Capitulo 6

CAPITULO 6
CRECIMIENTO MICROBIANO
INTRODUCCION

Es el aumento del nmero de microorganismos a lo largo
del tiempo.
No se refiere al crecimiento de un nico microorganismo
(ciclo celular), sino al demogrfico de una poblacin.
Se toma como base el crecimiento de bacterias, el
estudio puede servir tambin para entender el crecimiento
de levaduras y hongos.

El crecimiento de una poblacin resulta de la suma de los
ciclos celulares de todos los individuos de dicha poblacin.

Ciclo celular : proceso de desarrollo de una bacteria
aislada.
Divisin celular: fisin binaria
Gemacin,
ej.
levaduras
REQUERIMIENTOS FISICOS
Temperatura
pH
Actividad de Agua
Presin Osmtica

REQUERIMIENTOS PARA EL
Temperatura
Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento
adecuada.
temperatura mnima por debajo de la que no hay crecimiento; a
temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la
velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que
se alcanza la temperatura ptima a la que la velocidad es
mxima. Por encima de esta temperatura ptima, la velocidad de
crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte celular.
El incremento de la velocidad de crecimiento con la temperatura
se debe al incremento generalizado de la velocidad de las
reacciones enzimticas con la temperatura.
La falta de crecimiento a temperaturas muy bajas se debe a la
reduccin de la velocidad de crecimiento por la reduccin de la
velocidad de reaccin y al cambio de estado de los lpidos de la
membrana celular que pasan de ser fluidos a cristalinos
impidiendo el funcionamiento de la membrana celular.
Efecto de la temperatura sobre la velocidad del crecimiento y las consecuencias
moleculares para la clula
La muerte a altas temperaturas se debe a la desnaturalizacin de las
protenas y a las alteraciones producidas en las membranas lipdicas a esas
temperaturas.
Es importante tener en cuenta que a temperaturas bajas, el metabolismo
celular se enlentece y las clulas paran de crecer; aunque no tienen porqu
morir. Sin embargo, cuando la temperatura es superior a la ptima, se
produce la muerte celular rpidamente y las clulas no pueden recuperar su
capacidad de divisin si baja posteriormente la temperatura.
Esto permite esterilizar por calor y no por fro.
Hay varios tipos de microorganismos en funcin de sus temperaturas de
crecimiento mnima, mxima y ptima.
Sicrfilos - rango: < -5 20C, ptimo < 15
o
C
organismos marinos, algas: Chlamydomonas nivalis (nieve
rosada), bacterias: Pseudomonas, Flavobacterium
membrana contiene alto % de cidos grasos insaturados
Sicrtrofos o Sicrfilos facultativos
- rango: 0-35C, ptimo 20-30
o
C
Pseudomonas - crecen en el refrigerador
Mesfilos - rango: 15-45 C, ptimo: 30-40C
la mayora de los microorganismos (del suelo, aguas, patgenos)
Termfilos - rango: 40-70C, ptimo de 55-65
o
C
membrana contiene alto % de cidos grasos saturados
enzimas estables al calor
Bacillus stearothermophilus, organismos de compostaje
Hipertermfilos - rango: 80-113C, ptimo > 90
o
C
Pyrococcus, Pyrodictium (aguas termales)
PHEsun parmetro crtico en el crecimiento de microorganismos;
cada tipo de microorganismo slo puede crecer en un rango estrecho
de pH fuera del cual mueren rpidamente.
El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las clulas
ya que, en muchos casos, la obtencin de energa metablica depende de la
existencia de una diferencia en la concentracin de protones a ambos lados
de la membrana citoplsmica. El pH interno en la mayora de los
microorganismo est en el rango de 6.0 a 7.0.
Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos
son, tambin,distintos. Hay microorganismos acidfilos que pueden
vivir a pH=1.0 y otros alcalfilos que toleran pH=10.0
Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH
del medio de crecimiento suele tender a bajar durante el cultivo.
La bajada del pH del medio que producen ciertos
microorganismos les confiere una ventaja selectiva frente a
otros microorganismos competidores. As, por ejemplo, las
bacterias lcticas que producen grandes cantidades de cido
lctico como consecuencia de su metabolismo primario reducen
el pH del medio de cultivo a valores inferiores a los soportables
por otras bacterias competidoras (llegan a bajar el pH del medio
hasta 4.5). De esta forma, las bacterias competidoras mueren y
las lcticas se convierten en la poblacin dominante.

La bajada del pH se puede deber a varios factores, uno de los
cuales es la liberacin de cidos orgnicos de cadena corta
(frmico, actico, lctico) por ciertas bacterias.

La accin bactericida de estos cidos orgnicos de cadena corta
es ms potente que la debida nicamente a la bajada del pH que
producen. Esto es, los cidos orgnicos de cadena corta son
txicos para algunas bacterias por s mismos.
Neutrfilo: pH ptimo 7 - Ej.:
bacterias patgenas
humanas.
Acidfilo: pH ptimo < 7 - Ej.:
muchas de las archeobacterias
y hongos.
Basfilo: pH ptimo > 7 - Suelos y
aguas ricas en carbonatos
Clasificacin de los microorganismos segn su pH ptimo
Los microorganismos requieren agua para su crecimiento,
adems para obtener nutrientes de sta.
Una presin osmtica alta causa prdida de agua y plasmlisis
de la clula, por lo que se utiliza este fenmeno para
conservar los alimentos ya sea aadiendo sal o azcar, lo que
previene el crecimiento bacterial.
Sin embargo algunas bacterias se han adaptado a altas
concentraciones de sal, a stas se les conoce como halfilos
extremos.
Por otro lado, los halfilos facultativos no requieren una alta
concentracin de sal, pero pueden crecer hasta una
concentracin de 2%.
Otras bacterias pueden tolerar hasta un 15% de sal.

Presin Osmtica
Actividad de agua:
Se denomina actividad de agua a la relacin entre la presin
de vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presin de
vapor del agua pura (P0). El valor de la actividad de agua est
relacionado con el de la humedad relativa (HR).

El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad
de agua disponible metablicamente.

Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con
una actividad de agua demasiado baja, su crecimiento se
detiene.

Esta detencin del crecimiento no suele llevar asociada la
muerte del microorganismo, sino que ste se mantiene en
condiciones de resistencia durante un tiempo ms o menos
largo. En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede
ser considerada prcticamente ilimitada
La gran mayora de los microorganismos requiere unos valores de actividad de agua
muy altos para poder crecer.
Los valores mnimos de actividad para diferentes tipos de microorganismos son, a
ttulo orientativo, los siguientes:
bacterias aw >0.90, levaduras aw>0.85,
hongos filamentosos aw >0.80.
Los hongos filamentosos son capaces de crecer en substratos con una actividad de
agua mucho menor de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras.
Por esta razn se puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua
(por ejemplo, el queso o almbares) por mohos (hongos filamentosos) y no por
bacterias.
En funcin de su tolerancia a ambientes con baja aw, los microorganismos que
pueden crecer en estas condiciones se clasifican en halotolerantes, halfilos y
xerfilos segn toleren o requieran condiciones salinas o hipersalinas,
respectivamente.
Xerfilos: microorganismos que crecen en condiciones de sequedad o con una Aw
inferior a 0.85.

La reduccin de la actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene
importancia aplicada en industria alimentaria. La utilizacin de almbares,
salmueras y salazones reduce la actividad de agua del alimento para evitar su
deterioro bacteriano.
Efecto de la concentracin de Sodio en el crecimiento de microorganismos con
diferentes halotolerancias. La concentracin ptima de sal para los
microorganismos marinos tal como V. fischeri es del 3%; para los halfilos
extremos es de 15-30%, dependiendo del organismo.
REQUERIMIENTOS QUIMICOS
Carbono
Nitrgeno
Azufre
Fosforo
Oligoelementos
Oxgeno
Carbno (C) todos los organismos requieren C para sintetizar los componentes celulares.

Nitrgeno, azufre.y fsforo. Estos elementos se requieren para la sntesis de DNA, RNA,
protenas y ATP. Las bacterias pueden obtener nitrgeno (N) ya sea fijndolo directamente de la
atmsfera, como por ejemplo el gnero bacteriano Rhizobium. Tambin pueden obtener este elemento
de compuestos inorgnicos que contengan N como nitritos, nitratos, sales de amonio o amino cidos.
Las bacterias pueden obtener azufre de iones de sulfato, sulfito de hidrgeno y amino cidos con azufre.
El fsforo es esencial para la sntesis de cidos nucleicos y membranas celulares. Una fuente para
obtener fsforo son los iones de fosfato y el ATP.

Elementos trazas. Otros elementos como hierro, cobre, molibdeno y zinc son requeridos por los
microorganismos en pequeas cantidades. Usualmente tienen funcin de cofactores.

Oxgeno No todos los microorganismos necesitan 0
2,
sin embargo, muchas formas de vida requieren
oxgeno para llevar a cabo respiracin aerbica. Los microorganismos que utilizan oxgeno molecular son
llamados aerbicos. Estos se clasifican en aerbicos obligados que son los que requieren oxgenos
molecular para vivir, y los aerbicos facultativos los cuales utilizan el oxgeno molecular cuando est
presente, pero en su ausencia continan su crecimiento por la va de fermentacin o respiracin
anaerbica, un ejemplo es Escherichia coli. Por otro lado tenemos los anaerbico obligados que
necesitan ausencia de oxgeno molecular para crecer y donde este generalmente es txico, un ejemplo
es el gnero Clostridium. Estos microorganismos obtienen el tomo de oxgeno molecular del agua.
Tambin se observan microorganismos anaerbicos aerotolerantes los cuales no utilizan el oxgenos
molecular para su crecimiento, pero pueden tolerarlo. Los microaeroflicos slo pueden crecer en
concentraciones de oxgeno molecular menor a las encontradas en el aire.
Macronutrientes

Fuente de
carbono
- CO
2

- Compuestos
orgnicos

Carbohidratos, azcares,
protenas, aminocidos,
lpidos, cidos grasos,
glicerol
Fuente de
nitrgeno
- Inorgnica
- Orgnica
NH
4
, NO
3
-
, N
2

Protenas, peptonas, aa,
bases pricas y
pirimdicas, urea
Fuente de
fsforo
- Inorgnica
- Orgnica
Fosfatos
Esteres del cido
fosfrico
Fuente de
azufre
- Inorgnica
- Orgnica
Sulfuros y sulfatos
Aminocidos sulfurados,
vitaminas

Tipos nutricionales Fuente de
energa
Fuente de
C
Ejemplos
Fotoauttrofos Luz CO
2
Cianobacterias,
bacterias
prpuras y
verdes
Fotohetertrofos Luz
Compuestos
orgnicos
Algunas
bacterias
prpuras y
verdes
Quimioauttrofos o
littrofos
Compuestos
inorgnicos
ej.: H
2
, NH
3
,
NO
2
-
, H
2
S
CO
2
Algunas
Eubacterias y
muchas Archaea
Quimiohetertrofos
o hetertrofos
Compuestos
orgnicos
Compuestos
orgnicos
La mayora
Eubacterias,
algunas Archaea
Metabolismo en procariotas
Luz Compuestos
Inorgnicos
Compuestos
Orgnicos
CO2
Compuestos
orgnicos Hetertrofo
Auttrofo
Energa
Carbono
Fuente
Fottrofo Quimiolittrofo Quimioorgantrofo
Fotoauttrofo Autoquimiolittrofo
Fotohetertrofo
(pocos)
Mixtrofo (algunos)
Quimioorgantrofo
Oxigeno
Clasificacin de los microorganismos segn el efecto del oxgeno:
Aerobios
obligados: requieren oxgeno (21% o ms)
Ej. Bacillus, hongos, etc.
microaeroflicos: lo requieren pero a niveles menores que el
atmosfrico (5-10%)
Ej. Azospirillum
Anaerobios
facultativos: no requieren oxgeno, pero el desarrollo es
mejor con oxgeno.
Ej. Levaduras, E. coli
aerotolerantes: no son sensibles al oxgeno (crecen en
ausencia o presencia de oxgeno).
Ej. Enterococcus faecalis, Sreptococcus spp.
obligados: no toleran el oxgeno, muere en su presencia
Ej. Methanobacterium, Clostridium
RELACION DE LAS BACTERIAS CON EL OXIGENOEN TIOGLICOLATO

Tubo # 1: Aerobio estricto
Tubo # 2: Anaerobio facultativo
Tubo # 3: Anaerobio aerotolerante ( Microaeroflico )
Tubo # 4: Anaerobio estricto

FACTORES ORGANICOS DE
CRECIMIENTO
Estos son compuestos orgnicos esenciales
que el organismo no puede sintetizar.

