Métodos Tradicionales

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN
ANTONIO ABAD DEL CUSCO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA
HUMANA
Procedimiento de Microbiología Clínica
Docente: Dra. Yanet Mendoza Muñoz
Asignatura : Prácticas de Microbiología
Alumnos:
• Mari Luz Auccapure Serrano
• Leisly Nayeli Curasco Uscachi
• Bryan Farfán Arenas
• Kelly Daysi Huamán Huillca
• Jurguen André Luna Tapia
• Jared Sair Muñiz Arteaga
• Adriana Alexandra Orellana Huamani
• David’s Mario Huamani Lazo
OBJETIVOS
• Identificar y esquematizar las pruebas de sensibilidad para
Mycobacterium tuberculosis utilizando como fuente.
• Interpretar y analizar las pruebas de sensibilidad para Mycobacterium
tuberculosis.
Métodos tradicionales
1. Método del tablero (checkerboard test).
2. Método de curvas de muerte.
3. Método con tiras de gradiente de concentración.
Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en: https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimiento70.pdf

Método del tablero
• Rango de concentraciones relevante desde el punto de

vista clínico
• Concentraciones por encima y debajo de las CMIs
• 4 o 5 diluciones debajo de la CMI – 2 o 3 diluciones por
encima.
• Filas → cantidad del antibiótico A en el eje Y
• Columnas → cantidad del antibiótico B en el eje X

• Esquema indicando si hubo crecimiento o no.
• Y estos se pueden pasar a un “isobolograma”.
• Complementa los datos numéricos.

• Índice de concentración inhibitoria fraccional (CIF) para cada
compuesto.
• CIF del antibiótico A =
• CIF del antibiótico B =
*La suma de los dos CIF nos da el ICIF de la combinación

Interpretación
• ∑ CIF ≤ 0.5 → Sinérgica
• ∑ CIF = 1 → Aditiva (abandonada)
• 0.5 <∑ CIF ≤ 4 → Indiferente
• ∑CIF > 4 → Antagónica

Método del tablero para
sinergias antibióticas
• Eje X: 0; 1/8 CMI, 1/4 CMI, 1/2 CMI, CMI, 2x CMI, 4 x CMI
• Eje Y: Mismas concentraciones
• Cuando los resultados no son los esperados y no se aprecia la

interacción entre los antibióticos, se tiene que rediseñar el panel con
otras concentraciones de antibióticos.
Comentarios
• Es un método no estandarizado, por lo que no tiene una

precisión certera.
• Muchos especialistas recomiendan realizarla de 4 a 5 veces y

ver una congruencia mayor o igual al 80%.
• Las sinergias obtenidas in vitro pueden no predecir sinergias

in vivo, sin embargo doctores de EE.UU lo utilizan para tratar
la fibrosis quística y un 84% confirmó mejora en sus pacientes
Método de curvas de muerte
• Método que mide la cinética de muerte bacteriana mediante el

recuento de colonias que permanecen viables tras la exposición al
antibiótico.
• Permite poner en manifiesto ciertos comportamientos que se

encuentran en poblaciones bacterianas como la tolerancia,
persistencia y efecto paradójico.

Requerimientos:
• Conocer la CMI del antibiótico

• La CMI se determina por macrodilución, la microdilución también es
aceptable.
• La toma de alícuotas se hace en el t=0, 2, 4, 8, (12) y 24 horas.

Método de curvas de muerte para la
determinación de sinergias antibióticas
• Actividad de 2 antibióticos.
• Basado en recomendaciones consensuadas.
• Determinar las CMIs.
• Determinar las concentraciones a probar.
• Enfrentar en medio líquido el inóculo bacteriano con las diferentes
concentraciones y graficar las curvas de muerte.
*Se tendrá un tubo de control
• Concentraciones: 1xCMI, 2x y 4xCMI.
• Se hacen los recuentos de colonias, T=0, 2, 4, 8, 12 y 24 horas
• Recuento de unidades formadoras de colonias/ml

La actividad bactericida, tanto de un solo antibiótico como
de una combinación se define como el descenso
del inóculo origina
Interpretación
• Disminución ≥2 log10 UFC/ml → Sinergia
• Disminución de 1 a <2 log10 UFC/ml → Adición
• Disminución o un aumento de 1 log10 UFC/ml → Indiferencia
• Aumento de ≥2 log10 UFC/ml → Antagonismo

Comentarios
• Esta técnica nos permite analizar la dinámica de la muerte y el tiempo
en que esta sucede.
• Podemos observar el tipo de interacción que presentan los
antibióticos.
• Se puede justificar la extrapolación en las interacciones antibióticas si
estos fenómenos pudieran predecir eficacia o fracaso clínico.
Métodos con tiras de gradiente de
concentración
• Método más fácil y rápido que los anteriormente mencionados.
• No está estandarizado pero si se siguen los pasos de trabajos ya
publicados, se puede obtener información útil.
• Existen 2 tipos de TG: plástico no poroso y papel.
• Los 2 tipos tienen en una de sus caras una escala de 15
concentraciones y debajo una escala serigrafiada que muestra las
concentraciones de dicho gradiente.

