VIRUS DE EPSTEIN-BARR

CARACTERSTICAS GENERALES ESTRUCTURA INFECCIN Y RESPUESTA INMUNE FRENTE AL VEB ASPECTOS PATOGNICOS SINDROMES LINFOPROLIFERATIVOS HEPATITIS ROTURA ESPLNICA DIAGNSTICO SEROLGICO MTODOS DE DIAGNSTICO: HIBRIDACIN IN SITU SOUTHERN BLOT AMPLIFICACIN DNA PCR TCNICAS INMUNOHISTOQUMICAS

CARACTERSTICAS GENERALES El virus de Epstein-Barr (VEB) pertenece a la familia de los Herpesviridae (DNA), gammaherpesvirus del gnero Lymphocryptovirus, es potencialmente oncognico y est asociado a procesos epiteliolinfoproliferativos. La clnica principal est formada por la trada fiebre, odinofagia y adenopatas cervicales de caractersticas inflamatorias. La alteracin analtica ms frecuente es la linfomonocitosis perifrica (12000-18000/mm) con linfocitos atpicos en un 30 a un 90 % (se reconocen porque son mayores de lo normal y poseen caractersticas propias), anticuerpos heterfilos (alrededor del 90% de los adolescentes y adultos, y sobre todo tras la primera semana del comienzo de los sntomas) y elevacin moderada de transaminasas. Su distribucin es mundial y su prevalencia es elevada,de manera que la poblacin adulta presenta seropositividad en un 90-95% y el 70% de la misma se infecta antes de los 30 aos. Habitualmente, la primoinfeccin ocurre durante la infancia temprana de forma subclnica. Durante la adolescencia, entre un 35-50% de los casos, se manifiesta como mononucleosis infecciosa, siendo, generalmente individuos que no han tenido antes contacto con el virus. Los sntomas de esta enfermedad normalmente desaparecen en uno o dos meses.Sin embargo, el virus permanece latente en algunas clulas y sangre del individuo durante el resto de la vida, pudindose reactivar peridicamente sin que haya sntomas visibles de la enfermedad. De todos los casos en que se consigue conocer la etiologa, un 90% est producido por el VEB; el 10% restante podra tener su origen en las infecciones por Toxoplasma gondii, los adenovirus, el citomegalovirus (CMV) o el VIH. En las personas mayores de 25 aos, el agente etiolgico ms frecuente de mononucleosis infecciosa es el CMV.

ESTRUCTURA Como en otros herpesvirus, las partculas del VEB estn formadas por un core, una cpside, un tegumento o matriz y una envoltura rica en glucoprotenas. El genoma est constituido por DNA lineal bicatenario de 174 kb en las partculas virales, que codifica aproximadamente unas 100 protenas.El DNA vrico posee dos secciones, una larga (UL) y otra corta

(US),flanqueadas cada una de ellas por una regin terminal repetitiva denominada TR, y zonas de repeticin interna (IR) (figura 1), cada una de ellas con una longitud aproximada de 500 pb. La recombinacin entre estas repeticiones terminales origina la formacin de una molcula extracromosmica cerrada covalentemente o epitoma ( DNA circular o no integrado), que es la estructura que el virus adopta en el interior del ncleo de las clulas infectadas de forma latente (Figura 2). El nmero de repeticiones que queda en cada episoma tras la unin de los extremos se utiliza como marcador de clonalidad. Las regiones U3 y U5 de la seccin UL del genoma permiten al virus realizar su replicacin en la infeccin ltica. En cambio, el mantenimiento del episoma y de la replicacin en la infeccin latente se debe a la regin oriP de la zonadenominada U1 de US. Figura 1 Representacin esquemtica del genoma del VEB