Se incluyen las vitaminas, los amino
cidos, las purinas y las pirimidinas.

Cultivo de microorganismos
Medios de cultivo :
- Qumicamente definidos
- Complejos
Tipos de cultivo:
- en medio slido
- en medios lquidos
Un medio de cultivo incluye:
- Fuente de Energa
- Macronutrientes esenciales
- Micronutrientes esenciales
- Factores de crecimiento.
MEDIOS DE CULTIVO
CULTIVO MICROBIANO. Es el desarrollo activo de
microorganismos en medios adecuados (medios de
cultivo).
Toda clula viva para su mantenimiento y
reproduccin requiere consumir nutrientes que le
permitan realizar los procesos metablicos
necesarios para su supervivencia.
MEDIO DE CULTIVO
Son una mezcla de nutrientes que en
concentraciones adecuadas y en condiciones fsicas
ptimas, permiten el crecimiento de los
microorganismos.
Pueden ser: de laboratorio, industriales
Usos
En laboratorio.
Desarrollo de m.o (reproduccin)
Conservar m.o
Aislar m.o.
En la industria.
Produccin de biomasa.
Produccin de metabolitos
Requisitos de los medios
1. Ser nutritivos. contener los componentes
necesarios a los requerimientos del m.o de
inters
2. pH adecuado. La mayora requiere pHs
neutros, pero algunos no, como Thiobacillus
ferroxidans pH=2.0
3. Ser estril. para garantizar slo el desarrollo
del los m.o de inters
COMPOSICION
Deben contener los componentes necesarios para
formar las nuevas clulas por ejem:
Bacterias
Levaduras
Hongos
Algas
Protozoarios
COMPOSICION
Los hongos requieren una fuente orgnica a la que se
acompaa de antibiticos para evitar la presencia de
bacterias.
El cultivo de microalgas requiere sales minerales
suplementadas con vitaminas. Tambin suelen
aadirse antibiticos para evitar la contaminacin
bacteriana.
Para el cultivo de protozoos, que crecen difcilmente
en medios slidos, se requieren medios lquidos
enriquecidos con otros microorganismos
CLASIFICACION. MEDIOS DE LABORATORIO
Los medios de cultivo se pueden clasificar segn diversos
criterios:
Por la naturaleza de sus constituyentes:
Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias
complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente
complementadas con minerales y otras sustancias.
Ejm. Extracto de levadura, agar-papa, extracto de maz.
En ellos no se conocen todos los componentes ni las cantidades
exactas presentes de cada uno de ellos.
Medios definidos o sintticos: son los medios que tienen una
composicin qumica definida cualitativa y cuantitativamente.
Se adquieren de laboratorios proveedores.
Generalmente se usan en trabajos de investigacin.
Clasificacin
De acuerdo al uso del medio de cultivo:
Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que favorecen el
crecimiento de un tipo de microorganismo en particular.
Permiten aumentar el nmero de microorganismos de ese tipo.
Usualmente contienen una o ms sustancias inhibidoras del
crecimiento de los microorganismos con excepcin de los que se
quieren cultivar.
Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se
diferencian por ser medios slidos y estn diseados para el
aislamiento de microorganismos especficos.
Estos medios se enriquecen aadiendo sustancias que inhiban el
crecimiento de la flora no deseada.
Un buen ejemplo sera el medio TCBS (tiosulfato-citrato-sales biliares-
sacarosa), especial para aislamiento de especies del gnero Vibrio, en
el que la sustancia inhibitoria son las sales biliares
Medios diferenciales: contienen indicadores de productos derivados
de la actividad microbiana de los microorganismos.
No contienen ningn tipo de sustancia con actividad antimicrobiana.
Permiten revelar caractersticas fisiolgicas de los microorganismos
Clasificacin
Por la consistencia del medio.
medios lquidos son utilizados para la promocin del crecimiento.
Ejm. caldo lactosado para coliformes, caldos nutritivos,etc.
El crecimiento se evidencia por la turbidez del tubo, si se trata de una
prueba bioqumica, adems de la turbidez se observa un viraje del
indicador e inclusive en algunos casos (campanas de Durham)
produccin de gas.----Ejm: caldo MRVP (peptona de casena,
dextrosa, fosfato di potsico, agua) para investigar la ruta de
degradacin de la glucosa.
medios semislidos ( agar al 0.7%)donde la finalidad principal es
poner de manifiesto la movilidad de la bacteria en este caso la
siembra se realiza con un asa recta, por picadura y se observa si la
bacteria presenta turbidez mvil en el tubo y si no solo se ve el
crecimiento a lo largo de la picadura.----Ejplo. Agar SIM. agarMIA,
agar PCA.medios slidos. tambin son utilizados como pruebas
bioqumicas, donde el crecimiento se observa en la superficie o pico
de flauta (si es un tubo), si se trata de una placa (la siembra puede ser
masiva o estra cruzada), es comnmente utilizada para la obtencin
de colonias aisladas del microorganismo de inters.
Existen diferentes tipos de estos medios, diferenciales, selectivos,
nutritivos, etc.
Medios solidos
Nutrientes: compuestos qumicos necesarios para formar las macromolculas.
Nutricin microbiana
- Macronutrientes: se precisan en grandes cantidades:
C, N, P, S, K, Mg, Ca, Na

- Micronutrientes: en menores cantidades o en cantidades trazas.
No todos se requieren en iguales cantidades y distintos procariotas requieren
algunos ms especficos.
Nos centraremos en los organismos hetertrofos.
Carbono
-puede obtenerse de:
compuestos orgnicos carbonados (hetertrofos)
CO
2
(auttrofos)
- C es el 50% del peso seco.
- Requerido para protenas, lpidos y azcares.
Macronutrientes
Nitrgeno
- es 12% del peso seco.
- En la naturaleza esta en forma:
- orgnica (menor parte): compuestos orgnicos nitrogenados.
- inorgnica: amonaco (NH
3
), nitratos (NO
3
-
) o N
2
.

Se utiliza para amino acidos y cidos nucleicos.
La mayora de los procariotas usan amonaco, y algunas nitratos.
El N
2
gaseoso puede ser usado por las bacterias fijadoras de N
2
.

S (azufre)
- se necesita en algunos amino cidos y vitaminas.
- Disponible mayormente como S inorgnico:
sulfatos (SO
4
=
) o sulfuros (HS
-
).
- Algunas bacterias degradan protenas.
Macronutrientes
Fsforo P
- El fsforo se encuentra como ion fosfato (PO
4
-3
) en fosfatos
orgnicos o inorgnicos.
- Se utiliza en cidos nucleicos y fosfolpidos.
Magnesio
- estabiliza ribosomas, membranas y cidos nucleicos.
- importante para la actividad de enzimas
Potasio (K)
- es necesario en algunas enzimas.

Calcio (Ca), importante para algunos en membranas y endosporas.
Sodio (Na) necesario para organismos marinos.
Macronutrientes
El hierro (Fe) fundamental en respiracin (citocromos y proteinas Fe-S)

- en condiciones anaerbicas:
hierro en estado de oxidacin +2 (ferroso)
es soluble.

- en condiciones aerbicas:
en estado de oxidacin +3 (frrico)
forma minerales insolubles.

Siderforos: son agentes quelantes producidos por procariotas, que solubilizan el
hierro de los minerales y lo transportan dentro de la clula.
Fuente: Brock
Micronutrientes
Son metales.
Muchos tienen funcin estructural en enzimas.
Factores de crecimiento:

Compuestos orgnicos que se requieren en pequeas cantidades.
Ej. vitaminas, aminocidos, purinas, pirimidinas.
Muchos microorganismos son capaces de sintetizarlos, otros no.
COMPONENTES DE LOS MEDIOS
Fuente de carbono
Fuente de nitrgeno
Micro nutrientes
Suplementos
Colorantes e indicadores
1. Fuentes de carbono
1. Carbohidratos.
Monosacridos.
Dextrosa. Presente en jugos de frutas. Hidrlisis de lactosa, sacarosa, almidn.
Oligosacridos.
Lactosa (suero de leche)
Sacarosa.
Dextrina.
Polisacridos.
Almidn
agar
2. alcoholes.
Glicerol.
Etanol
Metanol
3 Lpidos.

4 hidrocarburos

2. Fuentes de nitrgeno
Nitratos
Sales de amonio
Hidrolizados. Peptonas. Digeridos, extractos.
Fuentes de nitrgeno
1) Hidrolizados de protenas (Peptonas)
son obtenidas por hidrlisis cida o enzimtica de distintas
fuentes proteicas como carne de diferentes rganos y
animales, pescado, casena, gelatina, harina de soja, algodn,
girasol, etc..
Mediante ajuste de la relacin enzima-sustrato y variando
tiempo de hidrlisis es posible variar el tamao de la cadena
de polipptidos.
2) Extracto de carne, que se obtiene por extraccin acuosa y
concentracin posterior variando su tipo de acuerdo a la
calidad de carne, tiempo de extraccin y temperatura de la
misma.
Fuentes de N
3) Extracto de levadura, puede ser obtenida mediante
autlisis o plasmlisis de la levadura, es bsicamente una
mezcla de aminocidos, pptidos, vitaminas solubles en H2 O
y carbohidratos.
4) Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de
la malta de la cebada
5) "Cornsteep", el agua de maceracin de la industria del
maz tiene mucha importancia por su utilizacin como
componente esencial de los medios para la produccin de
varios antibiticos y enzimas.
Deben considerarse los costos, la disponibilidad y el problema
de impurezas que puede acompaar a las distintas materias
primas utilizadas.
3. Micronutrientes
Segn la cantidad pueden ser:
Macronutrientes. En cantidades de gr/l. C, O2, H2, N2, P, S, K,
Na, Ca, Mg
Micronutrientes.oligoelementos, en mg/l o g/l
Son activadores enzimaticos. Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Co, B.
Se usan sales como: NaCl, KH2PO4, NH4(SO4), MnSO4,
ZnSO4, CaCl2
El Na en altas concentraciones inhibe el crecimiento de
algunos m.o y favorece a otros. Ejplo. Agar manitol salado
(7.5% de ClNa) se usa para el crecimiento de staphilococcus.
Agar streptococcus KF (6.5% ClNa) para crecimiento de
streptococcus
4. Suplementos
A. inhibidores.

