadura ( Saccharomyces
°C cerevisiae )

Solución fría de
Bacterias, levaduras y
2010 glicerol y filtración hongos filamentosos
Bacterias ( Bacillus rápida
subtilis , Corynebacterium
glutamicum , Escherichia
2007 Filtración rápida coli , Gluconobacter
oxydans , Pseudomonas Comparación de
putida y Zymononas cuatro métodos de
mobilis ) 2011 extinción diferentes Levadura ( Pichia pastoris )
basados ​en una
solución acuosa de
metanol frío
 • Para mas información puede consultar el artículo:
Farhana R. Pinu, Silas G. Villas-Boas and Raphael
Solución de Moho Aggio. (2017). Analysis of Intracellular Metabolites
2012 metanol al 40 % ( Penicillium from Microorganisms: Quenching and Extraction
v/v a −20 °C chrysogenum )
Protocols. Metabolites. 7, 53;
doi:10.3390/metabo7040053.

Filtración rápida • Extracción de metabolitos extracelulares:

2014
automatizada y Bacterias Farhana R. Pinu, and Silas G. Villas-Boas. (2017).
extinción en el ( Escherichia coli )
filtro Extracellular Microbial Metabolomics: The State of
the Art. Metabolites. 7, 43;
doi:10.3390/metabo7030043
• Otro método para la extracción de metabolitos internos es la ruptura
celular.
• En células de bacterias G+ se emplea la enzima lisozima que actúa
sobre los enlaces glucosídicos del esqueleto polisacárido del
peptidoglicano.
• Una vez roto el esqueleto de esta manera, la célula se expande con la
consecuente ruptura de la membrana y liberación del contenido celular.
• Las paredes celulares de las bacterias Gram negativas que presentan
dificultad al rompimiento por la lisozima, pueden romperse en
molinos de perlas de vidrio.
• Por otro lado, las capas celulares de la pared de las levaduras esta formada
de un complejo manano-proteína y una capa interna de glicano.
• Cuando es necesario romper completamente la célula recombinante para
poder liberar el material intracelular, deben considerarse las características
estructurales de la célula para la selección adecuada de la técnica de
rompimiento.
• Como puede observar, la gran mayoría de los métodos de extinción y
extracción desarrollados hasta la fecha se dirigen a células bacterianas
y/o de levadura.
• Existen pocos métodos de extinción-extracción que detengan el
metabolismo de hongos filamentosos, microalgas y protozoos, esto es
debido a la composición variada de sus paredes celulares.

Alga
Planta Protozoo
• Antes de decidir frenar el crecimiento celular y después de esto, es
necesario asegurar una concentración adecuada de células para
obtener suficientes metabolitos.
• Esto se hace generalmente por prueba de turbidez.

• El muestreo después de extinguir las

células debe ser rápido, debido a que la
interconversión de metabolitos puede
ocurrir en el orden de segundos.
• Se utilizan pipetas o jeringas para
recolectar una cantidad específica de
muestra y rociarla rápidamente en un
matraz que contiene la solución de
extinción.
• Después de que se han aislado las células con metabolismo “frenado”,
se pasa a la extracción del metabolito.
• Para ello se usan técnicas que permiten la ruptura de la pared o
membrana celular y posteriormente liberar los metabolitos de interés.

• Estas técnicas dependerán de la composición de la pared o membrana,

así como de la concentración y naturaleza del metabolito.
• Existen métodos de disrupción celular mecánicos (ultrasonidos,
microondas, prensa francesa y molienda), enzimáticos y químicos.

• Los metabolitos generalmente se distribuyen entre dos fases de

acuerdo con sus coeficientes de partición, solubilidad, temperatura del
solvente y los volúmenes relativos de las fases.

• El objetivo en este caso es

concentrar los metabolitos en
una sola fase, lo que se puede
lograr mediante el uso de
agentes químicos.
• Tanto los disolventes polares (p. ej., metanol o etanol) como los no
polares (p. ej., acetato de etilo, hexano y cloroformo) se emplean
ampliamente para la extracción de metabolitos intracelulares
microbianos.
• Algunos ejemplos de extractores son:

