DETERMINACIN DE

PROTENAS
A. LEY DE LAMBER Y BEER
B. CURVA PATRN
C. MTODO UV: ABS 280NM
D. MTODOS COLORIMTRICOS:
BIURET, LOWRY, BRADFORD, BCA.
Comparacin de mtodos
CUANTIFICACIN DE PROTENAS

Determinar la concentracin de protenas en una

muestra biolgica es una tcnica de rutina bsica
cuando se aborda un esquema de purificacin de
una protena concreta, cuando se quiere conocer la
actividad especfica de una preparacin
enzimtica, para el diagnstico de enfermedades,
as como para otros muchos propsitos.
CUANTIFICACIN DE PROTENAS
Existen diferentes mtodos para la
cuantificacin de protenas. Muchos de estos
mtodos se basan en:
a) la propiedad intrnseca de las protenas para
absorber luz en el UV,
b) para la formacin de derivados qumicos, o
c) la capacidad que tienen las protenas de unir
ciertos colorantes.
LEY DE LAMBERT - BEER

Relaciona la absorcin de luz con

las propiedades del material
atravesado.
LEY DE LAMBERT Y BEER
La ley explica que hay una relacin exponencial
entre la transmisin de luz a travs de una
sustancia y la concentracin de la sustancia, as
como tambin entre la transmisin y la longitud
del cuerpo que la luz atraviesa.
Si conocemos l y A, la concentracin de la
sustancia puede ser deducida a partir de la
cantidad de luz transmitida.
A = cl
Donde:
A = absorbencia
= Coeficiente de extincin molar.
l = longitud de la celda.
COEFICIENTE DE EXTINCIN
MOLAR

Es una medida de la cantidad de luz absorbida

por unidad de concentracin.

Un compuesto con un alto valor de coeficiente

de extincin molar es muy eficiente en la
absorcin de luz de la longitud de onda
adecuada y, por lo tanto, puede detectarse por
medidas de absorcin cuando se encuentra en
disolucin a concentraciones muy BAJAS.
MTODOS PARA DETERMINAR PROTENAS
Intervalo del UV
Todas la protenas pueden ser detectadas, sin
embargo solo ciertos residuos de aminocidos son
los que se leen en la regin del UV.

Por reacciones colorimtricas:

Enlaces peptdicos o ciertos aminocidos

reaccionan y los productos coloridos son los que
se cuantifican
PROTENAS Y LA ABSORCIN EN LA
REGIN UV
Las bandas de absorcin ms significativas se
encuentra en el ultravioleta cercano, en el
intervalo de longitud de onda entre 230 y 300 nm.
Concretamente absorben en este rango las
cadenas laterales de los aminocidos
aromticos, la histidina y la cistina.
La cistina presenta una banda centrada a 250
nm, n-->s* (max ~ 300 M-1.cm-1), pero apenas
se puede considerar, ya que es muy dbil y el
porcentaje relativo de puentes disulfuro es muy
pequeo en una protena.
 PROTENAS
Los aromticos absorben de 260-290 nm. La
fenilalanina. Es el menos importante cuantitativamente, aunque
muestra un espectro complejo con mltiples bandas
diferenciadas en torno a 250-260 nm. Presenta tambin bandas
de mayor energa que solapan con el espectro del enlace peptdico
en 215 y 180 nm. Sin embargo como no absorbe por encima de
280 nm su contribucin al espectro en la zona del ultravioleta
cercano de protenas suele ser pequea.

La tirosina presenta un mximo a 275 nm con un

hombro a 285 nm. La banda se desplaza a mayores
longitudes de onda cuando se produce la desprotonacin del OH
del anillo aromtico.

El triptfano agrupa al menos tres bandas diferentes.bajo el

espectro centrado a 280 nm. Tambin presenta bandas en la
zona del UV lejano.
CALCULAR LA CONCENTRACIN DE
PROTENAS: MTODO UV

Se usar la ecuacin de Lambert y Beer.