Figura 2. Genoma del VEB: Episoma INFECCIN Y RESPUESTA INMUNE FRENTE AL VEB La infeccin se adquiere generalmente por transmisin oral (saliva), al colonizar las clulas del epitelio orofarngeo donde el virus establece su ciclo ltico de replicacin. El virus se une a las clulas a travs de la interaccin de la gp350/220 de su envoltura con el receptor celular CD21 de clulas epiteliales y linfocitos B. Con la produccin de nuevos viriones, se

induce lisis de la clula husped y se infectan las clulas contiguas. Durante esta fase el VEB infecta a los linfocitos B, proliferando en sangre perifrica y ndulos linfticos. Posteriormente, tras la infeccin primaria, el VEB es capaz de producir una infeccin latente, fundamentalmente en los linfocitos B, aunque las clulas basales del endotelio nasofarngeo y algunos linfocitos de tipoT tambin pueden albergar las formas latentes del virus, as como quizs tambin en el cuello del tero. De manera que el VEB nunca es erradicado completamente del organismo. Se han descrito reactivaciones acompaadas de replicacin y produccin de viriones que, sin embargo, no suelen acompaarse de manifestaciones clnicas. Durante los estadios iniciales de la primoinfeccin se induce una marcada respuesta inmunitaria frente a los antgenos de la cpside viral (VCA) que tiene capacidad neutralizante y que previene la viremia generalizada. En principio, este tipo de infeccin ltica o productiva se observa slo en la primoinfeccin y en los individuos inmunodeprimidos. Recientemente se est cuestionando este modelo en el que las clulas epiteliales de la orofaringe seran el foco primario y el reservorio de la infeccin por el VEB y en el que los linfocitos B se infectaran de forma secundaria. Trabajos recientes confirman la costante ausencia del VEB de la clulas epiteliales normales de los individuos inmunocompetentes y demuestran la existencia de infeccin latente y productiva exclusivamente en los linfocitos presentes en el epitelio bucal y nasofarngeo, por lo que parece posible que el VEB infecte directamente a los linfocitos B, y no de forma secundaria a la infeccin replicativa de las clulas epiteliales. En el ciclo ltico se produce replicacin, sntesis proteica y gnesis de nuevos viriones, mientras que en la fase de latencia se producen slo algunas protenas y no se desarrollan viriones. En ambos ciclos, ltico y latente, se sintetizan gran variedad de protenas cuyo conocimiento es bsico para comprender su papel en la patogenia del virus y su utilidad en las pruebas diagnsticas. Durante la fase latente se produce gran cantidad de RNA nuclear no codificante (EBER1 y 2 : EBERs en 10-10 copias por clula), seis antgenos nucleares (EBNA 1, 2, 3A, 3B, 3C y LP) y tres protenas de membrana (LMP1, 2A y 2B). En cambio, en las fases lticas se expresan unas 90 protenas, entre las que se sintetizan los antgenos precoces [early antigens (EA)], bien bajo el patrn de expresin celular difusa (EAd) o como restringidos (EAr), as como los antgenos tardos de la cpside del virus (VCA). Las diferencias entre los genes que codifican las protenas EBNA 2, 3A y 3C permiten distinguir los dos subtipos del virus, denominados VEB 1 y 2. que se diferencian en la mayor capacidad para transformar los linfocitos B in vitro del VEB tipo 1. La persistencia del VEB en los linfocitos B o tejidos infectados en la fase de latencia se ve favorecida por el limitado nmero de protenas que se sintetizan, reducindose las posibilidades de reconocimiento por parte de las clulas T citotxicas (CTL), eludiendo con esta estrategia la repuesta inmune frente al virus. Adems, el virus inhibe los mecanismos de apoptosis en los linfocitos infectados gracias a la protena vrica codificada por el gen BHFR1 y la accin de la LMP1. De esta manera, el VEB garantiza la supervivencia de las clulas infectadas y por ende la suya propia. Finalmente, las protenas codificadas por los genes BCRF1 y BARF1 inhiben la sntesis de alfa y gamma interferones, bloqueando el efecto inhibidor de stos sobre la replicacin de las clulas infectadas por el virus. Con la aparicin de la inmunidad especifica contra el virus, el nmero de clulas B infectadas por ste es regulado principalmente por los linfocitos T citotxicos y se mantiene en aproximadamente unos 100.000 linfocitos B. En algunos individuos, la inmunidad no es suficiente para regular este nmero de clulas infectadas, dando lugar a una infeccin crnica activa por el VEB. En una minora de pacientes, las clulas infectadas por este virus proliferan causando procesos linfoproliferativos y neoplasias epiteliales. Dependiendo de los genes expresados en la clula husped, se han descrito tres formas diferentes de latencia del VEB, que se observan en las distintas lneas celulares y en las diversas patologas asociadas al VEB (tabla1) El papel oncognico del VEB se comprueba en su capacidad de infectar, transformar e inmortalizar a los linfocitos B in vitro , generando de esta manera las lneas celulares linfoblastoides. Se ha podido comprobar que algunos de los productos de latencia participan en la trasformacin mediada por el virus, aunque no se conocen por completo qu mecanismos moleculares utilizan. La protena LMP1 interviene en la inhibicin de la apoptosis. LMP1 y EBNA2 son adems capaces de estimular de forma indirecta la proliferacin celular (tabla 2). Tabla 1. Formas de latencia del VEB. EBNA-2, LMP-1 LMP-2A/B EBERS -3(A-C),-LP + ? + + +