- Etanol hirviendo.
- Metanol frio.
- Metanol tamponado-cloroformo-agua
(extraer lípidos totales).
- Agua caliente (extracción de
aminoácidos bacterianos).
- Extracción ácida
- Extracción alcalina
Algunos métodos industriales de ruptura celular
I) Métodos químicos
• Choque osmótico:
-La presión
La célulaosmótica es ladebido
se expande fuerza aque
quedebe aplicarse
contiene paraque
solutos contrarrestar
ocasionan
la fuerza delosmótico
un flujo flujo osmótico
del aguaproducido.
hacia su interior.
El rompimiento celular por choque osmótico consiste en la carga de un
-volumen dado de células
Esta expansión puede dentro de agua
conducir a pura, conofrecuencia
su lisis se utiliza
rompimiento. La
el doble del volumen
factibilidad de las
del uso de células por volumen
este método de agua.
depende de la resistencia
mecánica de las células de interés.
 • Solubilización de membranas por saponificación
- Consiste en la solubilización de la membrana
celular a un pH alto con un agente alcalino
como hidróxido de sodio (NaOH) en
presencia de un detergente (dodecil sulfato
de sodio o SDS).
SDS
- El papel del detergente es solubilizar la
membrana celular, eliminando las
interacciones interfaciales no covalentes
entre proteínas y lípidos, lo que provoca la
liberación de todos los componentes
intracelulares y además promueve la
desnaturalización de proteínas y ácidos
nucleicos.
 Tolueno
• Disolución lipídica
- Típicamente se añade a la suspensión celular
un volumen de tolueno aproximadamente
igual al 10% de la biomasa u otros como el
benceno.

- El tolueno es absorbido dentro de los lípidos

de la pared celular, lo que produce la
expansión de la pared y la ruptura de ésta.

- El contenido celular es liberado y entonces

puede ser separado el producto de interés.
- Antes de aplicar este método, es necesario verificar la solubilidad
entre lípido-solvente.
- Idealmente se deben seleccionar solventes con solubilidad para los
lípidos de la pared celular pero inadecuados para disolver al producto
de interés localizado dentro de la célula.
• Digestión enzimática

- Consiste en el empleo de enzimas que atacan la pared y provocan el

rompimiento celular.
- Es importante considerar que el pH
influye en la eficiencia de este
método (pH5 no hay ruptura celular,
aun con pared digerida), así como el
alto costo de las enzimas
II) Métodos mecánicos
• Molienda húmeda en molinos de perlas agitados a alta velocidad
(esfuerzo de corte sólido)
• La homogeneización a alta presión (esfuerzo de corte líquido). Usado
en bacterias, levaduras y micelio
• Este tipo de homogeneizador trabaja forzando las células en
suspensión a través de un canal estrecho o un orificio bajo presión.
• Se aplica una elevada presión a una suspensión de células
forzándolas a través de una válvula, sometiéndolas a un alto estrés
de corte (shear), rompiendo las membranas.

• La disrupción ocurre por la

combinación de fuerzas de corte en la
región de la válvula, cavitación (debido
a las regiones de baja presión
generadas) y al impacto con el anillo.
III) Métodos de permeabilización
• Consisten en alterar la estructura de la pared y la membrana celular
para facilitar la difusión del producto hacia el exterior de la célula.
• Estos métodos facilitan la separación del metabolito al no provocar
ruptura celular.
• En ellos se combinan métodos químicos (choque osmótico
controlado, uso de solventes + detergentes específicos)
Problema de la ruptura celular excesiva
• DISMINUCIÓN DEL TAMAÑO DE LOS DESECHOS CELULARES: genera
dificultad en la separación.

• LIBERACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: que deriva en aumento en la

viscosidad del homogenato, dificultad en la separación de los
desechos celulares, “envenenamiento” de matrices cromatográficas y
agregación de proteínas: Pueden pptar (asociación de proteínas +
plasma).
1.3.2 Fermentaciones
• Las fermentaciones son procesos donde microorganismos anaerobios
metabolizan glúcidos o hidratos de carbono para obtener energía
(ATP).
• En el proceso se pueden obtener diferentes productos como
alcoholes, ácidos (láctico, acético, butírico, cítrico), enzimas,
antibióticos, péptidos, amoniaco y
• Las fermentaciones se clasifican en dos grandes grupos, según el
estado de agregación del medio de cultivo empleado:
a) Fermentación en estado sólido.

b) Fermentación en cultivo sumergido o en estado líquido.