Antibiticos. Como penicilina, estreptomicina, cloranfenicol
(amplio espectro).
Ejm. Agar saboraoud-glucosa. Contiene cloranfenicol.
Fungicidas: fungizona, amphotericina (mohos y levaduras).
Metales pesados.
Ejmplo. Agar sulfito-bismuto. Contiene Bi y colorante verde
brillante e inhiben a bacterias Gram (+) y mayora de Gram (-),
excepto a salmonella.
Compuestos orgnicos inhibidores.
Agar salmonella-shigella. Contiene altas concentraciones de
sales biliares y citrato de sodio que inhibe a las Gram (+) y
mayora de gram(-) incluyendo a las coliformes, excepto
salmonella y shigella.

Suplementos
B. factores de crecimiento.
Compuestos orgnicos que se suministran en
bajas concentraciones.
No son sintetizados por los m.o que se desea
favorecer, pero son necesarios para su
desarrollo.
Vitaminas, aminocidos, cidos grasos.
Suplementos
C. colorantes e indicadores.
Indicadores de reaccin, indicadores de potencial oxido-
reductor, indicadores selectivos.
Indicadores de la reaccin del medio.
Verde malaquita:
pH muy cido: amarillo
pH =2 : verde
pH = 11.5: azl
pH = 14: incoloro
Rojo-fenol.
pH = 7.8: azl
pH =7.8: prpura.
pH = 7.4: rojo
oH = 7.0: naranja
pH =6.5: amarillo.
Para indicar produccin de acidos; lctico, ctrico, actico
Suplementos
Indicadores del potencial de oxido-reduccin.
Azul de metileno:
Medio oxidante: azul
Medio reductor: incoloro
Indicadores selectivos.
Verde malaquita, cristal violeta: inhiben bacterias gram(+)
Colorantes bsicos: inhiben bacterias.
Ejplo. Agar Mc-Conkey. Contiene sales biliares y cristal violeta
que inhibe a las gram(+)
Agar EMB. Para determinacin de coliformes fecales. Contiene
eosina y azul de metileno que inhiben gram(+) y facilita el
desarrollo de enterobacterias.
PREPARACION
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio:
a partir de cada uno de sus constituyentes bsicos o
por simple rehidratacin de productos asequibles comercialmente
(medios de cultivo deshidratados).
Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados
porque, adems de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor
probabilidad de obtener resultados reproducibles.
Para su preparacin se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:
Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiolgica
y fisicoqumica adecuada.
Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua
destilada o desmineralizada.
Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su
esterilizacin.
Nunca se deben exceder las condiciones sealadas por el fabricante.
Cuidados : rehidratacin, estado del material, esterilizacin,
almacenamiento.
MEDIOS DE CULTIVO

PREPARACION
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio:
a partir de cada uno de sus constituyentes bsicos o
por simple rehidratacin de productos asequibles comercialmente
(medios de cultivo deshidratados).
Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados
porque, adems de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor
probabilidad de obtener resultados reproducibles.
Para su preparacin se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:
Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiolgica
y fisicoqumica adecuada.
Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua
destilada o desmineralizada.
Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su
esterilizacin.
Nunca se deben exceder las condiciones sealadas por el fabricante.
Cuidados : rehidratacin, estado del material, esterilizacin,
almacenamiento.
Preparacin
1. Rehidratacin: El agua debe ser destilada o desionizada
Los agares se aaden sobre el agua a temperatura ambiente, se dejan
embeber unos minutos, se agita enrgicamente y se calienta el
conjunto a 98-100 C durante el mnimo tiempo necesario para que,
agitando y volteando secuencialmente, la disolucin sea total
(homogeneidad y transparencia al trasluz, excepto en algunos medios
opacos).
En los medios con azcares (glucosa, lactosa...) un excesivo
calentamiento lleva a caramelizacin, detectada por un
oscurecimiento del color del medio.
Los medios agarizados cuyo pH es inferior a 5 son muy delicados
porque la acidez sumada al calor hidroliza las molculas de agar,
hacindose el medio friable y quebradizo. En tal caso puede aadirse
agar-agar fundido (15-20g/l) para restablecer las condiciones de
dureza necesarias, pero no se debe recalentar el conjunto.
La homogeneidad de la disolucin deber ser total, no admitindose
el menor grumo ni heterogeneidad

Preparacin
2. Secado de las placas.
Para obtener colonias bien aisladas resulta fundamental
sembrar sobre placas cuya superficie no est hmeda.
Para ello, se pone la placa boca abajo (con el medio
colgando), se coloca la tapa de la placa abajo, se abre la
placa y se coloca la parte de arriba, con el medio
colgando, apoyada sobre la tapa, todo ello sobre papel
secante, preferiblemente estril, esperando unos
minutos hasta que la superficie del medio deje de
mostrar agua condensada.
Todo medio preparado debe almacenarse en la ms
completa oscuridad, para evitar la formacin de
perxidos bacteriostticos o bactericidas.

Preparacin
3- Esterilizacin-----La esterilizacin en autoclave se har siempre en
volmenes inferiores o iguales a 1 litro, pues de lo contrario los
tiempos de autoclavado estndares no son vlidos porque el calor de
esterilizacin no penetra hasta el centro del recipiente.
Se controlar siempre el correcto funcionamiento del autoclave (no
es lo mismo 15' a 121 C que 14'a 121 C, por ejemplo).
El excesivo calor durante el autoclavado y la posterior lentitud (o
excesiva rapidez) en el enfriamiento son las principales causas de
alteraciones en la calidad del medio final.
Los medios con componentes grasos deben enfriarse en agitacin
para evitar la formacin de grumos.
Los medios fluidos, con poca proporcin de agar, debe enfriarse muy
suavemente y mantenerse por encima de 10 C para que el agar no
forme nubes opalescentes que podran confundirse con una falsa
contaminacin.
Los medios con azcares se esterilizan mejor por debajo de 118 C
(116 C, 30', por ejemplo), para evitar la caramelizacin, que se
detecta por oscurecimiento del medio y olor a azcar tostada.
El resto de medios en general se esteriliza a 121 C durante 15
minutos.
Preparacin
4. Almacenamiento de medios deshidratados
Los medios deshidratados almacenados bajo condiciones ptimas
tienen una caducidad media de 3 a 5 aos desde su fabricacin.
Una vez abierto el bote no deben usarse despus de 6 meses, de ah la
importancia de registrar en el bote su fecha de apertura y de utilizar
envases de 100 gramos en todos los medios de uso infrecuente.
Los medios deshidratados deben permanecer en un armario cerrado,
lejos de toda fuente de luz, humedad o calor (lmparas, autoclaves,
estufas).
Conviene un lugar fresco, pero no un refrigerador, porque condensara
agua.
No almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o
vapor.
Los medios de cultivo deshidratados se deben descartar cuando se
hidraten o decoloren.
Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se
debe almacenar entre 2 y 8C, a menos que el medio requiera alguna
condicin diferente.
Ejms. Medio: Algas Clorofceas
Conjunto de nutrientes NPK y oligoelementos
en solucin acuosa estril necesarios para
provocar "Blooms algales".
Se aade a razn de 5 ml por litro final de
medio base (Agar Algas, caldo Algas), antes o
despus de la esterilizacin (para evitar
precipitados, en el caldo se aade despus de
esterilizar ste por filtracin).
Medio complejo para organismos
hetertrofos
Nutrientes Cantidad
Agua 1L
Peptona 5g
Extracto de levadura 3g
NaCl 8g

Medio Slido
Agar 15g
Medio Complejo para el Crecimiento de Bacterias Fastidiosas
Componente Cantidad Funcin del componente
Extracto de Carne 1.5 g Fuente de vitaminas y
otros factores de crecimiento
extracto de Levadura 3.0 g Fuente de vitaminas y
otros factores de crecimiento
Peptona 6.0 g Fuente de aminocidos,
N, S, y P
Glucosa 1.0 g Fuente de C y energa
Agar 15.0 g Agente de solidificacin
Inerte
Agua 1000 ml pH 6.6