EBNA-1 Latencia I LB Latencia II EH, CNF + +

BHRF1 ? ?

Latencia III TLP-PT TLP-VIH LCLs

CNF: carcinoma nasofarngeo; EH: enfermedad de Hodgkin; LB: linfoma Burkitt; TLP-PT: trastornos linfoproliferativos postransplante; TLP-VIH: trastornos linfoproliferativos asociados al SIDA; LCLs: lneas celulares linfoblastoides. La forma de latencia I se observa en el linfoma Burkitt (LB) y en los linfocitos B infectados que circulan en la sangre perifrica. En esta forma de infeccin la expresin del genoma viral queda limitada a los EBERs y a la protena EBNA-1 cuya funcin es indispensable para mantener el episoma pero que carece de capacidad inmungena. Este patrn tan restringido de expresin gnica permitira a las clulas infectadas escapar a la vigilancia inmune por CTL, favoreciendo as la persistencia de la infeccin latente. La forma de latencia tipo II se asocia fundamentalmente a neoplasias. En esta forma se expresan la protenas EBNA-1, LMP-1, LMP-2A y 2B y los EBERs. Es la que caracteriza a la enfermedad de Hodgkin (EH) y al carcinoma nasofarngeo (CNF). La forma de latencia tipo III es la que caracteriza a las lneas linfoblastoides y se observa tambin en la mononucleosis infecciosa y en la gran mayora de los trastornos linfoproliferativos B asociados a inmunodeficiencia. La inmunosupresin actuara permitiendo que los linfocitos B infectados expresen todas las protenas asociadas a la infeccin latente sin que sean reconocidos y eliminados por los CTL. Tabla 2. Patogenia del VEB Inhibicin de apoptosis Induccin de porliferacin celular Induccin de traslocaciones Escape a la respuesta inmune BHRF 1 y LMP-1 LMP-1, EBNA-2, BCRF 1, EBNA-LP EBNA-1 BCRF 1, mutantes delecionados de LMP-1