a) Fermentación en estado sólido.
• Consiste en hacer crecer un microorganismo sobre un sustrato solido,
insoluble en agua, bajo ciertas condiciones de nutrición, humedad,
pH, aireación y temperatura (gradientes de ).
• La FES no presenta agua libre en su estructura, aunque si necesita
cierta humedad (debajo de 12 %).
• La FES se utiliza principalmente para:
- Mejorar la composición nutritiva de un alimento (olores, sabores,
contenido proteico, palatabilidad,…)
- Obtención de enzimas.
- Obtención de moléculas de interés en tecnología de alimentos (ácidos
orgánicos, etanol o colorantes)= metabolitos secundarios
 • Las ventajas de la FES son:
-- Simplicidad
Control en ladeaireación
los medios
delde cultivo (un sustrato= todos los
sistema.
nutrimentos)
- Bajos
Fermentadores compactos
requerimientos (usan poco espacio al no requerir agua) y
energéticos.
simples.
- Simplicidad de inoculación.
Reducido volumen de efluentes.
- Necesidades reducidas de solventes para la extracción de productos
-- Ambiente similar al de los hábitats naturales de los microorganismos
Buenos rendimientos (en ocasiones superiores al de fermentación
utilizados.
liquida).
- Bajo riesgo de contaminación, inclusive se puede trabajar en
condiciones no asépticas.
• Algunos inconvenientes de este sistema son:
- Frecuente necesidad de pre tratamientos a los sustratos (molienda, pre hidrosis
parcial).
- Dificultad para mantener niveles óptimos de humedad y condiciones de cultivo
(temp., pH, oxigeno libre).
- Ausencia de métodos analíticos simples para determinar el crecimiento
microbiano.
- Necesidad de inoculo voluminoso.
- Es difícil de escalar

molido
• En general se distinguen dos tipos de cultivos en las FES:
I) Medio que actúa como fuente de nutrimentos. Además de
funcionar como soporte físico para un microorganismos, es la
fuente principal de nutrimentos para éste, sin embargo puede
enriquecerse con otros.

II) Medio de cultivo inerte. Su función es únicamente de soporte y

anclaje para microorganismos, pero se embebe con soluciones
nutritivas. Se usa cuando se desea inmovilizar alguna molecula.

Koji=sake Orujo de uva+ hongo= enzimas Vermiculita+ almidón= amilasas Unicel o plásticos
• La mayor parte de procesos de FES utiliza sustratos que funcionan como
soporte y brindan nutrimentos.
• Es común que se usen residuos agrícolas o forestales, granos de cereales
o semillas de oleaginosas (o parte de ellas).
• Sin embrago existen algunas condiciones que estos deben cumplir como:

- Insolubles en agua
- Elevado contenido de CHO´s y/o proteínas.
- Porosidad que permita la adhesión, penetración/anclaje.
- Fermentable por un solo organismo.
- Baja tendencia a la aglomeración (poros 30 % del vol. total).
- Retención de humedad entre 30 % y 75 %
 • Lo microorganismos son otra parte vital para la FES y es deseable que la
elección de estos se haga considerando los requerimientos de actividad
de agua (humedad relativa de la atmósfera gaseosa en equilibrio con el
sustrato, necesaria para el desarrollo del microorganismo).

USO MUY LIMITADO

Frecuencia de uso en FES

USO LIMITADO = presión parcial del vapor de

POCO LIMITADO
agua en la solución gaseosa
en el estado de equilibrio con
el agua adsorbida en el sólido.

= presión de vapor del agua

pura a la misma temperatura.

BAJO ALTO MUY ALTO

𝑨𝒄𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅 𝒅𝒆 𝒂𝒈𝒖𝒂=
𝑷𝑯 𝟐 𝑶
𝑷°𝑯 𝑶 ( )
• Los micro hongos y los microorganismos facultativos son los que
funcionan mejor en las FES, pues además de que su actividad de agua
es baja, poseen:
- Sistemas enzimáticos completos. Esto les infiere facultad para utilizar
diversidad de fuentes de carbono, lo que se traduce en mezclas de
varios polisacáridos.
- Capacidad de adherencia y penetración en las partículas del sustrato.
• Aun cuando los hongos poseen ventajas en comparación con las
levaduras y las bacterias, estas también se han empleado aunque con
menos frecuencia.