Agar McConkey:
Medio diferencial para deteccin, aislamiento y enumeracin de bacterias
coliformes y patgenas intestinales.
Accin diferencial. Los microorganismos capaces de fermentar lactosa
producen una cada de pH, junto con una absorcin del colorante, apareciendo
en la colonia el color rojo, las colonias de microorganismos que no fermentan
la lactosa permanecen incoloras.
Composicin por Litro:
Peptona de gelatina- 17g
Peptona de casena- 1.5g
Peptona de carne - 1.5g
Lactosa- 10g
Sales Biliares- 1.5g
Cloruro Sdico- 5g
Rojo Neutro- 0.03g
Cristal Violeta- 0.001g
Agar- 13.5g
pH 7.1+- 0.2
Agar Nutritivo
Medio para fines generales que promueve el
crecimiento de la mayora de los
microorganismos poco exigentes.
Extracto de Carne de buey- 3g
Peptona trpsica de gelatina- 5g
Agar- 15g
Cloruro sdico y glucosa- 5 g
Agua destilada hasta 1000 ml
Agar Papa Dextrosa:
Medio para el cultivo y enumeracin de levaduras y
mohos a partir de alimentos y otros materiales. Los
hidratos de carbono y la infusin de papa favorecen
el crecimiento de levaduras y hongos, en tanto que
por el bajo rango de pH, la flora acompaante se
reduce significativamente.
Agar -15g
Dextrosa - 20g
Infusin papa - 4g
Agar Sabouraud
Medio para la deteccin y aislamiento de hongos.
Para que ocurra el crecimiento selectivo de hongos
sobre bacterias en la muestra depende tan solo de la
reaccin cida (pH 5.6).
Digestivo pancretico de casena- 5g
Peptona de tejido digestivo -5 g
Dextrosa -40g
Agar- 15g
Preparacin de Agares, en laboratorio
Agar McConkey . 50 g/l
Agar nutritivo . 20 g/l
Agar LIA . 32 g/l
Agar TSI . 65 g/l
Agar EMB . 36 g/l
MEDIOS INDUSTRIALES
La preparacin de medios para el desarrollo
de procesos de fermentacin es una etapa
fundamental para asegurar la productividad
de los mismos.
Se usan siempre medios complejos
Es conveniente considerar:
diseo
formulacin y
optimizacin de los mismos.
1. Diseo del medio
tiene como finalidad la eleccin de los componentes
necesarios para lograr el crecimiento y la formacin de
productos correspondientes al proceso a desarrollar.
Tener en cuenta todos los aspectos relacionados a:
los requerimientos nutricionales del microorganismo.
y algunos especficos del proceso
la disponibilidad real de los componentes y
consideraciones sobre las materias primas.
Otros aspectos importantes son:
Los procesos y operaciones previos y posteriores a la etapa de
fermentacin y
El conocimiento de los mecanismos bioqumicos que regulan
la formacin de algunos productos.
Requerimientos nutricionales
Estn determinados por
Tipo de metabolismo celular:
autotrfico, como las algas y algunas bacterias,
heterotrficos que necesitan compuestos orgnicos como fuente de
carbono.
condiciones del cultivo, si es aerobio o anaerobio. En la ausencia
del 0 2 , el N03 o S04 son utilizados como aceptores de electrones
por algunas bacterias.
Las bacterias metanognicas son auxtrofos anaerobios que utilizan
H2 para reducir el C02 a CH4 para obtener energa.
las fuentes de nitrgeno que pueden ser de naturaleza inorgnica
u orgnica.
P y el S son suministrados en forma de P04 H y S04 (o aminocidos
azufrados).
El fsforo se incorpora en cidos nucleicos, y polmeros celulares.
El S es asimilado para la sntesis de aminocidos azufrados, y
adems se necesita para la biotina, coenzima A, tiamina y otros
componentes.
Requerimientos nutricionales
K y Mg son tambin esenciales. Una parte importante del
primero est unida al RNA de manera que los requerimientos
de K aumentan con los factores que influyen en el aumento del
RNA de las clulas, como la velocidad de crecimiento.
micronutrientes se distinguen 2 categoras:
a) Los que son frecuentemente esenciales para el crecimiento
como Ca, Mn, Fe, Co, Cu y Zn y
b) los que son raramente esenciales como B, Na, Al, Si, Cl, V,
Cr, Ni, As, Se, Mo, Sn.
Factores de crecimiento comprenden ciertos aminocidos y
vitaminas del grupo B como tiamina, riboflavina, cido
pantottico, niacina, etc., que representan para muchas
bacterias y levaduras factores esenciales en los medios sin los
cuales no se produce crecimiento celular.
Otros factores de crecimiento son las purinas, poliamidas,
putrescinas.
Considerar tambin: Otros requerimientos y biodisponibilidad
de nutrientes,
Otros agregados
Son nutrientes requeridos por los microorganismos de
manera especfica segn el proceso considerado.
Los precursores que constituye la base de una molcula
que debe ser sintetizada por el microorganismo, como el
cido fenil actico para la penicilina.
El sulfato, en el proceso de fermentacin alcohlica, que
favorece la formacin de glicerol.
La produccin de cido ctrico debe considerar la
influencia negativa que para el proceso tiene un exceso
de hierro en su composicin; por lo tanto dicho medio
debe disearse de manera tal que su preparacin (a partir
de diversas materias primas) considere una eliminacin
total del hierro y posterior agregado del mismo en
cantidades controladas.
Costo
El costo de los nutrientes representa del 10 al 60% del
costo total de los productos obtenidos por fermentacin.
Las materias primas ms importantes corresponden a
fuentes de carbono y de nitrgeno.
Las fuentes de carbono pueden ser:
1) Hidratos de carbono como glucosa o dextrosa,
sacarosa, lactosa, almidn, dextrina;
2) Alcoholes como el glicerol y manitol; y
3) Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros.
Son muy importantes tambin por su disponibilidad y
costo reducido otras materias primas que contienen
hidratos de carbono como granos, melazas, celulosas,
suero de queso, etc
2. Formulacin
Tiene que ver con los aspectos cuantitativos del medio, es
decir debe establecer las concentraciones de cada
componente.
Una primera aproximacin con respecto a las cantidades a
utilizar de las diversas fuentes lo da el conocimiento de la
composicin de biomasa del microorganismo a ser
empleado.
Es decir, que si queremos formular un medio para producir
una determinada cantidad de biomasa debemos proveer
las distintas fuentes que aseguren como mnimo las
cantidades de elementos que deben ser suministrados.
Una composicin elemental y tpica de la biomasa es (%
peso seco): Carbono, 46-48; Nitrgeno, 7-12; Fsforo, 1-3;
Azufre, 0.5-1.0; Mg, 0.5-1%.
3. Optimizacin
Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativo la
optimizacin de los medios de cultivo.
Entre ellas podemos mencionar las siguientes:
1) No existencia de informacin respecto a coeficientes de
rendimiento de macro y micro elementos para el cultivo del
microorganismo determinado.
2) Existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente de
microelementos y factores de crecimiento.
3) Uso de medios de cultivo conteniendo elementos en exceso
respecto de los requerimientos nutricionales del microorganismo en
cuestin, que pueden causar inhibicin del crecimiento.
4) Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del
crecimiento y formacin del producto.
5) Empleo de fuentes nutricionales no convencionales.
La metodologa ms elemental consiste en realizar experimentos, en
los cuales se vara la concentracin del componente a ensayar
mantenindose constante las concentraciones de los dems
ingredientes.
Optimizacin
Si bien el procedimiento anterior es simple, es evidente que
hace falta una gran cantidad de trabajo preliminar ya que el
operador no conoce de antemano que nutriente es el limitante
del crecimiento.
Cuando son varios los posibles nutrientes limitantes el mtodo
resulta poco prctico.
Por otra parte puede ocurrir que la respuesta obtenida al variar
la concentracin de un componente referida de los niveles de
los otros, se produzca interaccin entre componentes.
Se puede mejorar mucho la optimizacin en batch empleando
tcnicas estadsticas.
Utilizando cultivos continuos es posible obtener un cultivo
limitado por un slo factor o sustrato a lo largo de todo el
experimento, pudindose conocer por lo tanto el efecto que su
variacin ejerce sobre el cultivo al mantenerse los dems
componentes constantes.
4. Cuidados en la esterilizacin
Existen datos, en bibliografa, de clculo de tiempo de mantenimiento para
la esterilizacin de 45,000 lt. de medio (con un valor de No = 2 x 10 7
esp/ml) que demuestra que son necesarios solamente 8.8 min como tiempo
de mantenimiento a 120 C.

Debe tenerse en cuenta que estas consideraciones son vlidas para el
clculo del tiempo de esterilizacin mnimo, a 120 C, en fermentadores
industriales del volumen considerado.
Lo que es importante en este caso es el tipo de recipiente, su geometra y el
volumen de medio a esterilizar.
El tiempo de esterilizacin (o sea el tiempo de mantenimiento a 120 C)
requerido por ejemplo para tubos de ensayo de 18 x 50 mm es de 12-14 min
y para tubos de 38 x 200 mm, de 15-20 min. Erlenmeyers de 2000 ml
requieren de 30-35 min mientras que si son de 125 ml el tiempo es de 12-14
min.
En cambio un frasco pyrex cuadrado de 1000 ml requiere 30-35 min y una
botella de suero de 9000 ml 50-55 min.
Estos tiempos aseguran la eliminacin de esporos bacterianos de las
especies ms resistentes
Es fundamental, adems de esterilizar correctamente los medios, conservar al
mximo la calidad nutriente de los mismos.
Los medios de fermentacin utilizados en la industria son casi siempre
complejos y a menudo con slidos en suspensin, de manera tal que los
cambios que se producen durante la esterilizacin pueden ser
importantes.A veces puede haber modificaciones beneficiosas o
perjudiciales dependiendo del tiempo de esterilizacin.
La naturaleza de las interacciones que tienen lugar entre los componentes
de un medio, durante la esterilizacin por calor, depender no solamente
de la naturaleza de los componentes sino tambin de la temperatura,
duracin del calentamiento, pH del medio, y de la agitacin.
Un ejemplo tpico de interaccin es la reaccin de Maillard que tiene lugar
entre los grupos carbonilos de los azcares con los grupos amino de
protenas, aminocidos, etc. Se forman as productos de condensacin
con lo cual se inactivan significativas cantidades de carbohidratos y
nitrgeno amnico.
Por ese motivo es necesario que los carbohidratos se esterilicen por
separado de los compuestos nitrogenados orgnicos.
Las sales de NH4 + se deben autoclavar a pH 7 o menor, si no el amonio se
volatiliza
En medios qumicamente definidos se puede observar prdida
importante de magnesio, potasio, amonio, sodio y fosfatos por
precipitacin de sales poco solubles como MgNH 4PO4 , MgKP04
y MgNaP04.
Es importante por lo tanto autoclavar las sales de calcio y
magnesio aparte de los fosfatos.
Los aminocidos y factores de crecimiento son muy lbiles al calor.
Entre los aminocidos, el triptofano, glutamina, asparagina, y entre
las vitaminas hidrosolubles, la tiamina, riboflavina y piridoxina son
las ms susceptibles de sufrir descomposicin.
En todos estos casos es aconsejable disolverlas separadamente
en pequeos volmenes de H2 O y luego esterilizarlas por
filtracin.
En la misma forma que la inactivacin de microorganismos puede
ser considerada una reaccin cintica de primer orden, tambin la
destruccin de algunos compuestos sensibles al calor puede ser
tratada en la misma forma.
Caso aplicativo: Cultivo de Levaduras
En las primeras pocas se utilizaba la levadura obtenida de la fabricacin
de cerveza primero y de las destileras despus, hasta que finalmente se
establecieron las plantas de produccin de levadura durante el siglo 19.
La primera planta de produccin comenz a operar en Holanda en
1780 con el llamado proceso Dutch que era anaerobio y que tena
slo rendimiento del 4 al 6% con respecto a la materia prima
usada.
Posteriormente se mejor el rendimiento, que pas a ser del 12-
22% con el proceso Vienna, tambin conducido sin aire, en 1846.
Con la introduccin de la aireacin en el proceso de produccin,
que tiene lugar en 1879, se aumentan considerablemente los
rendimientos, que pasan a ser del 50 al 60% del terico.
La ltima etapa importante de modificacin de la tecnologa tiene
lugar con la alimentacin controlada de azcar a los mostos en
fermentacin, cambio introducido por un cientfico dans, Sak, y
un alemn, Hayduck, en 1919.
Con melazas de remolacha o de caa pueden alcanzarse
rendimientos cercanos al 100% del terico.
Actualmente se est tratando de encontrar otras fuentes de
materias primas alternativas a las melazas, como el suero de
leche hidrolizado
CULTIVO DE LEVADURAS
La produccin mundial de levadura prensada (27-30% de materia
seca) es considerable

Consumo anual per cpita de levadura prensada (27-30% de materia
seca) est en el rango de 1.5 a 2.1 Kg para los pases europeos,
mientras que en pases de Sud Amrica como Chile es de 1 Kg y en
Argentina 0.6 Kg.