Investigaciones recientes demuestran que el espectro fenotpico o morfolgico de las celulas B que portan el VEB in vivo es mucho mas amplio que in vitro abarcando desde el linfocito pequeo hasta la clula plasmtica pasando por el inmunoblasto. Se postula as la hiptesis de que el VEB persiste in vivo integrando su biologa con la de la clula B normal en la que reside y que la clula B normal le provee de todos los medios necesarios para que el VEB mantenga su ciclo vital. Esta nueva forma de entender la relacin entre el VEB y el linfocito B sostiene que el tipo de latencia del VEB podra depender del estado de la clula B en la que el virus reside y propone una nomenclatura nueva para los diferentes tipos de latencia basada en la conducta del virus en las clulas normales, desechndose la nomenclatura anterior para la latencia viral que se basaba en la diferente expresin de los productos virales en tumores asociados al VEB y en lneas de clulas B inmortalizadas in vitro; es decir, en estados no fisiolgicos. Esta nueva teora parte de que el ciclo vital del VEB est limitado a las clulas linfoides B ya que nicamente se ha detectado en ellas y es en ellas donde persiste y se replica. El VEB persistira en las clulas B en reposo de la sangre perifrica. La expresin viral quedara limitada a LMP-2 y probablemente a EBNA-1. La funcin de LMP-2 es bloquear las seales que permiten al virus reactivarse. Y aunque LMP-2 es una protena inmungena, como la clula esta en reposo no puede ser detectada por los CTL ya que le falta la mlecula HLA-I co-estimuladora B7. En esta situacin, el virus es invisible para el sistema inmune del husped y las clulas infectadas no son una amenaza para el individuo ya que ni proliferan ni replican virus. Este sera el programa de latencia del VEB en los linfocitos B en reposo. La regulacin de la persistencia de clulas B infectadas se realizara en el ganglio linftico mediante seales que provienen del virus o del ambiente. Para mentener la persistencia de la infeccin latente los linfocitos B infectados por el VEB de la sangre perifrica podran recibir seales en el ganglio linfatico que le cambien al programa de EBNA-1. En este programa se expresara slo esta protena, que es necesaria para replicar el episoma y, por lo tanto, para la proliferacin. La ventaja de este programa es que EBNA- 1 es la nica protena codificada por el virus que contiene una secuencia peptdica no reconocible por los CTLs. Este programa es un mecanismo que mantiene el nivel de clulas infectadas de forma latente favoreciendo que stas no sean detectadas por el sistema inmune. Es el equivalente al tipo de latencia I del otro modelo. Durante la infeccin aguda y probablemente en las reactivaciones es necesaria la expansin y la diseminacin de la infeccin, para ello se inducira en los linfocitos B el programa de crecimiento, que es anlogo al tipo de latencia III del

modelo anterior, y que permitira la expansin del virus, pero que, a su vez, al generar clulas inmortales podra constituir una amenaza para el husped. Sin embargo, cuando la clula B entra en este programa expresa diferentes protenas inmungenas (EBNAs y LMPs) que inducen una respuesta. El papel de los CTLs sera impedir la supervivencia de los linfocitos B infectados por el VEB que expresen un programa de crecimiento y as minimizar el riesgo de acontecimientos secundarios que favorezcan el desarrollo de linfomas.

Tabla 3. Fenotipo in vivo de los linfocitos B infectados por VEB. Latencia Nombre antiguo Localizacin Fenotipo celular Genes del VEB Expresados Vida media Reconocimiento Por CTL Periferia B7 neg Reposo LMP2 EBNA1?* Persistente? Invisible Programa EBNA1 Lat. I Tej. linfoide Activado Proliferacin EBNA1 Limitada No presentado Programa de crecimiento Lat. III Tej. linfoide Activado Proliferacin EBNA1-6 LMP1,2 Limitada Efectivo Fenotipo in vitro Lat. III Cultivo tisular Activado Proliferacin EBNA1-6 LMP1,2 Inmortal Efectivo

B7: molcula HLA-I ausente de linfocitos B y necesaria para que los CTL puedan reconocer la clula infectada. CTL: linfocitos T citotxicos. * El antiguo patrn de latencia de tipo II, tpico de CNF y EH, sera similar al patrn de latencia, pero con expresin aberrante de LMP-1. ASPECTOS PATOGNICOS DEL VEB Como en el ciclo ltico se produce la muerte de clula infectada, los genes que se expresan exclusivamente en ste no parecen tener demasiada importancia en la tumorognesis, con la excepcin de ellos los genes BHRF1 y BCRF1 que s podran tener un papel en el desarrollo de tumores. Por el contrario, los genes que se expresan en la infeccin latente son de especial inters en la patognesis de las neoplasias asociadas al VEB (tabla 4). Los mecanismos patognicos por los que el VEB es capaz de inducir la aparicin de tumores se relacionan con las protenas codificadas por algunos de los genes expresados en la infeccion latente. Dichos productos inducen diferentes efectos sobre la clula husped infectada (tablas 4) que facilitan el desarrollo de tumores.

