Lunes

Material general en el Laboratorio de

Microbiología.

1.-Placas Petri con medio

de cultivo sólido. 2.-
Tubos de ensayo con
medio de cultivo líquido.
3.- Tubos de ensayo con
medio de cultivo sólido
inclinado. 4.-Matraz para
turbidimetria. 5.-
Mechero Bunsen. 6.-
Pipetas. 7.-Microplacas.
8.- Asas de siembra. 9.-
Asa de Digralsky. 10.-
Micropipeta automática.
11.- Pipeteador manual.
12.- Puntas de pipeta
automática. 13.- Placas
Petri. 14.- Jarra de
anaerobios. 15.- Placas
de contacto Rodac. 16.-
Lámina para análisis de
superficies.
 Lunes

L-1.- Preparación y esterilización de material y medios de cultivo.

Los métodos de esterilización más utilizados son: 
- Flameado: Se emplea para esterilizar agujas, asas de siembra, pipetas, cuellos de
tubos y matraces, etc. Consiste en someter directamente a la acción de la llama de
un mechero los utensilios que se vayan a esterilizar. 

Asa y Aguja de siembra Esterilización del asa de siembra Diferentes tipos de Horno Pasteur

Se esteriliza en horno Pasteur, a 180 oC durante 2 horas.

-Calor seco: Se usa para esterilizar material de vidrio debidamente preparado. Las
placas Petri de vidrio se envuelven juntas en papel manila.Tubos de ensayo,
probetas y matraces Erlenmeyer se taponan con algodón graso. Las pipetas se
envuelven en papel manila después de colocar en la boquilla un trocito de algodón,
que actúa como filtro impidiendo la contaminación del material absorbido con los
microorganismos del operador y, a la vez, actúa como protector de éste, evitando la
 Lunes

lor húmedo: Autoclave. Se emplea para la esterilización de medios de cultivo.

Se pone agua en el fondo hasta cubrir las resistencias. Se

introduce el material y se cierra la tapa apretando los tornillos.
Se enciende el autoclave y se espera hasta que desprende un
chorro de vapor, lo que indica que todo el aire que contenía el
autoclave ha sido eliminado. Se cierra la espita y se sigue
calentando hasta que el manómetro señale 1 atmósfera,
Pasado este tiempo,manteniendo
se apaga y esta presión
se deja durantela20
descender minutos.
temperatura hasta que el
manómetro marque cero. Se abre la espita y la no salida de vapor indica que la
presión interna ha cesado. A continuación se abre el autoclave.

ltración: Se emplea para esterilizar sustancias sensibles al calor

Medio a esterilizar

Embudo
Pinza de sujección
Filtro de celulosa
Vacio
Plataforma de vidrio

Medio estéril
 Lunes

Microscopio óptico: partes principales. A) Base.

B) Fuente de iluminación. C) Diafragma. D) Brazo.
E) Platina. F) Macro y Micrométrico. G)
Condensador. H) Objetivos. I) Ocular
L-3.- Observación de microorganismos.

La observación de los microorganismos se raliza con el microscopio óptico.

L-3.1.- Observación en fresco

1.- Depositar una gota de agua en un porta y con el asa de siembra esteril tomar
una muestra del tubo con el microorganismo.

2.- Mezclar las bacterias con el agua sin extender la muestra. Colocar un
cubreobjetos encima de la suspensión bacteriana y observar al microscopio,
anotando la forma de la bacteria y si presenta movilidad

L.3.2.- Observación con tinciones

- Tinción simple: se emplea un solo colorante.

- Tinción diferencial: se emplea más de un colorante y se ve el comportamiento de
las bacterias frente a ellos.
- Tinción negativa: Lo que se colorea es el medio que rodea a la bacteria
permaneciendo ésta sin teñir. 
 L-3.2.1.- Tinción simple de azul de metileno.

Frotis y fijación

1.- Poner una gota de 2.- Tomar la muestra 3.-Extender sobre el

agua en un porta con el asa de siembra agua y fijar a la llama
del mechero
Tinción

1.- Cubrir la 2.- Lavar con agua,

preparación con Azul de dejar secar y observar
Metileno 5’ al microscopio

Micrococcus luteus
L-3.2.2.- Tinción
negativa.

