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UNIVERSIDAD NACIONAL

AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS
SUPERIORES “ZARAGOZA”

Laboratorio de Bioquímica Celular y Tejidos I

CURVA ESTANDAR DE PROTEÍNA

Concentración de albúmina en la clara de huevo

Profesora:
Leonor Aguilar

Equipo: 3

Integrantes:

Flores Ramírez Samuel


Lara Flores María Cristina
Paredes Flores Leonardo Ulises
Perea Reséndiz Francisco Javier

Grupo: 2401
OBJETIVOS
 DESAROLLAR Y ANALIZAR UNA CURVA ESTÁNDAR.
 DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN DE ALBÚMINA EN LA CLARA DE HUEVO
POR EL MÉTODO DE LOWRY.

INTRODUCCIÓN

Cuantificación de proteínas:
Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de
rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta,
cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el
diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos.
Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos
se basan en:
a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV,
b) para la formación de derivados químicos, o
c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes
Transmitancia:
La transmitancia óptica se refiere a la cantidad de luz que atraviesa un cuerpo, en una
determinada longitud de onda. Cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslúcido,
una parte de esa luz es absorbida por el mismo, y otra fracción de ese haz de luz
atraversará el cuerpo, según su transmitancia. El valor de la transmitancia óptica de un
objeto se puede determinar según la siguiente expresión:

I es la cantidad de luz transmitida por la muestra e I0 es la cantidad total de luz incidente.

Muchas veces encontraremos la transmitancia expresada en porcentaje, según la fórmula:

Absorbancia:
Cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslúcido, una parte de esta luz es
absorbida por el cuerpo, y el haz de luz restante atraviesa dicho cuerpo. A mayor cantidad
de luz absorbida, mayor será la absorbancia del cuerpo, y menor cantidad de luz será
transmitida por dicho cuerpo. Como se ve, la absorbancia y la transmitancia son dos
aspectos del mismo fenómeno. La absorbancia, a una determinada longitud de onda
lambda, se define como:
Donde I es la intensidad de la luz que pasa por la muestra (luz transmitida) y I 0 es la
intensidad de la luz incidente.

La medida de la absorbancia de una solución es usada con mucha frecuencia en


laboratorio clínico, para determinar la concentración de analitos tales como colesterol,
glucosa, creatinina y triglicéridos en sangre. Cada uno de estos analitos se hace
reaccionar químicamente con determinados compuestos, a fin de obtener una solución
coloreada. A mayor intensidad de color, mayor será la absorbancia de la solución en una
determinada longitud de onda. La absorbancia es entonces directamente proporcional a la
concentración del analito.

Para medir esta absorbancia, se hace incidir un haz de luz con determinada intensidad y
longitud de onda, sobre la solución, y se mide la luz transmitida al otro lado de la cubeta
que contiene dicha solución. Estas técnicas están comprendidas en el área de la
espectrofotometría.

Ley de Lamber-Beer:
Relaciona la absorción de luz con las propiedades del material atravesado.
La ley explica que hay una relación exponencial entre la transmisión de luz a través de
una sustancia y la concentración de la sustancia, así como también entre la transmisión y
la longitud del cuerpo que la luz atraviesa.
Si conocemos l y A, la concentración de la sustancia puede ser deducida a partir de la
cantidad de luz transmitida.
A = ε·c·l
Donde:
A = absorbencia
 = Coeficiente de extinción molar.
l = longitud de la celda.

Métodos para cuantificación de proteínas:


Intervalo del UV
Todas las proteínas pueden ser detectadas, sin embargo, solo ciertos residuos de
aminoácidos son los que se leen en la región del UV.
Por reacciones colorimétricas:
Enlaces peptídicos o ciertos aminoácidos reaccionan y los productos coloridos son
los que se cuantifican
Biuret:
Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el
Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio
básico.
1Cu2+ se acompleja con 4 NH.
La intensidad de coloración es directamente proporcional a
la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es
bastante específica, de manera que pocas sustancias
interfieren.

Reaccion de Biuret:
La reacción debe su nombre al biuret, una molécula formada
a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la más
sencilla que da positiva esta reacción, común a todos los compuestos que tengan dos o
más enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas.

La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción del


Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (gracias a la
presencia de NaOH o KOH).
La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la
formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones
no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos.