Tabla 4. Genes del VEB cuyos productos podran estar implicados en la tumorognesis. EBNA 1 EBNA 2 EBNA 3A (3B, EC) EBNA LP LMP-1 Protena que interfiere con la funcin normal de las protenas p53 y pRb nica protena del VEB con capacidad oncognica demostrada, interacciona con factores asociados a la familia de los receptores del TNF (TRAF); causa sobrexpresin de la protena Bcl-2, A20 y de la IL-10 Factor transcripcional, esencial para el mantenimiento del VEB. Induce la expresin de RAG1 y RAG2 in vitro Factor transcripcional, esencial para la transactivacin de LMP-1 Factores transcripcionales, que favorecen una potente respuesta inmune

LMP 2 A/B EBER 1/2 BHRF 1 BCRF 1

Protena relacionada con la familia src de las tirosn kinasas, pudiendo controlar la actividad del ciclo ltico del VEB Fragmentos de ARN no traducidos, que se expresan muy abundantemente y cuya funcin es desconocida Protena homloga de Bcl-2, capaz de inhibir la apoptosis Protena homloga de la IL-10, capaz de estimular la proliferacin celular B e inhibir la capacidad citotxica de los linfocitos T (CTL)

Mecanismos patognicos del VEB Son bsicamente cuatro: 1. El mantenimiento de las poblaciones celulares infectadas mediante la inhibicin de la muerte celular por apoptosis: BHRF1, debido a su homologa con bcl-2 podra interferir en el balance entre bcl-2 y bax y, por este mecanismo, inhibir la apoptosis. LMP-1, una de cuyas acciones consiste en aumentar los niveles de bcl-2 y as inhibir la apoptosis.

2. La induccin de proliferacin celular mediante: LMP-1, esencial para la transformacin de los linfocitos B primarios. EBNA2, cuya actividad muy probablemente consiste en mediar la transactivacin de LMP-1 y de otros genes celulares implicados en la proliferacin. BCRF1, protena anloga a la IL-10 humana que actuara como un factor de crecimiento autocrino de clulas B. EBNA-LP, que puede formar complejos con p53 y pRb, y al secuestrar los productos de estos genes supresores de tumores, activara la proliferacin celular.

3. La induccin de recombinasas que posibilitan translocaciones mediante: EBNA-1, que induce la expresin de los genes RAG-1 y RAG-2, lo que podra favorecer la produccin de recombinaciones aberrantes (translocaciones).

4. La evasin de la respuesta inmune mediada por clulas T: Las protenas virales ms antignicas para los linfocitos T son: EBNA 3A, 3B y 3C, pero los linfocitos T responden tambin frente a EBNA-2, EBNA-LP, LMP-1. Los mtodos que utiliza el VEB para escapar a la respuesta inmune son : Regular a la baja las protenas virales con mayor poder antignico. Inhibir a las clulas T mediante la secrecin de algunas citoquinas por la clulas infectadas como IL-10 y TGF.

SINDROMES LINFOPROLIFERATIVOS Linfoma de Burkitt El LB es un linfoma altamente agresivo que se suele presentar en localizaciones extraganglionares o leucemizado. Desde el punto de vista epidemiolgico se distinguen tres formas de presentacin: B endmico. Aparece en frica ecuatorial y Papa-Nueva Guinea, donde representa la enfermedad maligna ms L frecuente en la infancia. La mayora de los casos de LB endmico se asocian al VEB. La mandbula y otros huesos de la cara son el lugar de presentacin en el 50% de los casos. LB espordico. Esta variante no tiene ninguna predileccin geogrfica, afectando a enfermos de todo el mundo. La incidencia es baja y supone entre el 1-2% de todos los linfomas. Constituye, no obstante, el 30-50% de todos los linfomas en la infancia. La mayora de casos se presentan en forma de masas abdominales. Tan slo en un 1520% de los casos se demuestra la presencia del VEB. LB asociado a inmunodeficiencia. En esta variedad, la localizacin ganglionar es frecuente, as como la infiltracin de la mdula sea. Se demuestra el VEB en tejido tumoral en el 25-40% de los casos.

