AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES “ZARAGOZA”
Laboratorio de Bioquímica Celular y Tejidos I
CURVA ESTANDAR DE PROTEÍNA
Concentración de albúmina en la clara de huevo
Profesora: Leonor Aguilar
Equipo: 3
Integrantes:
Flores Ramírez Samuel
Lara Flores María Cristina Paredes Flores Leonardo Ulises Perea Reséndiz Francisco Javier
Grupo: 2401 OBJETIVOS DESAROLLAR Y ANALIZAR UNA CURVA ESTÁNDAR. DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN DE ALBÚMINA EN LA CLARA DE HUEVO POR EL MÉTODO DE LOWRY.
INTRODUCCIÓN
Cuantificación de proteínas: Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos. Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes Transmitancia: La transmitancia óptica se refiere a la cantidad de luz que atraviesa un cuerpo, en una determinada longitud de onda. Cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslúcido, una parte de esa luz es absorbida por el mismo, y otra fracción de ese haz de luz atraversará el cuerpo, según su transmitancia. El valor de la transmitancia óptica de un objeto se puede determinar según la siguiente expresión:
I es la cantidad de luz transmitida por la muestra e I0 es la cantidad total de luz incidente.
Muchas veces encontraremos la transmitancia expresada en porcentaje, según la fórmula:
Absorbancia: Cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslúcido, una parte de esta luz es absorbida por el cuerpo, y el haz de luz restante atraviesa dicho cuerpo. A mayor cantidad de luz absorbida, mayor será la absorbancia del cuerpo, y menor cantidad de luz será transmitida por dicho cuerpo. Como se ve, la absorbancia y la transmitancia son dos aspectos del mismo fenómeno. La absorbancia, a una determinada longitud de onda lambda, se define como: Donde I es la intensidad de la luz que pasa por la muestra (luz transmitida) y I 0 es la intensidad de la luz incidente.
La medida de la absorbancia de una solución es usada con mucha frecuencia en
laboratorio clínico, para determinar la concentración de analitos tales como colesterol, glucosa, creatinina y triglicéridos en sangre. Cada uno de estos analitos se hace reaccionar químicamente con determinados compuestos, a fin de obtener una solución coloreada. A mayor intensidad de color, mayor será la absorbancia de la solución en una determinada longitud de onda. La absorbancia es entonces directamente proporcional a la concentración del analito.
Para medir esta absorbancia, se hace incidir un haz de luz con determinada intensidad y longitud de onda, sobre la solución, y se mide la luz transmitida al otro lado de la cubeta que contiene dicha solución. Estas técnicas están comprendidas en el área de la espectrofotometría.
Ley de Lamber-Beer: Relaciona la absorción de luz con las propiedades del material atravesado. La ley explica que hay una relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una sustancia y la concentración de la sustancia, así como también entre la transmisión y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. Si conocemos l y A, la concentración de la sustancia puede ser deducida a partir de la cantidad de luz transmitida. A = ε·c·l Donde: A = absorbencia = Coeficiente de extinción molar. l = longitud de la celda.
Métodos para cuantificación de proteínas:
Intervalo del UV Todas las proteínas pueden ser detectadas, sin embargo, solo ciertos residuos de aminoácidos son los que se leen en la región del UV. Por reacciones colorimétricas: Enlaces peptídicos o ciertos aminoácidos reaccionan y los productos coloridos son los que se cuantifican Biuret: Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren.
Reaccion de Biuret: La reacción debe su nombre al biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la más sencilla que da positiva esta reacción, común a todos los compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas.
La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción del
Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos.
Lowry: Este procedimiento involucra la formación de un compejo cobre - proteína en solución alcalina. Este complejo reduce al reactivo fosfomolibdico- fosfotungstato lo que produce una intensa coloración azul. Este método consta de dos etapas: Primera reacción Biuret. Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato. Segunda reacción reactivo de Folin- Ciocalteau. La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina presente en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso. Este método se basa en la reacción de Biuret, donde los enlaces peptídicos reaccionan con el Cu2+ en condiciones alcalinas produciendo Cu+, después se reduce el reactivo de Folin por las proteínas tratadas con cobre a azul heteropolimolibdeno. El color se desarrolla en la segunda reacción (con el fosfomolibdotungstato) y es primeramente debida a los aminoácidos tirosina, triptófano, y en menor grado por cisteína, cistina e histidina.
RESUMEN En la presente practica se llevó a cabo la cuantificación de proteínas de la clara de huevo mediante el uso del espectrofotómetro el cual mide la absorbancia de la sustancia problema y de esta forma se pudo cuantificar la concentración presente en esta, dado que cada sustancia contiene un número determinado de absorbancia, con el manejo de diluciones, recurriendo al método colorimétrico de Lowry el cual está basado en el formación de complejos coloreados, proporcional a la concentración de proteínas.
MÉTODO.
