INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

C.E.C.yT. 6 “Miguel Othón de Mendizábal”

CARRERA ACREDITADA DE TECNICO LABORATORISTA
QUÍMICO.

Nombre de la práctica: PRÁCTICA No. 5 Tiempo: 6 Hrs.

MORFOLOGÍA Y TINCIONES Unidad II

MICROBIANAS.
Fecha:

UNIDAD DE APRENDIZAJE: CONTROL SANITARIO MICROBIOLÓGICO.

COMPETENCIA DE APRENDIZAJE: Demuestra físicamente la existencia de diferentes morfologías
coloniales, asociadas frecuentemente con morfologías microscópicas evidenciadas mediante tinciones.

RESULTADO DE APRENDIZAJE PROPUESTO (RAP) ASOCIADO CON LA PRÁCTICA. RAP N ̊ 1.- Verifica
físicamente la morfología colonial y mediante uso de técnicas tintoriales hace lo mismo con la morfología
microscópica.

INTRODUCCIÓN:

Existen procedimientos angulares en el estudio de las bacterias; tal es el caso de la determinación de la

morfología colonial (características propias de cada colonia bacteriana en un medio de cultivo sólido en
particular) o bien, la elaboración de un simple frotis directo que no tan sólo puede revelar información con
valor diagnóstico sino que constituye una guía importante para la selección de los medios de cultivo; o bien
la tinción de Gram, misma que permite separar a las bacterias en dos grandes grupos, las Gram positivas y
las Gram negativas; dependiendo de la capacidad que tengan éstas para retener o no respectivamente el
colorante primario (cristal violeta); tras una decoloración controlada con una solución de alcohol acetona.

Otra técnica tintorial diferencial es la de Ziehl-Neelsen que permite también aglutinar a los microorganismos
en dos grandes grupos; los ácido alcohol resistentes (BAAR positivo) y los no ácido alcohol resistentes (BAAR
negativo), dependiendo también de su capacidad para retener el colorante primario (Fucsina Fenicada), tras
una decoloración o exposición un tanto prolongada al alcohol ácido.

Desde el punto de vista sanitario esta técnica es utilizada entre otras cosas para discriminar o en su caso
corroborar la presencia de Mycobacterium tuberculosis (BAAR positivo) en una muestra particularmente
láctea.

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MATERIAL Y EQUIPO:

• Asa bacteriológica
• Pinza de disección plana (sin diente o ranuras)
• Mechero Bunsen
• Torundas alcoholadas
• Portaobjetos
• Puente de tinción
• Equipo de Gram
• Equipo de Ziehl-Neelsen
• Microscopio compuesto con objetivo de inmersión
• Aceite de inmersión
• Vaso de Koplin
• Cinta Scotch (diurex)
• Gotero con azul de algodón lactofenol o rosa de bengala
• Cultivos de Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis y Proteus vulgaris.

PARTE EXPERIMENTAL:

I. Utilizando los cultivos de la práctica anterior hacer la determinación de la morfología colonial, esto
es, las características macroscópicas de las colonias aisladas, considerando:

a. Color.- Beige, negro, rosa, rojo, amarillo, incluso incolora.

b. Elevación.- Cóncava, convexa, plana, en meseta, etc.
c. Borde.- Liso, ondulado, lobulado, dentado, etc.
d. Superficie.- Lisa o rugosa.
e. Forma.- Circular, filamentosa, lobulada.
f. Tamaño.- Este se reporta en milímetros (salvo que sea puntiforme).
g. Transmisión de la luz.- Opaca o traslúcida.
h. Reflexión de la luz.- Brillante o mate.
i. Aspecto.- Húmedo o seco.
j. Consistencia.- Mucosa, butirosa, dura, vítrea.

NOTA 1: En algunos casos para este efecto se considera el tipo de hemólisis que la colonia forma sobre el
agar gelosa sangre pudiendo ser alfa hemólisis o beta hemólisis ya que la gama hemólisis implica una
ausencia de hemólisis.

NOTA 2: La consistencia siempre será la última característica a determinar ya que para ello se destruye la
colonia.

NOTA 3: En lo subsiguiente, se utilizarán colorantes vitales por lo tanto debe usted:

• Usar guantes
• Aplicar los colorantes en la tarja, sobre un puente de tinción, abriendo previamente la llave del agua

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NOTA 4: Aunque la elaboración de un frotis no forma parte de tinción alguna, es parte fundamental en el
mundo microbiológico por tanto, se recomienda proceder de la siguiente forma:

• Previa esterilización del asa colocar una gota de agua sobre un portaobjetos desengrasado.
• Esterilizar el asa y enfriarla para poder tomar una pequeñísima cantidad de crecimiento bacteriano
(si la muestra se encuentra en suspensión, no se necesita la gota de agua sobre el porta objetos)
• Con ayuda del asa haga una extensión de aproximadamente 1.5 cm. de diámetro sobre el
portaobjetos.
• Deje secar a temperatura ambiente (no acelere el secado del frotis aplicándole calor)
• Con el frotis hacia arriba, pase 2-3 veces el portaobjetos sobre la flama del mechero (con esto se
fijarán las bacterias al portaobjeto)

II.- Utilizando los cultivos de la práctica anterior o las cepas proporcionadas, haga dos frotis, fíjelos a la flama
y tíñalos; uno por Gram y otro por Ziehl-Neelsen, como se describe a continuación:

TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM

1.- Colocar el frotis con la película microbiana hacia arriba, sobre el puente de tinción que se encuentra en
la tarja.