La traslocacin gentica que implica la activacin del oncogen c-myc es un hallazgo constante en todas las variedades epidemiolgicas y probablemente explica buena parte de las alteraciones celulares de este tipo de linfoma. Las clulas neoplsicas del LB asociado al VEB slo expresan EBNA1 y EBER, es decir, un patrn de latencia tipo I. Puede resultar paradjico comprobar cmo un linfoma tan agresivo como el LB parece no servirse de dos de los productos de latencia con mayor actividad linfoproliferativa, como son LMP1 y EBNA2. Es muy probable que las clulas del LB no precisen de la colaboracin de esos productos del VEB, ya que la accin de oncogn c-myc es suficientemente poderosa. Por otro lado, la ausencia de LMP y EBNA en las clulas tumorales del LB les permite esquivar la accin de los linfocitos T citotxicos. En las lneas celulares de LB que expresan un patrn de latencia del tipo I se ha podido comprobar una mayor resistencia a la accin de los linfocitos T citotxicos, mientras que las que expresan un patrn de latencia tipo III son ms sensibles a la lisis mediada por los linfocitos T. Linfoma de Hodgkin El LH se caracteriza por la proliferacin de una minora de clulas neoplsicas (clulas de Reed-Sternberg-Hodgkin, RSH) en un medio celular reactivo que constituye la mayora del tumor. El porcentaje de casos en que se demuestra la presencia del VEB en el componente neoplsico de los LH es muy variable, oscilando entre el 40-70%. La prevalencia de positividad del VEB en las clulas de RSH vara segn el subtipo histolgico y los factores epidemiolgicos. La frecuencia ms elevada (75%) se encuentra en la celularidad mixta y la incidencia ms baja (10-40%) en la esclerosis nodular. En la poblacin de regiones subdesarrolladas y en pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) la infeccin por el VEB es casi del 100%. El tipo de VEB tambin vara segn las reas geogrficas. En pases desarrollados predomina el tipo1, mientras que en los subdesarrollados predomina el 2. El LH que es positivo para el VEB en el diagnstico lo es tambin en la recada, con persistencia de la misma cepa. Las clulas RSH infectadas por el virus expresan LMP1 y EBNA1 siendo negativo EBNA2. Es posible que LMP1 intervenga en la activacin de las vas de sealizacin que alteran los mecanismos de apoptosis, tales como NF- En algunos LH B. que no contienen el VEB se ha demostrado la existencia de mutaciones en los sistemas inhibidores de NF-B, por lo que se obtendra una alteracin similar a la inducida por el VEB. Linfomas T perifricos y de clulas T/NK El 40% de los linfomas T perifricos contiene algunas clulas infectadas por el VEB, que expresan los EBER y LMP1. Caractersticamente, en estos linfomas slo una pequea proporcin de las clulas neoplsicas est infectada por el virus. El linfoma T/NK extraganglionar de tipo nasal se asocia estrechamente con el VEB. El hecho de que en este tipo de procesos linfoproliferativos se detecte infeccin clonal y se observe expresin de LMP1 en algunas clulas neoplsicas sugiere que el VEB puede tener un papel patognico precoz. Se caracteriza por un infiltrado angiodestructivo con necrosis tisular asociada. Este linfoma tiene una mayor prevalencia en Asia, Mjico, Amrica Central y Sudamrica. Se suele localizar en la cavidad nasal, nasofaringe, paladar, tejidos blandos, tracto gastrointestinal y testculos. Granulomatosis linfomatoide Es un sndrome linfoproliferativo heterogneo angiodestructivo que se localiza habitualmente en pulmn. Est formado por linfocitos B que contienen el VEB entremezclados con clulas T reactivas. La granulomatosis linfomatoide puede progresar a un LBDCG. Es una enfermedad rara que se suele presentar en adultos, con frecuencia varones. Los pacientes suelen consultar por sintomatologa respiratoria acompaada de sntomas sistmicos. Los pacientes inmunodeprimidos tienen un riesgo mayor de padecer este sndrome linfoproliferativo. Las clulas linfoides neoplsicas contienen el VEB. En funcin del nmero de clulas positivas para este virus por hibridacin in situ se distinguen tres grados de granulomatosis. Las clulas neoplsicas suelen expresar LMP1 en la membrana celular. Linfomas asociados a una inmunodeficiencia Tanto los procesos linfoproliferativos asociados al trasplante de rganos como los linfomas que aparecen en la infeccin por el VIH estn estrechamente relacionados con el VEB. Linfomas asociados a la infeccin por el VIH El espectro actual de los linfomas no Hodgkin (LNH) asociados a la infeccin por el VIH est constituido por linfomas sistmicos y linfomas primarios del sistema nervioso central (LPSNC). Los primeros incluyen el linfoma B difuso de clula grande (LBDCG), el LB, el linfoma primario de cavidades (LPC) y el linfoma plasmablstico de la cavidad oral. Los linfomas sistmicos que se desarrollan en pacientes infectados por el VIH son predominantemente linfomas de clulas B de caractersticas clnicas agresivas. Es habitual la presentacin extraganglionar, el diagnstico en estadios avanzados y con frecuente presencia de signos de afeccin sistmica. Los linfomas B difusos de clulas grandes estn constituidos exclusivamente por clulas blsticas. Se distinguen dentro de esta categora algunas variedades morfolgicas sin que ello tenga implicaciones pronsticas o teraputicas. En aproximadamente el 90% de casos se demuestra la presencia de productos de la infeccin del VEB, tales como LMP1. En el caso del LPC se trata de un linfoma asociado al herpesvirus humano 8 (HHV-8), en el que la presencia de VEB es constante y que se manifiesta en forma de derrames neoplsicos en cavidades serosas sin masas tumorales, aunque ya se han descrito varios casos con manifestacin tumoral exclusiva. Las clulas de los LPC muestran gran pleomorfismo y diferenciacin plasmoctica, tanto en su morfologa como en el inmunofenotipo. Para realizar el diagnstico de LPC es