1.- Colocar una gota de

Nigrosina en un porta
3.- Mezclar con la
Nigrosina y extender
2.- Tomar muestra del por todo el porta.
microorganismo con el Secar al aire y
asa, flamear el tubo y observar
tapar
 Lunes

Tinción
L-3.2.3.- Tinción de Gram
Frotis y fijación

1.- Poner una gota 2.- Tomar la muestra 3.- Extender sobre
de agua en un con el asa de siembra el agua y fijar a la 1.- Cubrir la 2.- Añadir Lugol
porta llama del mechero preparación con (mordiente) durante
Cristal Violeta 2’ 1’

3.- Decolorar con

4.- Lavar con agua 5.- Teñir con Safranina 1’ 6.- Lavar con agua,
Alcohol 96º hasta que
no suelte colorante dejar secar y
observar al
microscopio
L-3.2.- Tinción de Gram

Cocos Gram - Bacilos Gram -

L-3.2.- Tinción de
Gram

Cocos Gram + Bacilos Gram +

 X-3.1.- Tinción de Tinción
esporas.
Frotis y fijación

1.-Poner una gota de 2.-Tomar la muestra 3.-Extender sobre el 1.-Cubrir la

agua en un porta de un cultivo de agua y fijar a la preparación con
Bacillus llama del mechero Verde Malaquita

5.-Lavar con agua,

2.-Calentar, con un 3.-Lavar con agua 4.-Teñir con Safranina 1’
dejar secar y
hisopo de algodón
observar al
empapado en alcohol
microscopio
y prendido con la
Esporas
llama del mechero,
hasta la emisión de
vapores. Mantener
caliente durante 5
minutos. Bacterias
 es

X-3.2.- Tinción de ácido-alcohol-

resistente.
Frotis y fijación Tinción

1.-Poner una gota de agua 2.- Tomar la muestra de un 3.-Extender sobre el agua
en un porta cultivo de Mycobacterium y fijar a la llama del
mechero
1.-Cubrir la preparación
con Fuchina fenicada

2.-Calentar con un hisopo de

algodón empapado en 4.-Teñir con Azul de
3.-Lavar con agua y Metileno 1’
alcohol y prendido con la
decolorar con
llama del mechero hasta la
alcohol ácido
emisión de vapores.
Mantener durante 5 minutos.

5.-Lavar con agua,

dejar secar y observar
al microscopio
M.4.1.- Tinción de corpúsculos metacromáticos:
El género Lactobacillus, forma gránulos con características tintoriales diferentes a las del
resto del citoplasma que se denominan corpúsculos metacromáticos.

1.- Hacer un frotis con 2.- Cubrir la preparación 3.- Lavar con agua, dejar
Yogurt con Azul de Metileno 5’ secar y observar al
microscopio
Corpúsculos metacromáticos
L.2.- Resiembra de bacterias en tubo de agar
inclinado

1.- Esterilizar el asa 2.- Destapar el tubo con

de siembra a la llama microorganismo y
del mechero flamear la boca, sin soltar
el tapón

3.- Tomar muestra del 4.- Tomar el tubo

microorganismo con el 5.- Introducir el asa
con medio estéril,
asa, flamear el tubo y con el
destapar y flamear
tapar microorganismo hasta
la boca
el fondo y deslizar en
zig-zag

6.- Esterilizar el asa

de siembra a la llama 7.- Flamear la boca
del mechero del tubo y tapar
M-1.- Aislamiento de microorganismos en
placa.
L.4.- Análisis microbiológico de aguas.
L.4.1.- Recuento enterobacterias Lac+ (Coliformes
totales)

10 ml Caldo Mac Conkey 9 ml Caldo Mac Conkey 9,9 ml Caldo Mac Conkey
doble concentración

Incubar 37ºC 24 horas

 NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)
Número de tubos que dan la reacción positiva

3 tubos 10 3 tubos 1 3 tubos 0,1 NMP/100

ml ml ml ml
M.2.- Análisis microbiológico de aguas.
M.2.1.- Recuento enterobacterias Lac+ (Coliformes
totales) Recuento N.M.P.

M.2.2.- Colimetria confirmativa

Incubar a 37ºC 24 h

Medio
M.2.3.- Coliformes fecales VRBA

Incubar a 44ºC 24 h

Medio Mac Conkey Medio Levine

X.1.- Análisis microbiológico de agua
X.1.1.- Colimetria confirmativa

Medio VRBA

Se consideran coliformes las colonias rojas con un halo de precipitación mas

oscuro alrededor
X.1.2.- Coliformes fecales

Producción de ácido y gas en el tubo con medio Mac

Conkey
Medio Levine: colonias de E. coli con la
típica coloración verde metálico

X.1.3.- Identificación de coliformes

Seleccionar una colonia e inocular tubos para las pruebas del IMViC

I: Producción de Indol (Tubo Vi: Voges Proskauer: Producción de acetil metil carbinol (Tubo
AP) CL)
M: Rojo de Metilo (Tubo CG) C: Utilización de Citrato (Tubo C)
J.1.- Análisis microbiológico de agua.
I: Indol:
Técnica: Inocular el problema en
un tubo con Agua Peptonada (AP) e
incubar a 37ºC durante 24 horas.
 