• Se determina la CMI de un antibiótico.

Métodos de tiras de gradiente de concentración para la
determinación de sinergias antibióticas.
1. Método de TG cruzadas en ángulo recto
2. Método de la proporción fija
3. Método de la proporción CMI:CMI
4. Método en placas con antibiótico incorporado en el agar.

Métodos farmacocinéticos
EL ANÁLISIS
FARMACOCINÉTICO/FARMACODI
Actividad de un Concentración mínima inhibitoria
antimicrobiano NÁMICO (PK/PD) (CMI).
Modelos en condiciones estáticas

Principales
Se pone en contacto un microorganismo
características
con un antibiótico a concentraciones
de los modelos
constantes a lo largo del tiempo
in vitro para
estudiar el
Modelos en condiciones dinámicas
efecto de los
antibióticos.
Se expone al microorganismo a
concentraciones de antibiótico que
cambian a lo largo del tiempo simulando
el perfil farmacocinético in vivo

Modelos dinámicos : Modelo dinámico de un
compartimento Se logra:
Se puede evaluar el efecto antimicrobiano
cuando se administra una dosis única o varias
dosis
Al reemplazar continuamente el medio de

cultivo, es posible mantener el sistema
durante tiempos más largos que con los
modelos estáticos.
Se pueden estudiar las combinaciones de

antibióticos
Inconveniente
Pérdida des:
inóculo
Posible contaminación del medio,

especialmente si el ensayo es largo.

Modelos dinámicos : Modelo dinámico de dos
compartimentos ventajas:
Elevada relación área/volumen
El volumen del reservorio central puede

ajustarse para conseguir
cambios rápidos en la concentración del
antibiótico
Las bacterias se disponen en un volumen

pequeño, similar a una infección in vivo.
Es seguro
Se puede regular muy bien la cinética

de absorción y la eliminación del antibiótico
desventajas:
Alto coste
Algunos fármacos, especialmente si son

lipófilos, se pueden unir a la membrana

Inoculo y frecuencia
de mutación
Diseño de experimentos,
con modelos in vitro
Estabilidad de
los
antibióticos
Selección
de la cepa
Duración de la
terapia y prevención
de resistencias
Perfil de
concentración de
Cuantificación los antibióticos
del inoculo Cuantificación de
bacteriano la concentración
de antibióticos
Análisis de datos e interpretación
de los resultados
Modelos empíricos Modelos Semi-mecanisticos Modelos mecanisticos
Analizan el numero de
bacterias viables al Modelos empíricos que tienen en Tienen en cuenta el ciclo
final de la terapia el cuenta los aspectos generales del crecimiento
área bajo las curvas de del crecimiento bacteriano y el bacteriano, la
muerte bacteriana efecto de los antibióticos, así como sensibilidad, interacciones
durante diferentes la selección de resistencias fármaco-receptor, y el
intervalos de tiempo. mecanismo de acción.
Una vez desarrollado un determinado modelo y obtenidos los datos experimentales, el siguiente paso es la
optimización de los regímenes de dosificación para incrementar la eficacia, reducir los efectos adversos y la
probabilidad de generación de resistencias.

Pruebas de Sensibilidad
para Mycobacterium
tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis
- XDR (mayor resistencia, quinolonas, drogas de Búsqueda de mejores métodos de investigación;
segunda línea) 5,3-24 % (mayor eficacia tratamiento, menos propagación)
- MDR (multidrogo resistente [isoniazida y rifampicina])
- Directos: Uso directo del esputo en la prueba

DOTS-Plus (Perú)  Pruebas rápidas de susceptibilidad - Indirectos: Cultivo de la muestra para obtener la
(determinar el patrón de resistencia) cepa para la prueba de sensibilidad
MÉTODO DE LAS
PROPORCIONES
- Compara el desarrollo de colonias en diferentes medios - El prolongado tiempo puede ser un factor de
(antibióticos-sin antibióticos) riesgo para la prolongación de una cepa
- Sensibilidad a isoniazida, rifampicina, etambutol, MDR
estreptomicina - Algunos antibióticos requieren de
- Reproducible y barato; resultados tardíos (60-90 días) condiciones especiales para su evaluación
- Indirecta
Ugarte C, Ponce M, Moore DAJ. Pruebas de sensibilidad para Mycobacterium tuberculosis [Internet]. Scielo; 2008 [cited 2021Nov22]. Available from:
http://www.scielo.org.pe/pdf/amp/v25n3/a10v25n3.pdf
PRUEBAS DE OXIDO-
REDUCCIÓN
- Pruebas de detección colorimétricas (reducción de un - De efectividad similar al método anterior,

indicador cambio de calor), post exposición in vitro a pero en menor tiempo
antibióticos. - Procedimiento con materiales accesibles
- Prueba de Griess, con indicadores al azul de alamar, MTT
y resazurina.
- Método indirecto (7 a 18 días)
MICROSCOPIC OBSERVATION DRUG