Lowry:
Este procedimiento involucra la formación de un compejo cobre - proteína en solución
alcalina.
Este complejo reduce al reactivo fosfomolibdico- fosfotungstato lo que produce una
intensa coloración azul.
Este método consta de dos etapas:
 Primera reacción Biuret. Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las
proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces
peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además,
provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína,
exponiéndose los residuos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de
la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con
tartrato.
 Segunda reacción reactivo de Folin- Ciocalteau. La reducción, también en
medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau por los grupos fenólicos de los
residuos de tirosina presente en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre
como catalizador.
El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido
fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos
fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso.
Este método se basa en la reacción de
Biuret, donde los enlaces peptídicos
reaccionan con el Cu2+ en condiciones
alcalinas produciendo Cu+, después se
reduce el reactivo de Folin por las proteínas
tratadas con cobre a azul
heteropolimolibdeno. El color se desarrolla
en la segunda reacción (con el
fosfomolibdotungstato) y es primeramente
debida a los aminoácidos tirosina,
triptófano, y en menor grado por cisteína, cistina e histidina.

RESUMEN
En la presente practica se llevó a cabo la cuantificación de proteínas de la clara de huevo
mediante el uso del espectrofotómetro el cual mide la absorbancia de la sustancia
problema y de esta forma se pudo cuantificar la concentración presente en esta, dado que
cada sustancia contiene un número determinado de absorbancia, con el manejo de
diluciones, recurriendo al método colorimétrico de Lowry el cual está basado en el
formación de complejos coloreados, proporcional a la concentración de proteínas.

MÉTODO.

En primer instancia se tomaron 7 tubos de ensaye, donde en el TUBO 0 se contuvo el


blanco (método de calibración del espectrofotómetro 0% Absorbancia y 100% de
Transmitancia) se agregaron los reactivo junto con el disolvente (H2O).
TUBO 1 se agregó 0.3 ml de la muestra medida mediante el uso de una micro pipeta, más
1.7 m de H2O destilada, más 1.0 de reactivo 3 y 0.1 ml de reactivo 4
TUBO 2 en este se adiciono 0.5 ml de la muestra, más 1.5 ml de H2O destilada, más 1.0
ml de reactivo 3 y 0.1 ml de reactivo 4.
TUBO 3 se agregó 0.7 ml de la muestra, más 1.3 de H2O destilada, más 1.0 ml de
reactivo 3 y 0.1 de reactivo 4
TUBO 4 en este tubo se adiciono el estándar para la muestra y la cual se utilizó para la
curva, la proporciones fueron 0.1 ml de solución patrón, más 1.9 ml de H2O destilada, más
1 ml de reactivo 3 y 0.1 m de reactivo 4
TUBO 5 de igual forma se tomaron los valores para la curva estándar, se adicionaron 0.2
ml de la solución patrón, más 1.8 ml de H2O, más 1.0 ml de reactivo 3 y 0.1 ml de reactivo
4.
TUBO 6 se adiciono 0.4 ml de solución patrón, más 1.6 ml de H2O, más 1.0 de reactivo 3
y 0.1 ml de reactivo 4
TUBO 7 se agregó 0.8 ml d solución patrón, más 1.2 ml de H2O, más 1.0 ml de reactivo 3
y 0.1 ml de reactivo 4
NOTA: Después de agrega el reactivo 3 se agito vigorosamente y se dejó reposar durante
10 min
Después de agregar el reactivo 4 se agito vigorosamente y se dejó reposar
alrededor de 20 min
Posterior a realizar las reacciones señaladas se procedió a medir el nivel de absorbancia
de cada solución, principiando con el blanco para poder obtener el valor de 0 de
absorbancia, en seguida con los valores de la curva estándar y posterior por la solución
problema

RESULTADOS

TUBO BLANCO 1 2 3 4 5 6 7
Solución - 0.3 0.5 0.7 - - - -
problemas
de proteínas
(mL)
Solución - - - - 0.1 0.2 0.4 0.8
patón de
proteínas
(mL)

H2O 2.0 1.7 1.5 1.3 1.9 1.8 1.6 1.2


destilada
Reactivo 3 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Reactivo 4 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Absorbancia - 0.104 0.156 0.233 0.68 0.085 0.155 0.255
a 640nm