Cepas y medios de mantenimiento empleados

Inicialmente fue la levadura de cerveza, el Saccharomyces uvarum,
S.carlsbergensis, el empleado con fines de panificacin.
Se han ensayado tambin muchas otras cepas, no slo del mismo
gnero sino tambin las pertenecientes a distintas especies de
Candida, Hansenula y Zygosaccharomyces, aunque ninguna de ellas
demostr poseer ventajas sobre el Saccharomyces cerevisiae.
Requerimientos nutricionales de Levaduras
Fuentes de carbono y energa que puedan emplear la
Saccharomyces cerevisiae figuran en primer lugar la glucosa y la
sacarosa, aunque tambin pueden emplearse fructuosa,
galactosa, maltosa y suero hidrolizado, ya que la levadura de
cerveza no puede asimilar lactosa.
El nitrgeno asimilable debe administrarse en forma de amonaco,
urea o sales de amonio, aunque tambin se pueden emplear
mezclas de aminocidos. Ni el nitrato ni el nitrito pueden ser
asimilados.
Los macroelementos indispensables son el fsforo que se emplea
comnmente en forma de cido fosfrico y el Mg como sulfato de
magnesio, que tambin provee S.
Son tambin necesarios el Ca, Fe, Cu y Zn como elementos
menores.
Por ejemplo, se ha establecido que S. cerevisiae requiere 200 ug
de Zn, 75 ug de Fe y 12-15 ug de Cu por litro de medio para
crecimiento ptimo.
Requerimientos nutricionales de Levaduras
Un requerimiento esencial est constituido por las vitaminas del
grupo B como biotina, cido pantotnico, inositol, tiamina,
pyridoxina y niacina.

Se ha estimado que los requerimientos de la biotina son de 100
ug de biotina por 100 g de azcar suministrados para el
crecimiento de la levadura.

El cido pantotnico, que es un componente de la coenzima A, es
tambin requerido por muchas especies, mientras pocas especies
requieren inositol.

Con respecto a la tiamina se ha demostrado que aumenta la
actividad fermentativa de la levadura.
Medio de produccin de Levaduras
La materia prima elemental de eleccin es la melaza de remolacha o de caa o
ambas en conjunto, cuando se las dispone.
Los aspectos fundamentales a considerar son la disponibilidad y la composicin de
la melaza incluyendo la presencia de inhibidores o substancias extraas que
pueden contener.
La sacarosa es el azcar predominante en ambas melazas. La materia orgnica no
azcares en la melaza de caa est compuesta fundamentalmente por gomas
solubles y cidos orgnicos sobre todo acontico y compuestos nitrogenados.
En el caso de la melaza de remolacha los no azcares estn constituidos por un
mayor porcentaje de compuestos nitrogenados como betana y cido glutmico y
algunos cidos orgnicos como lctico, mlico, actico y oxlico.
En las cenizas predomina en ambas melazas el K, teniendo mayor porcentaje de
fsforo la melaza de caa que la de remolacha.
Es interesante comparar el contenido de las vitaminas de ambas melazas por la
importancia que tienen estos compuestos en la produccin de levadura.
Como puede verse el contenido de biotina es superior en la melaza de caa y el de
pantotenato de Ca en la remolacha.
La melaza de remolacha tiene mayor cantidad de compuestos nitrogenados
asimilables.
Es por ello que los fabricantes prefieren, si tienen disponibilidad suficiente, utilizar
mezclas de ambas melazas.

Con respecto a componentes extraos (que pueden afectar el
rendimiento) se han detectado en las melazas algunos pesticidas
en el caso de melazas de caa como lindane, aldrin, heptaclor,
dieldrin, etc. en cantidades variables desde trazas hasta 0.21
mgKg 1 en el caso del lindane en melazas de caas de Honolulu.
Las melazas se utilizan generalmente diludas al 50%.
Como los compuestos coloidales de la melaza de caa pueden
causar problemas en varias etapas del proceso de fermentacin,
el mosto es casi siempre clarificado. La clarificacin puede
hacerse antes o despus de la esterilizacin, que se realiza en la
ltima etapa por inyeccin de vapor directa, a la presin
atmosfrica en la mayor parte de los casos.
La clarificacin se realiza fundamentalmente con la ayuda de
centrfugas intermitentes.
Se han mencionado como ventajas de utilizar mostos clarificados
que la levadura es ms fcil para prensar y secar y que adems, la
clarificacin probablemente facilita la transferencia de O2 y
reduce la formacin de espuma.
La melaza es deficiente en algunos macroelementos como
N, P, S, Mg, y tambin Zn en la mayora de los casos, por lo
cual es necesario su agregado a los mostos.
La cantidad de nitrgeno y fsforo a ser agregado depende
de las prcticas comerciales.
El nitrgeno puede representar entre el 6.5 y el 10% de la
levadura seca y el P expresado como P 2O5 vara entre 1.5 y
3.5%.
Ambos valores, sobre todo el contenido de nitrgeno, est
relacionado con el poder fermentativo y la estabilidad de la
levadura en el almacenamiento.
El nitrgeno que se suministra generalmente como agua
amoniacal y el P como cido fosfrico, son alimentados
durante el proceso de acuerdo a programas de
alimentacin que dependen de las prcticas comerciales.
El Mg, S, y Zn son incorporados en forma de sulfatos
El MgS04 se suele incorporar a razn de 1 g de la sal
heptahidratada y el Zn en una proporcin de 10 mg
del sulfato tetrahidratado por Kg de melaza a
fermentar.
Si se utiliza melaza de remolacha es indispensable
agregar biotina
Es a menudo indispensable agregar tiamina y cido
pantotnico
COMPOSICIN DE LA MELAZA DE CAA Y REMOLACHA
Separacin, lavado y empaquetado de Levaduras
Al final de la etapa de produccin comercial las clulas de levaduras son
separadas por centrifugacin y lavadas en una o ms etapas.
Las operaciones de lavado son realizadas para reducir los slidos no debidos a
levaduras que pueden dificultar la filtracin y oscurecer el color de la
levadura prensada.
La eficiencia del sistema de lavado est determinada por la concentracin de
los slidos de levadura, la cantidad del agua usada y el contenido de slidos
del agua de dilucin que tiene importancia cuando el agua de lavado se
utiliza en contracorriente a la crema de levadura.
El proceso de separacin produce una crema de levadura ligeramente
coloreada conteniendo hasta 22% de slidos debidos a clulas y
prcticamente libres de otros materiales.
La crema es almacenada en tanque agitados a 2-4 C con ajuste de pH a 2.5-
3.5.
Como la mayor parte de la levadura se vende como levadura prensada
conteniendo entre 27 y 30% de materia seca, es necesario realizar una etapa
de deshidratacin de la crema (que contiene un 18-22% de slido) hasta esos
valores, lo que se efecta con filtros prensas o filtros rotatorios.
Finalmente la levadura es extrudida en forma de panes de peso variable
segn las exigencias del mercado, que son envueltos en papel celofn o en
otro tipo adecuado de papel
Separacin, lavado y empaquetado de Levaduras
Otra forma de terminar el proceso de produccin es someter la
crema de levadura a un filtrado y extrudido para producir partculas
de 0.5 a 2 mm que son secadas en equipos de lecho fluidizado, lo
que da origen a las llamadas levaduras secas activas o levaduras
instantneas con bajo contenido de humedad, que se envasan al
vaco o en atmsfera de nitrgeno y que pueden conservarse por
perodos prolongados a temperatura ambiente.
Control de calidad
La levadura prensada producida por el proceso descrito debe cumplir con las
exigencias impuestas al cual est destinada, o sea para la panificacin.
La funcin fundamental que debe cumplir es levar las masas preparadas con
harina y conservar esas cualidades durante un tiempo adecuado.
Existen diversas tcnicas de control que se utilizan para verificar la calidad de
la levadura comercial.
Todas se basan en la preparacin de una masa con harina, agua y sal, adems
de levadura.
En algunos casos se mide el tiempo en minutos que tarda en levar una masa
preparada en una mezcladora en condiciones estandarizadas, que es colocada
en un molde a temperatura de 30 C tomando como referencia un tope que
esta conectado a una alarma que suena cuando es alcanzado por la masa
Proceso
de
Produccion
Escalas:
120 Kg intermedio
240 Kg stock
2500 kg pitch
15000 a 100000 kg
final
Procesos posteriores a la produccin de Levaduras
Centrifugacin- Secado (por filtracin, hasta 30 % de
slidos) - Mezclado (con agregado de emulsificantes
y aceites vegetales)- Extrusin- Envasado-
Conservacin en fri
Levadura seca activa
Se somete a un proceso de secado en tnel con aire
caliente forzado luego de la extrusin durante un
periodo total de 6 horas.
Se envasa a vaci o en ambiente de nitrgeno. El
agregado de antioxidantes y surfactantes no inicos
permiten aumentar su estabilidad.

MEDIOS Y METODOS PARA CULTIVOS ANAEROBIOS
Para conseguir una recuperacin ptima de bacterias anaerobias es
fundamental elegir correctamente los medios de cultivo primarios.
La mayora de estas bacterias requieren para su crecimiento
vitamina K
1
y hemina.
Para su aislamiento e identificacin presuntiva se aconseja utilizar
una combinacin de medios enriquecidos no selectivos, selectivos y
diferenciales, entre los que se incluyen:
- Un medio de agar sangre para anaerobios como agar Brucella
o agar Schaedler con un 5% de sangre de carnero, a los que se
aaden vitamina K
1
(1 g/ml) y hemina (5 g/ml).
En estos medios crecen tanto las bacterias anaerobias
facultativas como las anaerobias obligadas.

Agar con yema de huevo (AYE). Cuando se sospecha la presencia de
clostridios, para detectar la produccin de lipasa y/o lecitinasa.
..Un agar selectivo para Clostridium difficile, cuando se investigue la
presencia de esta especie, como agar fructosa-cicloserina-cefoxitina
(CCFA) o agar yema de huevo-cicloserina-cefoxitina (CCEY).

Como medio lquido de enriquecimiento o de mantenimiento se
recomienda usar caldo de tioglicolato sin indicador, suplementado con
vitamina K
1
(200 l) y hemina (20 l).
Este medio se utiliza para recuperar las bacterias anaerobias en caso de
que falle la anaerobiosis en la incubacin de los cultivos primarios, haya
una inhibicin del crecimiento debido a antibiticos o a otros factores, o
bien cuando las bacterias se encuentran en cantidades muy pequeas.
Sistemas de incubacin en anaerobiosis.
Su eleccin viene determinada por el coste, nmero de cultivos y
limitaciones de espacio.

Los ms comunes son las cmaras, jarras o cajas y bolsas de
anaerobiosis. Con independencia del sistema utilizado es importante
monitorizar el ambiente anaerobio con una tira indicadora de azul de
metileno o de resarzurina, y la temperatura de incubacin.

Existen diferentes modelos de cmaras para anaerobios, en las que se
consigue una atmsfera anaerobia mediante una mezcla de gases que
contiene 5% de H
2
, 5-10% de CO
2
y 85-90% de N
2
.

Poseen un sistema de intercambio que consiste en un compartimento
rgido con una puerta interior y otra exterior.


Las jarras son recipientes cilndricos, de metal o de plstico rgido, que
deben cerrarse hermticamente y en los que la atmsfera anaerobia se
obtiene entre 1 y 2 horas despus de introducir unos sobres (GasPak
,
Becton Dickinson) en los que, al aadir H
2
O se libera H
2
y CO
2
El H
2
se
combina con el oxgeno existente formando agua gracias a la presencia
de un catalizador.

Actualmente existen sistemas en los que no hace falta aadir H
2
O o
introducir el catalizador (Anaerogen
, Oxoid).