• En hongos es necesario
considerar que la elección del
genero debe obedecer a la baja
tendencia para esporular y una
alta tasa de crecimiento
vegetativo en condiciones de
elevadas concentraciones de
nutrimentos.
• Existen diversos equipos para la FES, que permiten mantener
concentraciones de adecuadas, así como la distribución de
nutrimentos (por agitación o movimientos) y humedad para la
proliferación del organismo.
• Algunos de estos equipos son:
- Fermentador de tambor rotatorio
- Celdas de madera

Termómetro
- Fermentador de olla tapada - Fermentador de bandeja
• Fermentador de cintas transportadoras
b) Fermentación en cultivo sumergido o en estado
líquido.
• La fermentación líquida (FEL o FCS)
consiste en cultivar un microorganismo
seleccionado en un tanque profundo rico
en los nutrientes que ese
microorganismo en particular requiere.

• Conforme el microorganismo crece,

digiere esos nutrientes y los convierte ya
sea en más microorganismos o en una
gran variedad de enzimas o metabolitos
de interés.
• Cada microorganismo está particularmente
adaptado para producir un compuesto.

• Por lo general se recurre a microorganismos

modificados genéticamente para maximizar la
producción de un compuesto en particular.
• La FEL se utiliza principalmente para la obtención de enzimas, se
calcula que alrededor del 90% de todas las enzimas industriales,
incluyendo las que se usan en los alimentos balanceados, se producen
a través de este tipo de fermentación.
• Los microorganismos que se utilizan son bacterias principalmente, pero
es posible usar algunos hongos.
• A diferencia de la fermentación
solida, en la líquida se tiene más
control de parámetros como el pH,
calentamiento, condiciones
nutricionales, etc., por lo que es más
sencillo escalarla a volúmenes
industriales.
• Esto porque los microorganismos
están en contacto con una mayor
superficie del medio de cultivo y
además este ultimo es fluido.
• Video refuerzo!!
https://www.youtube.com/watch?v=7nzmV30vZ9Y
1.3 Microorganismos recombinantes
• Se entiende por “microorganismo de ADN recombinante” las
bacterias, levaduras u hongos filamentosos en los cuales el material
genético se ha modificado mediante técnicas de ácidos nucleicos in
vitro, incluyendo el uso de ácido desoxirribonucleico (ADN)
recombinante y la inyección directa de ácido nucleico en células u
orgánulos.
• Las técnica para transformar genéticamente a un microorganismo son
similares a las utilizadas en plantas.
• Se propusieron por primera vez en 1972 por Peter Lobban en la
Universidad de Stanford.
• En 1978, Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith, recibieron el
Premio Nobel en Medicina por el aislamiento y aplicación de las
endonucleasas de restricción.

• Fue hasta el año 1892 que la empresa Genetech, autorizada por Eli
Lilly y Compañía, desarrolló el primer biofármaco legal, la insulina
humana, utilizando la tecnología del ADN recombinante.
• Este tipo de microorganismos se utilizan principalmente en la
industria alimenticia y en la medica.
• La modificación puede hacerse para introducir genes de otras
especies o para sobre expresar característica (s) que permitan la
producción de metabolitos.

Un ejemplo de esto es el caso del

gen de la quimosina del ternero. Ésta
se introdujo en microorganismos de
uso alimentario, como el hongo
Aspergillus.
• En la industria alimentaria no se usan directamente microorganismos
recombinantes, es decir, el producto de consumo final no contiene al
microorganismo, pero si enzimas o productos obtenidos a partir de
ellos.
• Para el uso “seguro” de microorganismos recombinantes, se busca:
- Estabilidad genética (tendencia a mantener el genotipo estable en el
tiempo).
- Calidad del producto final, entendida como similitud del compuesto al
producido por medios naturales.
- Alta competitividad con otros microorganismos para obtener bajo
riesgo de contaminación.
- Costo de producción/mantenimiento competitivo.
• Un organismos muy utilizado para la producción de proteínas
recombinantes es E. coli.
• Esto es por la facilidad de su cultivo y su eficiencia para producir
metabolitos.
• Sin embargo presenta algunos problema como:

a) Las proteínas no son secretadas por las

células.

b) Las proteínas no se producen en forma

activa, permaneciendo en el protoplasma en
forma insoluble formando precipitados
llamados cuerpos de inclusión.
• Cuando se presentan los problemas mencionados anteriormente, el
proceso para la obtención de la proteína de interés debe incluir
operaciones de rompimiento celular, reacciones equivalentes a las de
modificación post-traduccional “in vivo” , y complejas operaciones de
recuperación y purificación.