Cálculos
Dilución de la clara de huevo.
11g – 100mL 11000mg – 100mL
Si 11000mg 100mL
X 1mL X=110mg de albumina
Si 110mg 1000mL
X 1mL X= 0.11mg de albumina Cantidad a usar

Calculo de la curva estándar


Si la ecuación de la recta es Y=mx + b, despejamos a X, por lo tanto la ecuación
quedaría como X= y/m + b donde:
Y= absorbancia
X= concentración
M= pendiente
b = ordenada al origen (en este caso es 0)
Si la solución patrón es
Tubo 1 - 5mg de albumina – 50mL de NaOH
X – 0.1 mL de NaOH X= 0.01
Tubo 2 - 5mg de albumina – 50mL de NaOH
X – 0.2 mL de NaOH X= 0.02
Tubo 3 -5mg de albumina – 50mL de NaOH
X – 0.4 mL de NaOH X= 0.04
Tubo 4 - 5mg de albumina – 50mL de NaOH
X – 0.8 mL de NaOH X= 0.08

Tabla 1 de [mg] vs Absorbancia


Y (absorbancia) X (concentración)

0 0
0.051 0.01
0.095 0.02
0.149 0.04
0.226 0.08
Tabla 2 de [mg] vs ml de solución problema (Extrapolado)
Solución problema X (concentración)
(ml)

0.3 0.0387mg
0.5 0.0439mg
0.7 0.0476mg

Por medio de la ecuación y=2.705x + 0.0231 hallamos la concentración en mg de los


tubos 1, 2 y 3 de la siguiente manera:

Cálculos de la cantidad de albumina en solución problema


 Tubo 1
X= (0.128 – 0.0231)/2.705 = 0.0387mg

0.3 ml  0.0387mg
100ml  x = 12.9mg/100ml (diluido)  12.9g/100ml (concentrado)

 Tubo 2
X= (0.142 – 0.0231)/2.705 = 0.0439mg

0.5ml  0.0439mg
100ml  x = 8.78mg/100ml (diluido)  8.78g/100ml (concentrado)

 Tubo 3
X= (0.152 – 0.0231)/2.705 = 0.0476mg

0.7ml  0.0476mg
100ml  x = 6.8mg/100ml (diluido)  6.8g/100ml (concentrado)

Tubo g de Promedio Desviación Coeficiente


albúmina en estándar de variación
100 mL de
clara
1 12.9
2 8.7 9.4666 3.1214 32.97
3 6.8
ANALÍSIS DE RESULTADOS

La curva estándar muestra los resultados obtenidos de cada tubo donde se


depositó la muestra patrón, teniendo como resultdo en el eje de las “y” la
absorbancia, que es el resultado de cada muestra observada en el
espectrofotómetro. En el eje de las “x” se observa la concentración obtenida de
albúmina en la clara de huevo de la solución patrón.
En la línea de referencia los puntos se muestran un poco alejados, esto se debe a
que hubo un error mínimo en la práctica.
En promedio, se obtuvieron 9.4666 g de albúmina en 100 mL de huevo. Se puede
decir que los resultados son confiables, ya que existe 32.97% de variación en los
tubos que contenían la solución problema, a pesar de que la teoría indica 11 g por
cada 100 mL.

CONCLUSIONES

Podemos afirmar que la sensibilidad del método es importante cuando la cantidad


total de la muestra es limitada o cuando la concentración de proteínas es muy
baja.
En base a los resultados obtenidos, sí se cumplieron los objetivos planteados en
un principio, ya que se desarrolló y analizó una curva estándar, así como también
se determinó la concentración de albúmina por el método de Lowry. Es importante
considerar que puede variar la concentración teórica de la experimental en las
soluciones empleadas, así como también los errores cometidos al momento de
realizar la práctica, lo cual justifica la diferencia de gramos en la parte teórica con
los gramos cuantificados en esta práctica.

REFERENCIAS

 Ayres G.Análisis químico cuantitativo.México:HARLA;pp.459-465.


 Olsen E. Mérodos ópticos de análisis.Barcelona: Reverté;1990.pp.112
 Castaño F. Espectroscopía UV y visible. España: Alhambra; 1970. Pp 145-
153.

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