Mediante una tcnica automatizada, Anoxomat
, tambin se puede
lograr una atmsfera anaerobia en las jarras.

Como ya se ha sealado debe introducirse un indicador de oxgeno, que
suelen ser tiras de papel con azul de metileno, que se decoloran al
desaparecer la presencia del oxgeno.

tubos con medio de cultivo llenos por completo.
medios con sustancias que reaccionan con el oxgeno y lo
excluyen.
dispositivo especial (cmara anaerbica)
cajas o tubos incubados en recipientes con granos
germinados (cebada, centeno)
Cultivos en anaerobiosis
OBTENCION DE CULTIVOS PUROS
1. Siembra en superficie. Extensin y estra.

2. Vertido en placa. Mezclando los microorganismos con agar fundido a 44C, y se
echa luego sobre la placa. Los microorganismos crecen en la superficie y dentro

3. Tcnicas de enriquecimiento. Aplicar el elemento adecuado (por ejemplo
benzoato) al tubo de ensayo, se aslan microorganismos que no se aslan con los
mtodos anteriores y que estn en pequeas cantidades (como pueden ser
aquellos que slo usan benzoato). Se debe realizar varias veces para asegurarnos
que tenemos un cultivo puro. (Otros ejemplos: elevada temperatura para
termfilos; calentamiento a 80C para esporulados y termfilos.)

4. Dilucin seriada. Slo aslo el microorganismo ms abundante. (Lister con
Streptococcus lactis hace diluciones, cada dilucin la siembra en 20 tubos, cuando
de un dilucin dlo crece el 5% la probabilidad de que en ese tubo crezca 1 alo
tipo de microorganismo es del 4.8%, as estamos seguros de que slo existe un tipo
de microorganismo).

OBTENCION DE CULTIVOS PUROS
5. Micromanipulador: aislamos una sola clula utilizando este
aparato.

6. Aislamiento de microorganismos anaerobios.
Micromanipulados. Obtenemos los organismos anaerobios por
una adicin de agar a 44C, mezclamos y tapamos con parafina
(aceite estril). Eliminamos el O2 con agentes reductores
(tioglicolato, aadimos un colorante REDOX para ver cuando se
ha reducido), con una vela que consuma el oxgeno, usamos la
jarra de anaerobios (sistema que produce CO2 + H2 y un
catalizador que consume O2). Cuanto ms sensibles son ms
precauciones tenemos que tomar. PARAFINA

CARACTERIZACIN DE CULTIVOS PUROS
Las colonias deben ser iguales en forma, tamao y color.

Que no existan formas inhibidas.

Al microscopio deben tener un aspecto comn.

Tiene que tener iguales propiedades tintoriales.

Deben ser bioqumicamente y fisiolgicamente iguales.

Una regla importante es no coger nunca de la primera colonia.
Criterio Metodologa de ejemplo

Observacin Macroscpica Observacin de colonias
(formas, pigmentos, etc.)

Observacin Microscpica Tinciones (Gram)
(formas, agrupacin)
(esporas, cpsula, flagelos, etc.)

Metabolismo Bateras bioqumicas
(uso de sustratos
[fermentacin])
(produccin de metabolitos
secundarios)

Otras propiedades Resistencia a antibiticos
(antibiograma, MIC, etc.)
Taxonoma Bacteriana Convencional. Identificacin de especies
Morfologa macroscpica. Colonia Bacteriana
S. aureus
S. aureus
S. aureus
S. aureus
Colonias de
S. aureus
CONSERVACION DE CULTIVOS BACTERIANOS
MANTENIMIENTO

1.- Debemos transferir peridicamente, ya que los tubos de agar se
secan, se evapora el agua.

2.- Se debe cubrir con parafina, con lo cual la transferencia se puede
hacer ms tarde, disminuye el metabolismo y tardan en envejecer.

3.- Se disminuye la temperatura, congelamos las clulas. Para proteger
las clulas y que no se formen cristales que las daen se usa el glicerol

4.- La liofilizacin es la sublimacin a alto vaco de las muestras
congeladas con rapidez.

FORMAS DE CRECIMIENTO. CULTIVOS
Segn la periodicidad del proceso la
fermentacin puede ser continua,
semicontinua o intermitente.
Fermentacin intermitente
Conocida tambin como fermentacin por lotes o fermentacin Batch,
se refiere al crecimiento de clulas en un sistema cerrado, en el cual una
vez cargada la masa inicial del medio, esta no es alterada por adiciones o
retiros posteriores de nutrientes hasta que culmina la fermentacin.
Una consecuencia lgica de este proceso es que en l varan el pH,
temperatura y la concentracin de nutrientes con el tiempo, lo cual
da lugar a una conducta cclica en el crecimiento celular, conocido
como ciclo de crecimiento.
Ciclo de crecimiento microbiano. Cuando un medio de cultivo es
inoculado con un cultivo semilla (inculo), los microorganismos
toman selectivamente los nutrientes del medio y los convierten en
biomasa y productos metablicos, producindose el crecimiento
celular.
Sin embargo, ese crecimiento no es lineal y en los cultivos batch sigue
un patrn conocido como ciclo de crecimiento microbiano, el cual
puede ser dividido en etapas o fases de crecimiento. tales fases son;
a) fase de acostumbramiento, b) fase de aceleracin, c) fase
exponencial, d) fase de desaceleracin, e) fase estacionaria y f) fase
de muerte
CURVA DE CRECIMIENTO
Crecimiento microbiano en medio lquido
Crecimiento en cultivo cerrado (batch)
Fase lag - las clulas se adaptan al nuevo ambiente, aun no se dividen
Fase exponencial (log) - velocidad mxima de crecimiento bajo condiciones
particulares, tiempo de generacin mnimo

Fase estacionaria - sin crecimiento neto, vc=0 estadsticamente = 0
cuando: vc=vm (vel. crecimiento es igual a la de muerte)
nutrientes limitantes, pero suficientes para mantener actividad
acumulacin de desechos, inhibicin del crecimiento

Fase de muerte - velocidad de muerte celular > velocidad de divisin
celular
Luego de la adicin de bacterias al medio lquido fresco se observa la
siguiente cintica de crecimiento
Desventajas de la fermentacin intermitente.
La mayor ventaja de los procesos de fermentacin Batch es su
sencillez.

presenta grandes desventajas ; alto requerimiento de mano de
obra, y demasiados tiempos muertos.

En toda fermentacin batch existen tiempos muertos o periodos
intiles, tales son; la fase de adaptacin y la fase de decaimiento
durante el desarrollo celular, y el periodo de descarga y
renovacin de la carga del reactor para un nuevo batch.

Las fases de adaptacin y decaimiento en el desarrollo microbiano
son exclusivas de los procesos batch y son debidos, como se
explic anteriormente, al proceso de readaptacin de la
maquinaria enzimtica por parte de los microorganismos, as
como al agotamiento del sustrato al final del proceso.
Fermentacin semicontinua
Las desventajas indicadas que afectan la eficiencia de los
procesos batch pueden ser subsanadas atacando sus causas, as
por ejemplo se puede evitar la presencia de las fases de
adaptacin y de decaimiento, si peridicamente:

se extrae medio agotado y se repone con medio de cultivo fresco.
manteniendo la concentracin de sustrato lo suficientemente alta como
para que no haya falta de disponibilidad.
manteniendo la concentracin del producto lo suficientemente baja como
para que no sobrepase los lmites tolerables por los microorganismos,
Asimismo si se desea evitar la formacin de productos
secundarios se puede hacer las adiciones de medio de cultivo
nuevo siempre antes de alcanzar la fase estacionaria, con lo
cual se mantendr el cultivo permanentemente en la fase de
desarrollo exponencial en la cual se sintetizan slo productos
asociados al crecimiento
Proceso semicontinuo
Los parmetros de mayor importancia son el volumen y el tiempo
de adicin, los cuales sern calculados de modo que el cultivo se
mantenga siempre en la fase logartmica de crecimiento.
Si el volumen extrado es muy grande puede diluirse tanto el
medio que la masa microbiana puede volver a la fase de
acostumbramiento, y si el volumen extrado es muy pequeo para
igual tiempo el cultivo puede agotarse y pasar a la fase estacionaria.
Si el tiempo de renovacin es muy grande el cultivo puede
alcanzar a la fase estacionaria y si es muy pequeo el cultivo puede
regresar a la fase de acostumbramiento.
El proceso se maneja de modo que una vez alcanzada la
concentracin X de clulas en la fase exponencial, se extrae un
volumen del medio exhausto igual a:
V= ( X - Xo) d
Luego se agrega igual cantidad de medio de cultivo nuevo,
diluyendo el producto y las clulas hasta un valor Xo.
EXPRESION MATEMATICA DE
Parametros Cinticos
Tiempos de generacin en bacterias
CINTICA DE CRECIMIENTO
Como mnimo un modelo de proceso microbiano debe
tener: balances de materia de la biomasa activa y del
sustrato primario que limita la tasa de crecimiento de la
biomasa.
En La mayora de los casos el sustrato limitador es el
donante de electrones.

Debido a la naturaleza auto cataltica del crecimiento
microbiano, es lgico suponer que la concentracin de
microorganismos influye en la velocidad con que
aumenta la poblacin., rx
rx=X
Velocidad especfica de crecimiento
Para un tipo de microorganismo dado depende principalmente:
La composicin y concentracin del medio de cultivo.
Presencia de inhibidores
Temperatura y pH
x = concentracin de microorganismos g/1
t = tiempo, h
= velocidad especfica de crecimiento h
-1
Parmetros estequiomtricos
Durante el crecimiento microbiano se produce un proceso de
reduccin de la concentracin de sustrato, y de incremento en la
concentracin del producto.
La relacin entre estas variables darn una idea clara de la
economa y la eficiencia del proceso.
Se puede establecer una relacin estequiomtrica entre estas
variables a travs de los siguientes parmetros: balance de
materiales para el sustrato, coeficientes de crecimiento, y
coeficiente de mantenimiento.
Balance del consumo de sustrato. El sustrato es utilizado por las
clulas como fuente de energa y como materia prima para la
sntesis de macromolculas constitutivas necesarias para el
crecimiento celular,
por tanto en un tiempo cualquiera, el consumo de sustrato (S)
estar dado por:
AS = AS asimilado + AS convertido + AS energa de + AS energa
en biomasa en producto crecimiento de manteni-
miento
Coeficiente de rendimiento biomasa-sustrato
Est dado por la relacin entre la variacin de la biomasa y la variacin del
sustrato, segn la expresin.
Yx/s= -AX/AS
En un cultivo intermitente existe diferencia entre el coeficiente de crecimiento
aparente y el coeficiente de crecimiento verdadero,
coeficiente de crecimiento aparente se debe a la variacin de biomasa y
sustrato al final del proceso.
coeficiente de crecimiento verdadero es una medida instantnea de
tales variaciones.
Para organismos aerobios que crecen en un medio de glucosa se
tiene que los Yx/s tpicos son:
para levaduras y bacterias vara entre 0.4 y 0.6 g/g,
en condiciones anaerobias el valor de Yx/s es substancialmente menor.
Para substratos mas o menos reductores, el valor del coeficiente
cambiar. As, si el sustrato es el metano, y los m.o. son bacterias el
Yx/s tendr valores entre 0.6 y 1.0 g/g
Coeficiente de Rendimiento biomasa-oxgeno.
Esta dado por la relacin de la biomasa producida y
el consumo de oxgeno del medio.
Yx/o2= -AX/AO2
El valor de Yx/o2 para bacterias y levaduras aerobias
que crecen en un medio de glucosa es de 0.9 a 1.4
g/g, al igual que en el caso del Yx/s, un cambio en el
sustrato ocasionar variaciones en el valor de este
coeficiente, as los mismos microorganismos en las
mismas condiciones, pero en un medio con metano
como sustrato tendrn un Yx/o2 de alrededor de 0.2
g/g.
Coeficiente de formacin de producto (qr), o Yp/s.
Est dado por la relacin.
Yp/s = - AP/AS
Este valor tambin puede variar segn el producto y la forma
como se producen.
Los productos microbianos pueden ser clasificados en tres
grandes categoras: productos asociados al crecimiento,
productos no asociados, y productos asociados mixtos.
Los productos asociados al crecimiento son producidos
simultneamente al crecimiento microbiano, en este caso la
relacin especfica de formacin de producto es
proporcional a la tasa especfica de crecimiento (). Esto
sucede durante la formacin de productos del metabolismo
primario, pero slo en la fase de crecimiento exponencial.
La produccin de una enzima constitutiva es un ejemplo
tpico de un crecimiento asociado.
Coeficientes para m.o aerobios
Organismo Sustrato
Yx/s Yx/o
2

