Operaciones Básicas de Laboratorio Curso 2023-24

Práctica 7. Reconocimiento de Biomoléculas: Proteínas y

centrifugación.

Fundamento Teórico

Práctica 7.1. Reconocimiento de Biomoléculas: Proteínas

Proteínas

Las proteínas son biomoléculas que, a diferencia de lípidos y glúcidos, siempre presentan en su
composición química los cuatro elementos mayoritarios de la materia viva: carbono, oxígeno, hidrógeno
y nitrógeno, habitualmente acompañados de otros elementos como azufre, fósforo, hierro, etc.

Estos elementos se hallan agrupados en las unidades estructurales de las proteínas: los aminoácidos.
En general las proteínas se hallan constituidas por un número muy elevado de aminoácidos, por lo que
son macromoléculas con un peso molecular muy elevado; mayoritariamente entre 6 y 1000 KDa (kilo
Daltons).

Aminoácidos y péptidos

Los aminoácidos, unidades elementales de las proteínas, son moléculas orgánicas en las que un
carbono se halla unido a un grupo amino y un grupo carboxilo, lo que determina que en general se trate
de un carbono asimétrico. La particularidad de disponer de las dos funciones indicadas en su molécula
determina que los aminoácidos sean sustancias anfóteras; es decir que pueden actuar como ácido o
como base en función de las condiciones.
La existencia de un carbono asimétrico en su molécula determina que todo aminoácido presente dos
enantiómeros: las forma D y L. Si bien las dos existen desde el punto de vista químico, los seres vivos
elaboran sus proteínas con aminoácidos de la forma L, salvo algunos casos excepcionales entre
bacterias.

Las cadenas de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos se denominan genéricamente péptidos
y se tiende a separarlos en oligopéptidos, cuando el número de aminoácidos enlazados es
relativamente reducido y si las cadenas peptídicas están formadas por muchas unidades de aminoácidos
hablamos de polipéptidos o proteínas.

Análisis cuantitativo de proteínas - Reacción de Biuret

▪ Existen diferentes protocolos para llevar a cabo la Reacción de Biuret.

▪ Siempre se requiere la adición progresiva de Cu++ en medio alcalinos para que se produzca la
reacción con la proteína.
▪ Al utilizar el reactivo preparado como se indica en los fundamentos teóricos de la práctica, los
mejores resultados se obtienen añadiendo a un volumen de la muestra un volumen de reactivo
en una proporción 1:10.
▪ Los volúmenes a utilizar se verán condicionados por la disponibilidad de muestra y el volumen
requerido por las cubetas a utilizar en el espectrofotómetro.

El ensayo de Biuret es un método colorimétrico que permite determinar la concentración de proteínas de

una muestra mediante espectroscopía ultravioleta-visible a una longitud de onda de 545 nm (para
detectar el ión Cu2+).
1
 Operaciones Básicas de Laboratorio Curso 2023-24

Preparación del Reactivo de Biuret:

▪ Se disuelven 3,8 g de CuSO4·5H2O y 6,7 g NaEDTA en 700 ml de H2O

▪ Mientras se agita se añaden 200 ml de NaOH 5N y luego 1 g de KI como estabilizante.
▪ El reactivo se guarda en un frasco de plástico.

El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (por a la presencia de NaOH). El
reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con
polipéptidos de cadena corta. El hidróxido de sodio no participa en la reacción, pero proporciona el medio
alcalino necesario para que tenga lugar.

La reacción debe su nombre al biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (H 2N-CO-NH-CO-
NH2), que es la más sencilla que da positiva esta reacción, común a todos los compuestos que tengan
dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas.

La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un

complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que
forma parte de los enlaces peptídicos: 1 Cu2+ se acompleja con 4 grupos NH.

2
 Operaciones Básicas de Laboratorio Curso 2023-24

La reacción de Biuret es cuantificable, es decir, la intensidad de coloración violeta es directamente

proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de
manera que pocas sustancias interfieren. Estas reacciones, en las que el color formado es proporcional a
la cantidad de sustancia se llaman reacciones colorimétricas.

Midiendo la intensidad de color se podría conocer la concentración de la sustancia que lo produce. Para
ello se aplican técnicas fotométricas, empleando un aparato llamado colorímetro (si mide sólo un
determinado color) o espectrofotómetro (si realiza una medida de todo el espectro de colores).

Espectrofotometría - Principios básicos

La luz visible es la parte de la radiación electromagnética, que se propaga de forma ondulatoria, que es
percibida por el ojo humano. Las distintas radiaciones luminosas (los distintos colores) se diferencian
unas de otras por sus longitudes de onda (λ) (distancia entre la cresta de una onda y la siguiente), que
se mide en nm.

3
 Operaciones Básicas de Laboratorio Curso 2023-24

La luz visible engloba las radiaciones comprendidas entre 380-750 nm, que corresponden a los colores
del arco-iris, de tal forma que cada color corresponde a una radiación con una λ específica.