SUSCEPTIBILITY (MODS)
- Efectividad similar a los métodos anteriores
- Observación microscópica de M. tuberculosis en medios
- Bajo costo
líquidos del medio Middlebrook 7H9, e incorporación de - Necesidad de microscopio y técnicas de
drogas anti-TB
observación
PRUEBAS DE AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS El Genotype MTBDRplus®
NUCLEICOS (NUCLEIC ACID AMPLIFICATION
TESTS; NAAT) • Detecta M. tuberculosis • Gen
• Detecta mutaciones
Cadena de la polimerasa (PCR) rpoB
específicas del: • Gen
katG
• Amplified M. tuberculosis Direct test® (AMTD; GenProbe • Gen
Inc.)
BACTEC Método de inhA
cultivo
• El Amplicor MTB test® (Roche)
MGIT 960 bacteriológico
• El Cobas Amplicor® (Roche)
automatizado
Patrón de sensibilidad Permite obtener resultados de pruebas de
susceptibilidad a drogas antituberculosas en
INNO-LiPA Rif TB® (Innogenetics), un menor tiempo que el método de las
proporciones y a gran escala
Biotina Reamplificación de
una región de 70 pb PRUEBAS CON
del gen rpoB FAGOS
Hibridación reversa Se basa en la habilidad de los
micobacteriófagos de infectar y replicarse
Su híbrido se detecta mediante una en los M. tuberculosis viables
reacción colorimétrica que está
automatizada (AUTOLiPA®)
Bacteriofagos Se trata con un El virucida Los fagos que ha infectado a los
1 infectan M. virucida es M. tuberculosis se replican y
tuberculosis en la potente neutralizad luego se liberan
muestra o
1. FASTPlaqueTB® (Biotec Laboratories Ltd, Reino Unido)Son amplificados y detectados usando
2. FASTPlaque-RIF® micobacterias de rápido crecimiento, no
patogénicas, que se encuentran en una placa de
agar y soportan la replicación del fago
Detecta la luz producida
2 Fue desarrollado como una prueba de sensibilidad
por fagos con el gen de
rápida, pero requiere de cultivo antes de realizar la
luciferasa que han infectado
prueba
los M. tuberculosis vivos
CONCLUSIONES DEL
ARTICULO
• El éxito del tratamiento de la tuberculosis depende de muchos factores, como tratamiento y apoyo al
paciente.
• Se debe universalizar las pruebas de sensibilidad a todos los pacientes con diagnóstico de tuberculosis,
Permitirá un tratamiento adecuado con la consiguiente recuperación integral del paciente, a
largo plazo permitirá no seguir favoreciendo la aparición de nuevas cepas resistentes y el
aumento de los casos de tuberculosis MDR y XDR.
Ugarte C, Ponce M, Moore DAJ. Pruebas de sensibilidad para Mycobacterium tuberculosis [Internet]. Scielo; 2008 [cited 2021Nov22]. Available from: http://www.scielo.org.pe/pdf/amp/v25n3/a10v25n3.pdf
Nuevos métodos con potencial
aplicación al estudio de
sinergias antibióticas
Consideraciones generales
Se basan en estudios del crecimiento de la cepa
incubada con los antibióticos a estudiar, tanto en
medio líquido y sólido.
Se emplean con el fin de aumentar la autorización y

con ello el rendimiento, el tiempo de respuesta y la
eficiencia a la hora de proporcionar resultados.
Utilidad incluye el estudio de la actividad de nuevos

fármacos como de combinaciones de antibióticos
https://www.agronegocios.co/ganaderia/ong-sinergia-animal-advierte-que
Facilitar el establecimiento de técnica que se -uso-de-antibioticos-en-animales-es-una-amenaza-a-la-salud-global-30906
02
complementara con estudios clínicos para
determinar la utilidad de las combinaciones.
Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en:

https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimiento70.pdf
Microfluídica

Citometría de flujo
Con esta técnica es posible obtener información
sobre la sensibilidad bacteriana a los antibióticos
Mediante el uso simultáneo

de varios fluorocromos
Potencial de membrana
Permiten la Tamaño celular

obtención de
distintos parámetros
Actividad enzimática
1GIFCAT. Citometría de flujo [Internet]. 2020 [citado 21 octubre 2021]. Disponible en:
https://gfycat.com/shallowdefiantbetafish
Actividad de
bombas de flujo
Calorimetra
La calorimetría permite detectar los cambios térmicos causados

por reacciones químicas o eventos físicos
Microcalorimetría [Internet]. 2020 [citado 21 octubre 2021].