2.- Cubra toda la extensión microbiana con cristal violeta (colorante primario) dejándolo actuar durante un
minuto.

3.- Abra la llave del agua y usando pinzas de disección, escurra el exceso de colorante lavando la
preparación con un chorro suave de agua.

4.- Cubrir el frotis con lugol (mordente) dejándolo actuar durante un minuto.

5.- Escurrir el exceso de lugol y lavar con agua de la llave.

6.- Decolore goteando alcohol acetona sobre la preparación (aproximadamente durante 15-20 segundos).

7.- Lavar inmediatamente con agua de la llave.

8.- Colocar nuevamente el frotis sobre el puente de tensión y cubrirlo con safranina (colorante secundario),
dejándolo actuar durante 30-60 segundos.

9.- Escurrir el exceso de colorante y lavar con agua de la llave.

10.- Dejar secar al aire (no aplique calor).

11.- Observe a objetivo de inmersión.

INTERPRETACIÓN:
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Los microorganismos que retienen el colorante primario (cristal violeta), microscópicamente se observan de
color morado o violeta intenso, clasificándoseles por ello como Gram positivos (Gram +).

Los microorganismos Gram negativos (Gram -) al ser susceptibles a la decoloración y perder por tanto el
cristal violeta, se tiñen con el colorante secundario o de contraste (safranina), observándose al microscopio
de color rojo o rosa.

Si bien es cierto que la técnica de Gram es una de las más utilizadas si no es que la más utilizada, existen
otras técnicas tintoriales diferenciales que también nos dan información valiosa como es el caso de la
técnica de Ziehl-Neelsen tanto en su versión original como en la modificada, mismas que a continuación se
describen.

TÉCNICA DIFERENCIAL DE ZIEHL-NEELSEN

(Técnica original)

1.- Después de haber fijado el frotis al calor se coloca éste sobre el puente de tinción con la muestra
bacteriana hacia arriba.

2.- Cubrir el frotis con fucsina fenicada y calentar durante 3-5 minutos a emisión de vapores (CUIDADO: No
deje que el colorante hierva o se seque).

3.- Decolorar con alcohol ácido haciéndolo gotear a manera de cascada durante 20-30 segundos sobre el
frotis.

4.- Lavar con agua de la llave.

5.- Cubrir con azul me metileno durante un minuto y lavar con agua de la llave.

6.- Dejar secar a temperatura ambiente (no aplique calor).

7.- Observar a inmersión.

TÉCNICA DIFERENCIAL DE ZIEHL-NEELSEN

(Modificada por Kinyoun)

1.- Después de haber fijado el frotis al calor, introducirlo durante 20 minutos en un vaso de Koplin, mismo
que contiene fucsina fenicada.

2.- Lavar con agua de la llave.

3.- Decolorar con alcohol ácido haciéndolo gotear a manera de cascada durante 20-30 segundos sobre el
frotis.

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4.- Lavar inmediatamente con agua de la llave.

5.- Colocar el frotis sobre el puente de tinción y cubrir con azul de metileno durante un minuto.

6.- Lavar con agua de la llave.

7.- Dejar secar a temperatura ambiente.

8.- Observar a inmersión.

INTERPRETACIÓN:

Los microorganismos que retienen el colorante primario (fucsina fenicada) se observan de color rojo y se
clasifican como BAAR positivos; los que no retienen el colorante primario, por tanto se teñirán
posteriormente con el colorante secundario o de contraste (azul de metileno) se observan de color azul y se
clasificar como BAAR negativos.

Frecuentemente es necesaria la tinción de hongos filamentosos para lo cual se recomienda la tinción por
impronta, procediendo de la manera siguiente:

1.- Auxiliándose de un Abatelenguas, se presiona suavemente con un trozo se cinta scotch (diurex)
transparente sobre el crecimiento de los hongos permitiendo que las estructuras fúngicas se peguen a la
parte adhesiva.

2.- La cinta scotch se pega en un portaobjetos, de tal manera que la muestra quede entre la parte adhesiva
y el portaobjetos.

3.- Presionar suavemente la cinta sobre el portaobjetos.

4.- Aplicar 1-2 gotas de azul de algodón lactofenol o rosa de bengala y observar a lupa e incluso hasta 10 ó
40x.

RESULTADO DE APRENDIZAJE:

Utilizando colores haga esquemas de las diferentes colonias teñidas y observadas al microscopio.

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CUESTIONARIO:

a. ¿Qué función tiene cada uno de los reactivos utilizados en la técnica de Gram?

b. Desde el punto de vista sanitario ¿qué importancia tiene la técnica de Ziehl-Neelsen?

c. ¿Qué entiende por colorante vital?

d. ¿Qué es una tinción diferencial?

DISCUSIÓN:

CONCLUSIÓN(ES):

EL ALUMNO DEBE CONSULTAR Y ANOTAR UN MÍNIMO DE 3 CITAS BIBLIOGRÁFICAS.

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