El espectrofotómetro dispone de una lámpara que emite luz monocromática, de una longitud de onda
determinada, que incide y atraviesa la muestra coloreada a medir, y de un detector, que medirá la
cantidad de luz que no es absorbida por la muestra.

4
 Operaciones Básicas de Laboratorio Curso 2023-24

Su funcionamiento se basa en la Ley de Beer-Lambert: la fracción de luz incidente que es absorbida por
una solución es proporcional a la concentración de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por
la luz. La relación entre la luz incidente (I0) y la transmitida (I1) dará una idea de la cantidad de radiación
que ha sido absorbida por la muestra. Es lo que se denomina Absorbancia (Abs) o Densidad Óptica
(DO).

La Ley de Beer-Lambert se formula como:

Abs (DO) = ε·c·l

ε el coeficiente de extinción molar (específico para cada sustancia a una l y en unas

condiciones determinadas) (M-1 cm-1)
c la concentración de la muestra a medir
l el espesor de la muestra. La mayoría de los espectrofotómetros utilizan cubetas para la
muestra de 1 cm de espesor, por lo que l normalmente se puede ignorar.

Así, la concentración desconocida de la sustancia coloreada será: c= Abs / ε

Para cada sustancia determinada, se utilizará la radiación de longitud de onda a la que absorba más
cantidad de luz. En la figura, a modo de ejemplo, se pueden ver las diferentes longitudes de onda para
los picos de máxima absorción correspondientes a las moléculas de diferentes pigmentos fotosintéticos.

La mayoría de las biomoléculas y moléculas inorgánicas a cuantificar no poseen color. Por lo tanto es
necesario acoplar algún tipo de reacción química que involucre la aparición o desaparición de un
5
 Operaciones Básicas de Laboratorio Curso 2023-24

cromógeno con la sustancia a cuantificar. Generalmente se escogen cromógenos cuyo coeficiente de

absorbancia molar sea alto ya que mayor será la absorbancia a medir y por tanto la técnica tendrá mayor
sensibilidad. El siguiente paso es corroborar bajo qué condiciones se cumple la ley de Beer, es decir
cuál es la longitud de onda apropiada para realizar las mediciones y qué concentraciones son las
adecuadas. Para ello se determina la absorbancia de la sustancia en cuestión a diferentes
concentraciones. Las soluciones de concentración conocida que se preparan para este propósito se
conocen como patrones o estándares. La relación absorbancia versus concentración debe generar un
gráfico que demuestre una línea recta cuyo intercepto en el eje de las abscisas y las ordenadas es cero.
Una vez que se ha realizado este paso se puede entonces determinar la concentración de una solución
midiendo su absorbancia y extrapolando dicho valor en el gráfico.

La Ley de Beer-Lambert es una relación matemática ideal que contiene ciertas limitaciones.
Desviaciones de la misma, es decir circunstancias en las cuales la relación entre la absorbancia y la
concentración de una muestra no es lineal pueden ocurrir cuando:

1. La concentración de la solución a medir es muy elevada.

La mejor forma de evitar esta situación es diluyendo la muestra a cuantificar.

2. La luz incidente no es monocromática.

En este caso es necesario tener una buena fuente de energía radiante. La mayoría de los instrumentos de
buena calidad la poseen hoy en día.

3. La cantidad de luz absorbida por el solvente es significativa con respecto a la sustancia en

solución que se desea medir.

Para esta situación es necesario corroborar que la cantidad de luz absorbida por el solvente no es
significativa. Para ello, se debe utilizar cada vez que se hace una determinación espectrofotométrica el
reactivo blanco. El blanco es una muestra más que contiene todos los componentes utilizados para la
determinación (por ejemplo agua, reactivo, etc.) excepto el compuesto a medir. La cantidad de luz transmitida
por este blanco no debe ser detectada por el aparato. Para ello, el espectrofotómetro se ajusta manualmente

6
 Operaciones Básicas de Laboratorio Curso 2022-23

de forma tal que esta cantidad de luz no sea medida. Este procedimiento se conoce comúnmente como
“calibración del cero”, es decir, la cantidad de absorbancia del blanco es reconocida o cuantificada como cero
por el aparato.

4. Hay luz transmitida que no es generada a partir de la sustancia a cuantificar.

En este caso es necesario que no existan otras fuentes de luz cercanas cuando se hace la medición.

5. Los lados de la celda donde se deposita la muestra no son paralelos.

Para evitar esta situación se deben utilizar celdas certificadas, las cuales son hoy en día fáciles de conseguir
a un precio razonable.

6. Mezcla de varias especies químicas que absorben luz de la misma longitud de onda: las especies
“competirán” entre sí por la luz, cada una con diferente absorbancia.