g/g g/mol g/g-C g/g
Enterobacteraergenes Maltosa 0.46 149.2 1.03 1.50
Manitol 0.52 95.2 1.32 1.18
Fructosa 0.42 76.1 1.05 1.46
Glucosa 0.40 72.7 1.01 1.11
Candida utilis Glucosa 0.51 91.8 1.28 1.32
Penicillium chrysogenum glucosa 0.43 77.4 1.08 1.35
Pseudomonas fluorescens glucosa 0.38 68.4 0.95 0.85
Rhodopseudomonas spheroides glucosa 0.45 81.0 1.12 1.46
Saccharomyces cerevisiae Glucosa 0.50 90.0 1.25 0.97
Enterobacter aergenes Ribosa 0.35 53.2 0.88 0.98
Succinato 0.25 29.7 0.62 0.62
Glycerol 0.45 41.8 1.16 0.97
Lactato 0.18 16.6 0.46 0.37
Piruvato 0.20 17.9 0.49 0.48
Acetato 0.18 10.5 0.43 0.31
Coeficientes para m.o aerobios
Organismo Sustrato Yx/s Yx/o
2

g/g g/mol g/g g/mol
Cndida utilis Acetato 0.36 21.0 0.90 0.70
Pseudomonas fluorescens Acetato 0.28 16.8 0.70 0.46
Cndida utilis Etanol 0.68 31.2 1.30 0.61
Pseudomonas fluorescens Etanol 0.49 22.5 0.93 0.42
Klesbiella sp. Metanol 0.38 12.2 1.01 0.56
Metylomonas sp. Metanol 0.48 15.4 1.28 0.53
Pseudomonas sp. Metanol 0.41 13.1 1.09 0.44
Metyloccocus sp. Metano 1.01 16.2 1.34 0.29
Pseudomonas sp. Metano 0.80 12.8 1.06 0.20
Metanol 0.60 9.60 0.80 0.19
Pseudomonas metnica Metano 0.56 9.00 0.75 0.17
e. Coeficiente de mantenimiento (m).
Se le usa para describir la relacin de sustrato
usado para el mantenimiento celular.
MODELOS CINETICOS
Modelos no estructurados. Son modelos
aproximados.
Modelo de Monod,
Modelo de Contois,
Modelo de Mosser,
Modelos estructurados. Estos modelos tienen una
capacidad predictiva mucho mas grande y para
ello tienen en cuenta las interacciones cinticas
entre los componentes celulares y los
componentes del medio.
Modelo de Monod
S = Concentracin del sustrato limitante
m
= Es la velocidad de crecimiento especfica mxima
K
s
= Constante de saturacin
Est inversamente relacionada con la afinidad del microorganismo por el sustrato.
Cuando S > > Ks, toma el valor de
m
y r
x
slo depende de x.
En general Ks tiene valores muy bajos, del orden de los mgl-1 por tanto
concentraciones relativamente bajos de S son suficientes para hacer que =
mx
.
En promedio:
Las bacterias poseen valores de
m
cercanos a 0.9 h
-1
Las levaduras 0.45 h
-1
Los hongos filamentosos 0.25 h
-1
Linearizacin del modelo
Modelo de Contois
La ecuacin de Contois muestra una dependencia de
la tasa especfica de la reaccin con respecto a la
concentracin de organismos activos presentes.

| |
] [S x K
S
sx
m
+
=

Ejemplo
Una cadena de microorganismos estuvo en un cultivo BATCH en
crecimiento, en sustrato de glucosa y los siguientes datos fueron
obtenidos.
TIEMPO
(h)
CONC. CELULAS (X)
(g/l)
ln X CONC. GLUCOSA
(g/l)
0 1.25 0.2231 100.00
9 2.45 0.8961 97.00
16 5.10 1.6292 90.40
23 10.50 2.3514 76.90
30 22.00 3.0910 48.10
34 33.00 3.4965 20.60
36 37.50 3.6243 9.38
40 41.00 3.7136 0.63
a) Calcular la velocidad mxima de crecimiento.
b) Calcular la variacin de sustrato
c) Cul es la concentracin celular mxima que podra esperarse si 150g de
glucosa fueron usados con la misma cantidad de inoculo.
t A
) (h t
X ln A
X ln
Rpta. a)
t
X
x
y
m tg
A
A
=
A
A
= =
ln
Sustrato Conc de Rango
Celular Conc de Rango
sustrato S
celuar X
y
.
.
=
A
A
=
1
1 . 0
16 36
1 . 5 ln 5 . 37 ln

=
= h m
b) Rpta.
Calcular la variacin de sustrato por el crecimiento celular.
sustrato de gr clulas de gr y / 40 . 0
100 63 . 0
25 . 1 41
=
=
c) Rpta.
lt
clulas g
X
X
S Y X X
25 . 60
) 150 ( 4 . 0 25 . 1
.
max
max
0 0 max
=
+ =
+ =
Modelo logistico
Los modelos cinticos descritos anteriormente
representan el comportamiento de los
microorganismos pero slo en la fase de crecimiento
exponencial de un cultivo batch (donde es
constante), pero si se quiere representar todo el
proceso del cultivo batch, es necesario recurrir al
modelo logstico.
Este modelo es capaz de arrojar una curva sigmoidal, y
se le obtiene combinando la ecuacin de Monod con la
expresin de la tasa de crecimiento y la ecuacin de
rendimiento biomasa-sustrato (Yx/s).

dX = m(Yx/s.So + Xo X) . X
dt (Ks.Yx/s + Yx/s.So +Xo-X)
Modelos estructurados.
Un problema importante al construir un modelo de este tipo es
decidir cuantos componentes celulares deben tomarse en cuenta.
Hay modelos que consideran dos componentes y otros que
consideran hasta cuarenta componentes. Un resultado aceptable se
puede producir usando por lo menos 3 componentes celulares, sin
embargo, mientras mas componentes se consideren el modelo ser
mas preciso, pero tambin mas complejo.
En estos modelos es necesario considerar dos factores nuevos: las
concentraciones intrnsecas, que se refieren a la cantidad de un
componente por unidad de masa celular (Ci/X), y las concentraciones
extrnsecas o cantidad de un componente por unidad de volumen del
reactor.

d(Ci/X) = (1.dCi) - ( Ci. dX/dt)
dt X.dt X. X

donde: Ci, es la concentracin de cada componente considerado.
Cuando existe ms de un substrato limitante se pueden
usar otros modelos conocidos como modelos
multiplicativos, modelos aditivos y modelos nominativos
Son desarrollados con amplitud en el libro de Shuler-
Kargi.
El modelo aditivo toma la siguiente forma:
= W1. |S1| + W2.|S2| + ........... + Wn. |Sn|
max

donde W1, W2, ..., Wn son funciones del peso, y sigue
la cintica de Monod.

Existen modelos desarrollados para cinticas del
crecimiento en presencia de inhibidores y para
organismos filamentosos
MEDICION DEL CRECIMIENTO
MICROBIANO
TECNICAS DE MEDICION
Diversos mtodos de cuantificacin celular
Se pueden agrupar en dos grandes categoras:
mtodos directos y
los mtodos indirectos.
Los directos obtienen una medida directa de la masa
celular.
- que miden la densidad numrica de las clulas: tcnicas de
conteo,
- que miden la concentracin de masa celular: peso celular, y
absorbancia de luz.
Los mtodos indirectos miden la concentracin de algn
componente celular (ADN, protenas, etc) y establecen
una relacin entre tal compuesto y las clulas.
a. Conteo celular
Se basan en contar directamente en un microscopio las
clulas, determinando la masa celular por unidad de volumen,
con ese fin se colocan muestras del cultivo adecuadamente
diluidas en porta-objetos y se procede a contar las clulas en
un microscopio.
Para facilitar esta labor existen diversos accesorios que hacen
menos tedioso el conteo:
Cmaras de Neubauer,
Cmara de Petroff-Hausser,
el hemocitmetro
los microscopios graduados como de Helber.
En ellos se cuenta con rejillas calibradas, de modo que se
pueda contar el nmero de clulas por cada uno de los
cuadrantes de la rejilla, que luego se puede multiplicar por el
total de cuadrantes, y por las veces que se diluy la muestra
para obtener la densidad celular.
Cmaras de recuento
Identificacin

En las dos superficies laterales, sin trabajar, de la
cmara de conteo estn impresas las siguientes
indicaciones:

El sistema de la red de conteo
El nombre y la marca registrada del fabricante
La profundidad de la cmara en milmetros
La superficie del cuadrado ms pequeo en mm2
Cmara de Neubauer

Es una cmara de contaje adaptada al microscopio de
campo claro o al de contraste de fases.
Se trata de un portaobjetos con una depresin en el
centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la
ayuda de un diamante una cuadrcula como la que se ve
en la imagen.
Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre
dos lineas consecutivas de 0.25 mm.
As pues el rea sombreada y marcada L corresponde a
1 milimetro cuadrado.
La depresin central del cubreobjetos est hundida 0.1
mm respecto a la superficie, de forma que cuando se
cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie
marcada 0.1 milmetro, y el volumen comprendido
entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1
milmetro cbico, es decir 0.1 microlitro
Cmara de Neubauer
El gran cuadrado en el centro est
adicionalmente dividido en 5
cuadrados en grupos de 5 con una
longitud lateral de 0,2 mm,
respectivamente, y un contenido de
superficie de 0,04 mm2. A su vez, los
cuadrados de los grupos estn
subdivididos en 16 cuadrados
pequeos de 0,0025 mm2 cada uno.
Si contamos las cuatro reas
sombreada (L) observando un total
de x clulas entre las cuatro reas, la
concentracin en la suspensin
celular ser :
concentracin en la suspensin
(clulas / mL) = 10000 (x/4)
En la imagen puedes observar el
aspecto de una de las regiones
marcadas como L y que en el
microscopio se ven como una
cuadrcula de 16 pequeos
cuadrados de 0.25 milmetros de
lado.