Disponible en: https://www.youtube.com/watch?v=xJYTgEtTrLw
La microcalorimetría es una técnica muy sensible que permite

determinar mínimos cambios de calor en pequeños volúmenes
de muestra
Aplicada a la Microbiología, permite detectar de forma precisa

el calor producido relacionado con el crecimiento y el
metabolismo bacteriano

Otras técnicas: Bioimpresoras
Permite desarrollar el método del tablero para establecer sinergias de forma
automática.
Incrementa la eficacia y la exactitud de la técnica
Las bioimpresoras HP-D300 adaptadas utilizan casetes en los que se pueden

dispensar hasta 8 diferentes soluciones de stock de antibióticos, se puede http://www.news-courier.com/cancer-research/news/3
d-bioprinter-could-help-to-accelerate-drug-developmen
diseñar sinergias t-349626
Se evitan errores manuales, cálculos y diluciones laboriosas que conlleva el Sistemas permiten acelerar
método del tablero.
el tiempo de respuesta y
aumentar el rendimiento a
El software del sistema calcula y dispensa los volúmenes apropiados y hace posible que la hora de determinar
se pueda evaluar muchas combinaciones al mismo tiempo. sinergias antibióticas

CONCLUSIONES
• Las pruebas de sensibilidad presentadas en los dos artículos se

emplean con la finalidad de aumentar la autorización , con ello el
rendimiento, el tiempo de respuesta y la eficacia a la hora de
proporcionar resultados y de esta manera evitando la propagación
de la enfermedad a otras personas.
• Por medio de la lectura se pudo interpretar y analizar las pruebas de

sensibilidad para Mycobacterium tuberculosis.

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ANTONIO ABAD DEL CUSCO

1. Método del tablero (checkerboard test).

2. Método de curvas de muerte.

3. Método con tiras de gradiente de concentración.

Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en: https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimiento70.pdf

• Rango de concentraciones relevante desde el punto de

Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en: https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimiento70.pdf

Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en: https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimiento70.pdf

• CIF del antibiótico B =

*La suma de los dos CIF nos da el ICIF de la combinación

Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en: https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimiento70.pdf

• ∑ CIF ≤ 0.5 → Sinérgica

• ∑ CIF = 1 → Aditiva (abandonada)

• 0.5 <∑ CIF ≤ 4 → Indiferente

• ∑CIF > 4 → Antagónica

Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en: https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimiento70.pdf

• Cuando los resultados no son los esperados y no se aprecia la

• Es un método no estandarizado, por lo que no tiene una

• Muchos especialistas recomiendan realizarla de 4 a 5 veces y

• Las sinergias obtenidas in vitro pueden no predecir sinergias

• Método que mide la cinética de muerte bacteriana mediante el

• Permite poner en manifiesto ciertos comportamientos que se

Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en: https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimiento70.pdf

• Conocer la CMI del antibiótico

Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en: https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimiento70.pdf

Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en: https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimiento70.pdf

Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en: https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimiento70.pdf

Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en: https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimiento70.pdf

Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en: https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimiento70.pdf

1. Método de TG cruzadas en ángulo recto

2. Método de la proporción fija

3. Método de la proporción CMI:CMI

4. Método en placas con antibiótico incorporado en el agar.

Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en: https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimiento70.pdf

Modelos en condiciones estáticas

Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en: https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimiento70.pdf

Al reemplazar continuamente el medio de

Se pueden estudiar las combinaciones de

Posible contaminación del medio,

Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en: https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimiento70.pdf

El volumen del reservorio central puede

Las bacterias se disponen en un volumen

Se puede regular muy bien la cinética

Algunos fármacos, especialmente si son

Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en: https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimiento70.pdf

Modelos empíricos Modelos Semi-mecanisticos Modelos mecanisticos

Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en: https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimiento70.pdf

- Directos: Uso directo del esputo en la prueba

- Pruebas de detección colorimétricas (reducción de un - De efectividad similar al método anterior,

MICROSCOPIC OBSERVATION DRUG

Se emplean con el fin de aumentar la autorización y

Utilidad incluye el estudio de la actividad de nuevos

Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en:

Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en:

Mediante el uso simultáneo

Permiten la Tamaño celular

La calorimetría permite detectar los cambios térmicos causados

Microcalorimetría [Internet]. 2020 [citado 21 octubre 2021].

La microcalorimetría es una técnica muy sensible que permite

Aplicada a la Microbiología, permite detectar de forma precisa

Seimc.org. [citado el 22 de noviembre de 2021]. Disponible en:

Incrementa la eficacia y la exactitud de la técnica