Para evitar este aspecto, es necesario asegurarse de que el compuesto a medir se encuentre en solución de
forma pura o en presencia de otros compuestos que no absorben a la misma longitud de onda. Es también
imprescindible recordar que si se hacen mediciones en el rango de luz ultravioleta es necesario utilizar celdas
de cuarzo, ya que el vidrio absorbe luz a esas longitudes de onda.

1
 Operaciones Básicas de Laboratorio Curso 2022-23

Práctica 7.2. Centrifugación

Dispersiones

Existen múltiples posibilidades de que dos componentes diferentes puedan estar mezclados. Si como
mínimo uno de estos componentes es un líquido que abunda en cantidad (= medio de dispersión o
solvente), se puede distinguir entre:

1) Solución una sustancia sólida, líquida o gaseosa está dispersa de forma iónica o
molecular (≤ 1 nm) en un líquido

2) Dispersión coloidal partículas sólidas muy pequeñas (≤ 1 µm) están dispersas en un líquido

3) Suspensión partículas sólidas (> 1 µm) están dispersas en un líquido

4) Emulsión un líquido está disperso en forma de pequeñas gotas en otro líquido con
el que no es miscible

5) Gel una sustancia sólida forma una red tridimensional cuyo espacio está
lleno de líquido

Técnicas de separación

Para la separación de las distintas dispersiones se utilizan técnicas diferentes técnicas como, por
ejemplo, la destilación en el caso de las soluciones. La parte sólida de las suspensiones muchas veces
se puede separar simplemente por decantación, si el sólido se deposita fácilmente en el fondo del
recipiente (sedimentación - densidad superior a la del líquido), o si permanece en la superficie del líquido
(flotación - densidad inferior a la del líquido). Otro método para separar suspensiones es la filtración
con un papel cuyos poros tienen un tamaño que deja pasar el líquido, pero no las partículas sólidas.
Ambas técnicas utilizan la gravedad natural de la tierra para llevar a cabo la separación.

Si las partículas son pequeñas, los procesos de sedimentación o flotación pueden ser extremadamente
lentos debido a la resistencia al avance de las partículas provocada por la fricción que se establece
entre éstas y las del líquido. Un método muy común para aumentar la velocidad de este proceso es la
centrifugación.

La fuerza centrífuga puede acelerar este proceso, si las partículas ya tienen tendencia a hacerlo
espontáneamente. Sin embargo, la centrifugación no puede separar partículas que son demasiado

2
 Operaciones Básicas de Laboratorio Curso 2022-23

pequeñas, como son las moléculas de una solución o las nano-partículas de una dispersión coloidal
porque sus movimientos aleatorios inducidos por las turbulencias térmicas (movimiento Browniano)
revierten su separación. Lo mismo es cierto para las emulsiones, aunque en este caso una fuerza
centrífuga grande podría influir en la forma de la superficie de las gotas y de esta manera provocar la
unión entre ellos (coalescencia) lo que terminaría en la separación de los dos líquidos en dos fases.

La magnitud de la fuerza centrífuga es proporcional a la masa del cuerpo, al radio de giro y a la

velocidad de giro. Algunas centrífugas modernas permiten generar un millón de veces la fuerza de la
gravedad natural. En la imagen de la siguiente página se presenta la fórmula de la RFC (del inglés
Relative Centrifugal Force; no tiene unidad, pero normalmente se añade “x g” para indicar la relación
con la gravedad natural) y un nomograma que permite una estimación rápida.

Centrífugas

Las centrífugas tienen dos componentes esenciales: motor y rotor (donde se coloca la muestra a
centrifugar).

Tipos de rotores

Existen dos tipos de rotores:

▪ De ángulo fijo: Los tubos se alojan con un ángulo fijo respecto al eje de giro. Se usa para
volúmenes grandes.

▪ Basculante: Los tubos se hallan dentro de unas carcasas que cuelgan. Estas carcasas están
unidas al rotor con un eje y cuando la centrífuga gira, se mueven. Se usan para volúmenes
pequeños y para separar partículas con un mismo o casi igual coeficiente de sedimentación.

Tipos de centrifugación

Las partículas se pueden separar en función de:

▪ Velocidad de sedimentación

▪ Densidad

La centrifugación clásica o centrifugación diferencial se basa en la velocidad de la sedimentación y

se genera un sobrenadante y un material sedimentado.

La centrifugación zonal y la centrifugación isopícnica utilizan un gradiente de densidad para

separar múltiples componentes que están suspendidos juntos en un solvente. El gradiente se consigue
disolviendo un soluto preferiblemente de baja masa molecular, como por ejemplo, sacarosa o
polisacáridos sintéticos, de tal manera que la densidad aumenta desde la zona superior a la inferior. La

3
 Operaciones Básicas de Laboratorio Curso 2022-23
muestra con los componentes a separar se deposita en la parte superior del gradiente como una fina
banda y, tras centrifugar, los componentes se presentan como bandas o zonas a distinta altura según su
densidad.