En primer instancia se tomaron 7 tubos de ensaye, donde en el TUBO 0 se contuvo el
blanco (método de calibración del espectrofotómetro 0% Absorbancia y 100% de Transmitancia) se agregaron los reactivo junto con el disolvente (H2O). TUBO 1 se agregó 0.3 ml de la muestra medida mediante el uso de una micro pipeta, más 1.7 m de H2O destilada, más 1.0 de reactivo 3 y 0.1 ml de reactivo 4 TUBO 2 en este se adiciono 0.5 ml de la muestra, más 1.5 ml de H2O destilada, más 1.0 ml de reactivo 3 y 0.1 ml de reactivo 4. TUBO 3 se agregó 0.7 ml de la muestra, más 1.3 de H2O destilada, más 1.0 ml de reactivo 3 y 0.1 de reactivo 4 TUBO 4 en este tubo se adiciono el estándar para la muestra y la cual se utilizó para la curva, la proporciones fueron 0.1 ml de solución patrón, más 1.9 ml de H2O destilada, más 1 ml de reactivo 3 y 0.1 m de reactivo 4 TUBO 5 de igual forma se tomaron los valores para la curva estándar, se adicionaron 0.2 ml de la solución patrón, más 1.8 ml de H2O, más 1.0 ml de reactivo 3 y 0.1 ml de reactivo 4. TUBO 6 se adiciono 0.4 ml de solución patrón, más 1.6 ml de H2O, más 1.0 de reactivo 3 y 0.1 ml de reactivo 4 TUBO 7 se agregó 0.8 ml d solución patrón, más 1.2 ml de H2O, más 1.0 ml de reactivo 3 y 0.1 ml de reactivo 4 NOTA: Después de agrega el reactivo 3 se agito vigorosamente y se dejó reposar durante 10 min Después de agregar el reactivo 4 se agito vigorosamente y se dejó reposar alrededor de 20 min Posterior a realizar las reacciones señaladas se procedió a medir el nivel de absorbancia de cada solución, principiando con el blanco para poder obtener el valor de 0 de absorbancia, en seguida con los valores de la curva estándar y posterior por la solución problema
Cálculos Dilución de la clara de huevo. 11g – 100mL 11000mg – 100mL Si 11000mg 100mL X 1mL X=110mg de albumina Si 110mg 1000mL X 1mL X= 0.11mg de albumina Cantidad a usar
Calculo de la curva estándar
Si la ecuación de la recta es Y=mx + b, despejamos a X, por lo tanto la ecuación quedaría como X= y/m + b donde: Y= absorbancia X= concentración M= pendiente b = ordenada al origen (en este caso es 0) Si la solución patrón es Tubo 1 - 5mg de albumina – 50mL de NaOH X – 0.1 mL de NaOH X= 0.01 Tubo 2 - 5mg de albumina – 50mL de NaOH X – 0.2 mL de NaOH X= 0.02 Tubo 3 -5mg de albumina – 50mL de NaOH X – 0.4 mL de NaOH X= 0.04 Tubo 4 - 5mg de albumina – 50mL de NaOH X – 0.8 mL de NaOH X= 0.08
Tabla 1 de [mg] vs Absorbancia
Y (absorbancia) X (concentración)
0 0 0.051 0.01 0.095 0.02 0.149 0.04 0.226 0.08 Tabla 2 de [mg] vs ml de solución problema (Extrapolado) Solución problema X (concentración) (ml)
0.3 0.0387mg 0.5 0.0439mg 0.7 0.0476mg
Por medio de la ecuación y=2.705x + 0.0231 hallamos la concentración en mg de los
tubos 1, 2 y 3 de la siguiente manera:
Cálculos de la cantidad de albumina en solución problema
Tubo 1 X= (0.128 – 0.0231)/2.705 = 0.0387mg
0.3 ml 0.0387mg 100ml x = 12.9mg/100ml (diluido) 12.9g/100ml (concentrado)
albúmina en estándar de variación 100 mL de clara 1 12.9 2 8.7 9.4666 3.1214 32.97 3 6.8 ANALÍSIS DE RESULTADOS
La curva estándar muestra los resultados obtenidos de cada tubo donde se
depositó la muestra patrón, teniendo como resultdo en el eje de las “y” la absorbancia, que es el resultado de cada muestra observada en el espectrofotómetro. En el eje de las “x” se observa la concentración obtenida de albúmina en la clara de huevo de la solución patrón. En la línea de referencia los puntos se muestran un poco alejados, esto se debe a que hubo un error mínimo en la práctica. En promedio, se obtuvieron 9.4666 g de albúmina en 100 mL de huevo. Se puede decir que los resultados son confiables, ya que existe 32.97% de variación en los tubos que contenían la solución problema, a pesar de que la teoría indica 11 g por cada 100 mL.
CONCLUSIONES
Podemos afirmar que la sensibilidad del método es importante cuando la cantidad
total de la muestra es limitada o cuando la concentración de proteínas es muy baja. En base a los resultados obtenidos, sí se cumplieron los objetivos planteados en un principio, ya que se desarrolló y analizó una curva estándar, así como también se determinó la concentración de albúmina por el método de Lowry. Es importante considerar que puede variar la concentración teórica de la experimental en las soluciones empleadas, así como también los errores cometidos al momento de realizar la práctica, lo cual justifica la diferencia de gramos en la parte teórica con los gramos cuantificados en esta práctica.
![Ata 31 Sabreliner-80 [Practica Navegacion Aerea ]](https://imgv2-1-f.scribdassets.com/img/document/246305804/149x198/24853652a1/1439464806?v=1)