El coeficiente de extincin molar de la Albumina
de Suero Bovino (BSA) que es 43 824 M-1 cm-1 o
bien usando el coeficiente dado en porcentaje que
es de 6.6 para una solucin de BSA al 1% (10
mg/mL)
La frmula para determinar la concentracin de
la muestra.

DESARROLLO EXPERIMENTAL
DETERMINACIN DE PROTENAS POR EL
MTODO ABS 280 NM.

1. Descongelar slo las alcuotas de las fracciones

de protena destinadas para este protocolo y que
fueron recolectadas durante la purificacin de la
lactato deshidrogenasa.
2. Mantener las fracciones en un recipiente con
hielo durante todo el experimento.
3. Colocar las fracciones en cuvetas de
metacrilato grado UV.
4. Leer la absorbancia las fracciones que te
indique t profesor a la longitud de 280
nm.
CALCULAR LA CONCENTRACIN DE PROTENAS
CON LA FRMULA Y LLENAR LA TABLA

Tubo Absorbancia Concentracin (g/L)

F0

F1

F2

F3

F4

FPA

FPB

NO SE NECESITA HACER CURVA PATRN

PERO PARA LOS MTODOS COLORIMTRICOS SE
NECESITA UNA: CURVA PATRN

Es un marco de referencia que se construye de

cantidades conocidas de una sustancia (por ejemplo
la albmina srica bovina) que se utiliza para
determinar la cantidad de protenas presente en
una muestra incgnita.
En determinaciones colorimtricas, se cumple una
relacin proporcional entre la magnitud o
intensidad de color que da una reaccin y la
cantidad del reactivo que la provoca.
La intensidad de color se mide con un
espectrofotmetro o colormetro en funcin de las
concentraciones crecientes de la sustancia se
obtiene una recta. Es decir, a mayor cantidad de
protena, mayor cantidad de producto de reaccin y
por lo tanto, mayor intensidad de color.
BLANCO
La absorbancia de una solucin es la resultante de la
absorbancia del soluto cuya concentracin se desea conocer
y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos)
que absorben tambin a esa longitud de onda.

Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para

ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga
todas los componentes del sistema menos aquel que se
desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia
de ste debe restarse a las muestras problema y a los
patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a
absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmitancia.
CURVA PATRN
BIURET
Se basa en la formacin de un complejo coloreado
entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces
peptdicos en medio bsico.
1Cu2+ se acompleja con 4 NH.
La intensidad de coloracin es directamente
proporcional a la cantidad de protenas (enlaces
peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de
manera que pocas sustancias interfieren.
La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se
recomienda para la cuantificacin de protenas en
preparados muy concentrados (por ejemplo en
suero).
REACCIN DE BIURET
La reaccin debe su
nombre al biuret, una
molcula formada a
partir de dos de urea
(H2N-CO-NH-CO-NH2),
que es la ms sencilla
que da positiva esta
reaccin, comn a todos
los compuestos que
tengan dos o ms
enlaces peptdicos
consecutivos en sus
molculas.
BIURET
La presencia de protenas en una mezcla se
puede determinar mediante la reaccin del
Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en
solucin acuosa alcalina (gracias a la presencia
de NaOH o KOH).
La reaccin se basa en la formacin de un
compuesto de color violeta, debido a la
formacin de un complejo de coordinacin entre
los iones Cu2+ y los pares de electrones no
compartidos del nitrgeno que forma parte de los
enlaces peptdicos.
LOWRY
ESTE PROCEDIMIENTO INVOLUCRA LA
FORMACIN DE UN COMPEJO COBRE -
PROTENA EN SOLUCIN ALCALINA.
ESTE COMPLEJO REDUCE AL REACTIVO
FOSFOMOLIBDICO- FOSFOTUNGSTATO LO
QUE PRODUCE UNA INTENSA COLORACIN
AZUL.
ESTE MTODO CONSTA DE DOS ETAPAS:

Primera reaccin Biuret. Los iones Cu2+, en medio

alcalino, se unen a las protenas formando complejos con
los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos
complejos Cu2+-protena tienen un color azul claro. Adems,
provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional
de la protena, exponindose los residuos de tirosina que
van a participar en la segunda etapa de la reaccin. El Cu2+
se mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo
con tartrato.
Segunda reaccin reactivo de Folin- Ciocalteau. La
reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-
Ciocalteau por los grupos fenlicos de los residuos de
tirosina presentes en la mayora de las protenas, actuando
el cobre como catalizador.
El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau
es el cido fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al
ser reducido por los grupos fenlicos da lugar a un complejo
de color azul intenso.
BIBLIOGRAFA
O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr y R.J. Randall. J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)

Este mtodo se basa en la reaccin de Biuret, donde los enlaces

peptdicos reaccionan con el Cu2+ en condiciones alcalinas produciendo
Cu+, despus se reduce el reactivo de Folin por las protenas tratadas
con cobre a azul heteropolimolibdeno. El color se desarrolla en la
segunda reaccin (con el fosfomolibdotungstato) y es primeramente
debida a los aminocidos tirosina, triptfano, y en menor grado por
cistena, cistina e histidina.
BRADFORD
Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue
G-250 (tambin Serva Blue) a las protenas.
El colorante, en solucin cida, existe en dos formas
una azul y otra naranja.
Las protenas se unen a la forma azul para formar un
complejo protena-colorante con un coeficiente de
extincin mayor que el colorante libre.
Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido,
barato y pocas sustancias interfieren en su
determinacin.
Entre las sustancias que interfieren estn los
detergentes y las soluciones bsicas.
BRADFORD
El ensayo de Bradford es un ensayo colorimtico
para la medicin de protena total en una
solucin dada.
Involucra la unin de un colorante el Coomassie
Brilliant Blue a las protenas en un medio cido

y su conmitante cambio de absorbancia de 465 a

595 nm.
Debido a que el reactivo causa la precipitacin de
la protena con el tiempo, la linearidad de la
reaccin se encuentra comprometida. Las
mediciones hay que concluirlas rpidamente.
DIFERENTES
El azul de Coomassie se une aproximadamente
estequiomtrica, entonces el mtodo de deteccin
tanto en solucin como en PAGE-SDS, gel u otras
matrices es el mtodo preferido, cuando las
concentraciones de protenas se deben
determinar por densitometra.
CAMBIO DE ABSORBANCIA DEL COOMASIE
BLUE
Los aminocidos que
son reconocidos por el
colorante son arginina,
fenilalanina, triptofano
y prolina.
El azul de Coomasie
libre se detecta a 470
nm mientras que la
forma unida a
protenas a 595 nm. Lo
anterior debido a que
el Coomassie se une
preferencialmente a
los aa mencionados y
cambio de un estado
catinico a uno inico
EL AZUL DE COOMASIE Y LOS
AMINOCIDOS QUE RECONOCE
BCA
El cido bicinconnico, sal sdica, es un compuesto capaz de
formar un complejo prpura intenso con iones Cu1+ en medio
alcalino.
Este reactivo forma la base de un mtodo analtico capaz de
monitorizar el in cuproso producido en una reaccin entre las
protenas con Cu2+ en medio alcalino (reaccin de Biuret).
La estabilidad del reactivo y el cromforo proporciona un
mtodo para la cuantificacin de protenas que es sencillo,
rpido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a
compuestos que afectan a otros mtodos.
OH-
Protena + Cu2+ Cu1+

Cu1+ + BCA complejo prpura BCA- Cu1+

CUADRO COMPARATIVO DE SENSIBILIDAD DE
LAS TCNICAS DE CUANTIFICACIN DE
PROTENAS