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2d Determinacion de Proteinas
2d Determinacion de Proteinas
PROTENAS
CUANTIFICACIN DE PROTENAS
Determinar
CUANTIFICACIN DE PROTENAS
a)
b)
c)
A = cl
Donde:
A = absorbencia
= Coeficiente de extincin molar.
l = longitud de la celda.
COEFICIENTE DE EXTINCIN
MOLAR
PROTENAS Y LA ABSORCIN
EN LA REGIN UV
Las bandas de absorcin ms significativas se
encuentra en el ultravioleta cercano, en el
intervalo de longitud de onda entre 230 y 300
nm.
Concretamente absorben en este rango las
cadenas laterales de los aminocidos
aromticos, la histidina y la cistina.
La cistina presenta una banda centrada a 250
nm, n-->s* (max ~ 300 M-1.cm-1), pero apenas
se puede considerar, ya que es muy dbil y el
porcentaje relativo de puentes disulfuro es muy
pequeo en una protena.
PROTENAS
CALCULAR LA CONCENTRACIN DE
PROTENAS: MTODO UV
Se usar la ecuacin de Lambert y Beer.
El coeficiente de extincin molar de la Albumina
de Suero Bovino (BSA) que es 43 824 M-1 cm-1 o
bien usando el coeficiente dado en porcentaje que
es de 6.6 para una solucin de BSA al 1% (10
mg/mL)
La frmula para determinar la concentracin de
la muestra.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
DETERMINACIN DE PROTENAS POR EL
MTODO ABS 280 NM.
1.
2.
3.
4.
CALCULAR LA CONCENTRACIN DE
PROTENAS CON LA FRMULA Y
LLENAR LA TABLA
Tubo
Absorbancia
Concentracin (g/L)
F0
F1
F2
F3
F4
FPA
FPB
BLANCO
CURVA PATRN
BIURET
Se basa en la formacin de un complejo coloreado
entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces
peptdicos en medio bsico.
1Cu2+ se acompleja con 4 NH.
La intensidad de coloracin es directamente
proporcional a la cantidad de protenas (enlaces
peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de
manera que pocas sustancias interfieren.
La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se
recomienda para la cuantificacin de protenas en
preparados muy concentrados (por ejemplo en
suero).
REACCIN DE BIURET
La reaccin debe su
nombre al biuret, una
molcula formada a
partir de dos de urea
(H2N-CO-NH-CO-NH2),
que es la ms sencilla
que da positiva esta
reaccin, comn a todos
los compuestos que
tengan dos o ms
enlaces peptdicos
consecutivos en sus
molculas.
BIURET
La presencia de protenas en una mezcla se
puede determinar mediante la reaccin del
Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en
solucin acuosa alcalina (gracias a la presencia
de NaOH o KOH).
La reaccin se basa en la formacin de un
compuesto de color violeta, debido a la
formacin de un complejo de coordinacin entre
los iones Cu2+ y los pares de electrones no
compartidos del nitrgeno que forma parte de los
enlaces peptdicos.
LOWRY
ESTE PROCEDIMIENTO INVOLUCRA LA
FORMACIN DE UN COMPEJO COBRE PROTENA EN SOLUCIN ALCALINA.
ESTE COMPLEJO REDUCE AL REACTIVO
FOSFOMOLIBDICO- FOSFOTUNGSTATO LO
QUE PRODUCE UNA INTENSA COLORACIN
AZUL.
BIBLIOGRAFA
O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr y R.J. Randall. J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)
BRADFORD
Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue
BRADFORD
El ensayo de Bradford es un ensayo colorimtico
para la medicin de protena total en una
solucin dada.
Involucra la unin de un colorante el Coomassie
DIFERENTES
BCA
El cido bicinconnico, sal sdica, es un compuesto capaz de
Cu1+ + BCA