Cmara de Neubauer
Tcnica de conteo

El recuento presupone un conocimiento exacto de las lneas lmite
de las cmaras de conteo utilizadas. stas se pueden ver en la
ilustracin.

Para que las clulas, que estn en o cerca de las lneas de
limitacin, no se cuenten dos veces o se sobrepasen en el conteo,
hay que atenerse a determinadas reglas.

Se cuentan todas las clulas dentro de una zona de medicin
definida.

Tambin se cuentan las clulas (marcadas en negro), que se
apoyan o tocan en las 2 caras , p.ej. en la lnea de medida
izquierda y superior.

Esto tambin es vlido para el tipo de la operacin de conteo
propiamente dicha, que debe efectuarse en forma de meandro.

Tcnica de conteo
Cmara de Neubauer
Observaciones sobre el recuento

a) En todos los conteos de cmaras, el diafragma del condensador en el
microscopio deber estar cerrado en gran parte.

b) La diferencia de las clulas contadas en los cuadrados grandes y en los
cuadrados de grupos no podr ser superior a 10 clulas.

c) En todos los conteos de clulas, han de realizarse dobles determinaciones.
Despus del recuento de la red de conteo superior, se recuenta como control
tambin la red de conteo inferior. Ha de tenerse en cuenta que la cmara no
est resecada. Esto puede evitarse cuando la cmara inferior se llene justo
poco antes del recuento y se recuente despus del tiempo de sedimentacin.

d) El valor medio de los conteos se aplica luego en una frmula de clculo o se
multiplica por el factor correspondiente.

Cmara de Petroff-Hausser
b) Equipos automticos de contaje celular
Existen nuevos instrumentos con contadores automticos que por
ejemplo usan la alta resistencia elctrica de las clulas para contarlas
por pulsos de resistencia
"Cell Coulter" de Beckman-Coulter
El principio del contador celular se basa en la medida de los cambios
en la resistencia elctrica que se producen cuando una partcula no
conductora en suspensin en un electrolito atraviesa un pequeo
orificio.
Una pequea abertura entre los electrodos es la zona sensible a
travs de la que pasan las partculas que se encuentran en
suspensin.
Cuando una partcula atraviesa el orificio desplaza su propio
volumen de electrolito. El volumen desplazado es medido como un
pulso de voltaje. La altura de cada pulso es proporcional al volumen
de la partcula.
controlando la cantidad de la suspensin que circula a travs del
orificio es posible contar y medir el tamao de las partculas.
Es posible contar y medir varios miles de partculas por segundo,
independientemente de su forma, color y densidad.
CONTADOR CELULAR
c.- Conteo en placas.
En los mtodos anteriores se determina el nmero de clulas totales, pero
en muchos casos nicamente interesa contar clulas viables.
Se define como clula viable, aquella clula que es capaz de dividirse y
formar una progenie y la manera usual para realizar un recuento de clulas
viables es determinando el nmero de clulas en la muestra, capaces de
formar colonias sobre un medio de cultivo slido (agar) y esto se conoce
como recuento en placa.
se puede hacer el conteo usando Placas Petri con un medio en agar-agar.
Se diluye varias veces la muestra lquida y luego se esparce sobre la
superficie slida 0.1 ml. de la muestra, incubando hasta que transcurran
unas 25 generaciones, luego de lo cual cada clula dar lugar a colonias, las
cuales pueden ser observadas a simple vista y contadas como tales.
Diseminacin en placa (siembra en placa por extensin).- Se asume que
cada colonia surgi de una simple clula, contando el nmero de colonias
uno puede calcular el nmero de clulas viables en la muestra
Este mtodo tiene la desventaja de ser muy largo, pues suele requerir unas
24 horas de incubacin, y exigir muy buenas tcnicas de esterilizacin,
adems puede dar errores cuando se trata de clulas agregadas en cuyo
caso una colonia no ser necesariamente producida por una clula
individual.

Medidas directas del crecimiento bacteriano.
1. Recuento de clulas totales.
- Microscopia -
2. Recuento de celulas viables.
- Recuento de colonias -
Conteo en
placas
Conteo en placas.
Se asume que cada colonia proviene de la divisin sucesiva de
una sola clula, conociendo el volumen sembrado y la dilucin de
la cual proviene y contando el nmero de colonias en la placa
correspondiente se puede calcular el nmero de clulas viables
en la muestra
Debido a que es difcil saber si una sola bacteria dio origen a una
colonia, se expresa usualmente el nmero de clulas viables
como unidades formadoras de colonias (UFC).
Para realizar el recuento se seleccionan las placas de la que
contengan entre 25 y 250 colonias.
A pesar de las deficiencias que pueda presentar la tcnica del
recuento en placas, se usa frecuentemente, y con resultados
satisfactorios, para la estimacin de las poblaciones bacterianas
en la leche, agua, y otros productos.
Es fcil de realizar y se adapta a la medicin de poblaciones de
cualquier densidad.
SIEMBRA POR EXTENSION Y VERTIDO EN PLACA
Recuento en filtro de nitrocelulosa
Placas petrifilm (3M)
Nmero mas probable (NMP)
utilizado para microrganismos que no crecen bien en medio slido.

A) dilucin a partir de un alto volumen de inculo (ex. 10 mL)

B) dilucin a partir de un volumen medio de inculo (ex. 1 mL)

c) dilucin a partir de un bajo volumen de inculo (ex. 0,1 mL)

d) contage de n de tubos positivos

e) estimativa de n de clulas/mL de bactrias
Nmero mas probable (NMP)
10 mL de inculo
1 mL de inculo
0,1 mL de inculo
6 tubos positivos (com
crescimento bacteriano)
3 tubos positivos
1 tubos positivos
d. Peso seco.
mtodo mas comnmente usado para la determinacin de la concentracin
celular, y consiste en secar volmenes conocidos de medio de cultivo con las
clulas en crecimiento, hasta obtener un peso constante, expresando la
concentracin en g/l.

Cuando se trata de clulas de levadura que pueden ser fcilmente
centrifugadas se puede usar una centrfuga con velocidades de 4-6x103rpm
con lo cual se logra obtener una masa hmeda de clulas, luego esta masa se
lava y seca a 80C por 24 horas, para proceder a pesar en un portaobjetos
debidamente destarado.

Cuando se trata de clulas bacterianas difciles de centrifugar se usan filtros de
membranas (ultrafiltros) para obtener la masa celular hmeda, y luego se
procede a secar, como en el caso anterior.

Esta tcnica slo puede ser usada cuando el medio no contiene slidos en
suspensin como es el caso de: melazas, celulosa, o licor de maz.

Sin embargo, en estos casos se puede intentar corregir el peso final para
considerar la fraccin que corresponde a los slidos del medio. Adicionalmente
el mtodo presenta la desventaja de requerir muestras muy grandes y de ser
sumamente lentos.

e. Absorcin de luz.
En esta tcnica se aprovecha la particularidad de las clulas para desviar la
luz de una celda espectrofotomtrica.

Se puede usar un turbidmetro o un espectrofotmetro para medir la
densidad ptica (OD) a 600- 700 nm de longitud de onda.

En este caso las clulas se comportan como simples partculas en
suspensin con capacidad para desviar y absorber la luz.

En cualquier caso tal efecto sobre el haz incidente de luz ser proporcional a
la concentracin de clulas presentes en el cultivo de acuerdo con la ley de
Beer.

Debe tenerse en cuenta para estos casos que existen algunos factores como;
el tamao, la forma y el color de las clulas que pueden variar la relacin
entre la absorbancia y el nmero de clulas, asimismo, si se usa un tinte
para observar las clulas viables, el color afectar los resultados.

Valores altos de OD (mayores a 0.3) afectarn la linealidad en la respuesta.

Este mtodo es apropiado para medios libres de partculas en suspensin.
Medidas indirectas del crecimiento
bacteriano
Turbidez. Es un mtodo muy rpido y til de
medir el crecimiento bacteriano.
- fotmetro -
- espectrofotmetro -
Esquema del proceso
d. Masa de un componente celular.
Cuando es difcil usar alguno de los mtodos
anteriores se puede usar la medida de algn
componente celular que sea parte constante del
peso seco total de las clulas, entonces se cuantifica
por algn mtodo analtico, el componente
escogido, con lo cual se tendr una estimacin
indirecta de la biomasa presente.

Tales componentes suelen ser: protenas,
nitrgeno, ADN, RNA, y ATP celulares, los cuales
estn presentes en cantidades mas o menos
constantes por especie.

e. Efectos fsicos.
Se puede tambin medir la variacin
de algn factor externo por efecto
del crecimiento celular, tales como;
el calor generado por el crecimiento,
o el oxgeno captado por el medio, y
que deja un vaco medible. tcnicas
son rpidas y efectivas pero slo son
tiles para grandes
Fermentacin en cultivo continuo
El cultivo continuo se refiere al crecimiento de clulas en un
sistema abierto, en el cual constantemente se suministra
nuevo medio de cultivo al bioreactor, el cual se mantiene en
una agitacin constante, de modo que constantemente est
ingresando medio con nutrientes frescos y se est retirando
producto y clulas.

Despus de un cierto tiempo, el sistema alcanza un estado
estable donde la concentracin de clulas, productos y
sustrato permanecen constantes.

De esta forma los cultivos continuos proporcionan condiciones
ambientales constantes para el crecimiento celular, y para la
formacin de productos y se pueden obtener productos de
calidad uniforme
CULTIVO CONTINUO DE MICROORGANISMOS
Esquema de proceso continuo
QUIMIOSTATO
Control por QUIMIOSTATO
en un tanque agitado que opera con dos elementos de control: la tasa de
flujo y la concentracin de un nutriente limitante tal como la fuente
carbonada o nitrogenada.

Los dems nutrientes en el medio se encuentran en exceso y junto al
nutriente esencial determinado como factor limitante son aportados al
tanque continuamente desde un reservorio, al mismo tiempo que se saca del
recipiente el exceso de organismos y de medio.

En el quimiostato, la tasa de crecimiento se controla por la tasa de flujo o la
tasa de dilucin (velocidad a la que se bombea el medio en el tiempo),
mientras que la densidad de la poblacin est controlada por la
concentracin del nutriente limitante.

Si la tasa de dilucin se incrementa y la concentracin de nutrientes es
constante, la densidad de la poblacin es constante y la tasa de crecimiento
se elevar.

Cuando el sistema est en equilibrio, el nmero de clulas (densidad de la
poblacin) y el estado nutricional permanecen constantes, a esto se le
conoce como estado estable o estado sostenido.
Relacin de la temperatura y velocidades de crecimiento de un psicrfilo, un
mesfilo, un termfilo y dos hipertermfilos diferentes. En la grfica se indican
las temperatura ptimas de esos organismos

Capitulo 6

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