Determinación de proteínas a través de métodos químicos 2013

El método de biuret es una técnica colorimétrica cuantificable, es decir a mayor

concentración de proteínas mayor será la intensidad del color, vale decir, el color
formado es proporcional a la cantidad de sustancia medida, en este caso de
proteínas. Y se basa en la ley de Lambert-Beer. De este modo midiendo la intensidad
del color a través de un espectrofotómetro es posible medir la absorbancia de la
muestra e indirectamente determinar la concentración de la sustancia que produce el
color.

A= -log T o bien DO= A= a x l x c

El biuret es un compuesto coloreado que se forma a partir de la condensación de 2

ureas a 180 °C, con la consiguiente eliminación de amoniaco. Esta molécula es la más
sencilla que da positiva a la reacción de Biuret ya que presenta dos enlaces peptídicos
consecutivos.

H2N-CO-H2N + H2N-CO-H2N H2N- CO-NH-CO-NH2 + NH3

De aqui proviene el nombre de la reaccion de biuret

Este compuesto en presencia de iones cúpricos y en solución alcalina produce color

violeta. Recordemos que el reactivo es de color azul, color que es determinado por la
presencia de cobre.

Uso del biuret: Para usos de laboratorio, análisis, investigación y química fina

Fundamento: La reacción de biuret es una reacción coloreada (violeta) debida a la

formación de un complejo de Cu en un medio alcalino en compuestos que poseen más
de un enlace peptidico, como las proteínas.

Al colocar la proteína en contacto con un medio alcalino se forma una sustancia

compleja denominada Biuret, que en contacto con una solución de sulfato de cobre da
una coloración violeta

La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la

formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de
electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos
presentando un máximo de absorción a 540 nm.

Nota: la longitud usada a 540 nm es necesaria para poder medir los iones de cobre.

Componentes:

La turbidez de la muestra es un interferente, recordemos que los métodos

colorimétricos miden la absorbancia de sustancias transparentes, por lo tanto la
turbidez en la muestra señalaría error en la medición. Esta turbidez puede ser
provocada por concentraciones elevadas de álcali, como por ejemplo en muestras de
suero que contengan lipómicos.??

La bilirrubina también interfiere en esta medición, siempre que la concentración de

esta en suero sea mayor a 29 mg/dL ya que produciría ictericia y turbidez de la
muestra.

Finalmente la hemólisis de la muestra también afecta en la medición ya que al

contaminarse la muestra con Hb aumenta la concentración de proteínas. (el color
causado en la reacción de Biuret por 1 mg de Hb, es equivalente al que producen 1.9
mg de proteína sérica). Dando un resultado erróneo (elevado) de proteínas.

Preguntas

 Ley de lambert- beer con respecto a la colorimetría

Relaciona la absorción de luz con las propiedades del material atravesado.

 La ley explica que hay una relación exponencial entre la transmisión de luz a través de
una sustancia y la concentración de la sustancia, así como también entre la
transmisión y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa.
 Si conocemos I y A, la concentración de la sustancia puede ser deducida a partir de la
cantidad de luz transmitida.

A = ε·c·l

Donde:

 A = absorbencia
 = Coeficiente de extinción molar.
 l = longitud de la celda.
La reacción de Biuret es cuantificable, es decir, a mayor concentración de proteínas,
mayor intensidad de color violeta. Esta reacciones, en las que el color formado es
proporcional a la cantidad de sustancia se llaman reacciones colorimétricas. Midiendo
la intensidad de color se podría conocer la concentración de la sustancia que lo
produce. Para ello se aplican técnicas fotométricas, empleando un aparato
llamado colorímetro (si mide sólo un determinado color) o espectrofotómetro (si
realiza una medida de todo el espectro de colores).
La luz es parte de la radiación electromagnética, que se propaga de forma ondulatoria.
Las distintas radiaciones luminosas (los distintos colores) se diferencian unas de otras
por sus longitudes de onda (l) (distancia entre la cresta de una onda y la siguiente), que
se mide en nm. La luz visible engloba las radiaciones comprendidas entre 380-750 nm,
que corresponden a los colores del arco-iris, de tal forma que cada color corresponde a
una radiación con una longitud de onda específica. El espectrofotómetro dispone de
una lámpara que emite luz monocromática, de una longitud de onda determinada, que
incide y atraviesa la muestra coloreada a medir, y de un detector, que medirá la
cantidad de luz que no es absorbida por la muestra. Para cada sustancia determinada,
se utilizará la radiación de longitud de onda a la que absorba más cantidad de luz.
Su funcionamiento de basa en la ley de Beer-Lambert: la fracción de luz incidente que
es absorbida por una solución es proporcional a la concentración de soluto y al espesor
de la sustancia atravesada por la luz. La relación entre la luz incidente (I 0) y la reflejada
(I) dará una idea de la cantidad de radiación que ha sido absorbida por la muestra. Es
lo que se denomina Absorbancia (Abs) o Densidad Óptica (DO)

La ley de Lambert-
Beer se formula
como:

Abs (DO) =  x C x l

Nota: El Biuret es una reacción típica de los enlaces peptídicos, en la cual los átomos de
cobre del reactivo se unen a varios grupos NH, lo que produce una coloración rosa-
violácea. Esta reacción no sirve para dipéptidos ni para aminoácidos.

Coeficiente de extinción: representa la capacidad que tiene una sustancia para poder absorber
la radiación electromagnética
  Biuret (pro análisis analítico de que tipo es )

Se utiliza para análisis

 Condiciones de la ley de lambert-beer (no se muy bien)

 Porque medimos a 540 nm

Medimos a 540 nm para detectar el ion de Cu2+

 Cantidad de tiempo que dura reacción biuret

El color de la reacción es estable durante 12 horas por lo que la absorbancia debe ser leída
dentro de ese lapso.

 Espectrofotometro utilizado

Metertech sp-8 30 plus

Fuente de luz: Lampara Halogena (12 volt)

Detector: Fotodiodo

 Porque el biuret necesita de un medio alcalino

Porque solamente en un medio alcalino los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con
los iones cúpricos, para dar un complejo de color violeta.

Anexo:

Blanco de reactivo: Evaluar el reactivo sin presencia de la muestra

Las proteínas se mantienen estables cuando se encuentran en un medio como el suero

fisiológico, en agua estas precipitan

La reacción entre proteínas y el biuret se realiza a 37 grados Celsius ya que esa es la

temperatura para que esta ocurra.

Tiempo de reacción: 10 minutos (usado por nosotras)

La escala utilizada va de 1 a 10 gr/dl esto sirve para que al calcular las concentraciones estos
estén dentro de los valores fisiológicos normales.

Nota: Rango de linealidad del método es de 0,1-1 gr/dl, pero nosotros utilizamos la escala que
anteriormente coloque, la diferencia es la muestra de 0,25 ml fue diluida 1/10 por lo tanto se
utilizo 0,025ml para sacar la concentración de los puntos.
La muestra por lo tanto para sacar el rango se encontraba dentro de los parámetros de
linealidad.

Rango normal de proteínas totales en suero: El rango normal es de 6.0 a 8.3 gr/dL (gramos
por decilitro).
Los únicos aminoácidos que no dan positiva la reacción son la tronina, la histidina y la
serina ya que en su estructura hace falta un mínimo de dos enlaces peptídicos para
que pueda ocurrir la reacción con el biuret.
El biuret se utiliza en muestras de suero sanguíneo y sangre, aunque no en la orina
porque la urea interfiere en la reacción (Pero a nivel industrial la condensación de dos
moléculas de urea a 180 ºC produce como un producto intermediario la formacion de
Biuret el cual es toxico para plantas.)

En contacto con la piel puede producir cierta irritación cutánea, y en contacto con los
ojos irritación ocular.
Y es toxico para plantas y medios acuáticos.

En condiciones normales no presenta peligros el biuret.

http://catedras.quimica.unlp.edu.ar/qo3/Apuntes/Biuret.pdf