Resultado: Añadir 2 gotas de Xilol
(Indol I), agitar el tubo y dejar
reposar. Añadir 1 gota de reactivo
de Erlich (Indol II), resbalando por
las paredes del tubo. La reacción es
positiva cuando aparece un anillo
rojo en la capa de xilol. La prueba
es negativa si aparece el color
amarillento del reactivo.
Vi: Prueba de Voges-
Proskauer. Producción de
acetil-metil-carbinol:
 Técnica: Inocular el problema en
tubos con medio Clark y Lubs (CL),
introduciendo el asa de siembra y
agitando un poco el medio líquido.
Incubar a 37ºC durante 24 horas.
 
Resultado: Añadir 2 gotas de -
naftol (VP I)y 2 gotas de KOH al
40% (VP II) y agitar. La prueba es
positiva si aparece una coloración
rosa salmón. La prueba es
negativa cuando la coloración es
M: Prueba del Rojo de metilo
Técnica: Inocular el problema en
tubos con medio Caldo glucosado
(CG) introduciendo el asa de
siembra y agitando un poco el
medio líquido. Incubar a 37ºC
durante 24 horas.
Resultado: Añadir 2 gotas de
Rojo de Metilo y agitar. La prueba
Indol + Indol - es positiva si aparece una
RM + RM -
coloración roja. La prueba es
negativa cuando la coloración es
amarillenta.
C: Citrato. 
Técnica: Con el asa de siembra se
toma muestra del problema y se
inocula un tubo C por picadura y
en estría en la superficie. Incubar a
37ºC durante 24 horas. 
Resultado: Si el microorganismo
ha utilizado el citrato, se produce
en la superfície del medio una
coloración azul. Si no se observa
VP + VP - cambio de color en el medio se Citrato + Citrato -
considera la prueba negativa.
 s
V-1.- Análisis microbiológico de aguas.
V-1.1. Resultados de las pruebas
IMViC
I: Producción de Indol (Tubo I: Añadir unas gotas de xilol (Indol I), agitar y dejar
AP) reposar.
M: Rojo de Metilo (Tubo CG) Añadir unas gotas de reactivo de Erlich (Indol II).
Vi: Voges Proskauer: Producción M: Añadir unas gotas del indicador Rojo de Metilo
Vi: Añadir unas gotas de α-naftol (VP I) y unas gotas
de acetil metil carbinol (Tubo
de KOH
CL)
al 40% (VP II) y agitar.
C: Utilización de Citrato (Tubo C) C: Ver color del tubo.

Medio Agua Medio Caldo Medio Medio Citrato

Peptonada Glucosado Clark y (C)
(AP) (CG) Lubs (CL)

Indol + RM + RM VP + VP - Citrato +
Indol - - Citrato -
Agar Sangre

Extracto de corazón y peptonas 20g Es un medio de cultivo general que permite el

crecimiento de gran número de microorganismos.
NaCl 5g
Agar 15g Se emplea para determinar las reacciones de hemólisis
Agua destilada 1000ml
Añadir 50-80 ml de sangre de cordero

α-hemólisis: lisis parcial de los glóbulos rojos,

se forma un halo verdoso alrededor de la
colonia.
β-hemólisis: lisis completa de los glóbulos
rojos, aparece una zona transparente alrededor
de la colonia.
γ-hemólisis: no actúan sobre los glóbulos rojos,
no forman ningún halo.
 Martes

L-3.- Aislamiento y recuento de microorganismos mesofilos del

suelo.
Diluciones
decimales N= C . D -1
. i -1

1 gr tierra
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml N= nº de unidades formadoras de
colonias.
C= nº de colonias por placa.
D= nº de dilución (10-3, 10-4 ó 10-5).
i= inóculo (0,2 ml). 

9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

0,2ml

Incubar a 28ºC en posición

invertida, durante 4 días.

Contar placas con 300-30

colonias
V-3.2.- Observación de las colonias de microorganismos
viables.

V-3.3.- Observación microscópica de los hongos y

actinomicetos .

Penicillium sp. Aspergillus sp. Alternaria alternata. Streptomyces sp. Scharomyces cerevisiae.
J.2.- Aislamiento de microorganismos mesófilos del
suelo. N= C . D-1 . i-1 N= nº de unidades formadoras
de colonias.
J.2.1.- Determinación
J.2.2.-Observación de de
lasU.F.C.
colonias de C= nº de colonias por placa.
microorganismos viables. D= nº de dilución (10-3, 10-4 ó
10-5).
i= inóculo (0,2 ml). 

J.2.3. Observación microscópica hongos y actinomicetos presentes en

el suelo.

Penicillium sp. Aspergillus sp. Streptomyces sp.

Gracias!!!!!!!!!!!!!!!