imprescindible demostrar la infeccin del linfoma por el HHV8. La presencia de VEB es tambin constante. Los linfomas plasmablsticos se localizan principalmente en la cavidad oral. En la mayora de casos se presentan en forma localizada, aunque pueden diseminarse al abdomen, retroperitoneo y mdula sea. Al igual que el LPC, es muy caracterstica la diferenciacin plasmocelular. El VEB est presente en ms del 50% de casos. En la poca previa al tratamiento antirretroviral de gran actividad, los LPSNC suponan el 10-20% de los linfomas asociados al sida. Con la generalizacin de estos tratamientos se ha evidenciado un descenso significativo de este tipo de linfomas. La mayora de los pacientes se encuentran muy inmunodeprimidos, con cifras de linfocitos CD4 muy bajas (<200 clulas/mm3). Los LPSNC son tumores limitados al sistema nervioso central que aparecen localizados generalmente en un hemisferio cerebral, aunque tambin pueden aparecer en el cerebelo, ganglios de la base y tronco cerebral. El tamao de estos tumores suele ser superior a 3 cm. Se trata de linfomas de clulas B de clula grande que, de una manera constante, expresan marcadores de infeccin por el VEB. Enfermedad linfoproliferativa postrasplante Se conoce como enfermedad linfoproliferativa postrasplante (ELPT) a un espectro de lesiones que abarca desde la proliferacin linfoide atpica a un verdadero linfoma, que se produce como consecuencia de la inmunodepresin en receptores de rgano slido o de un trasplante alognico de progenitores hematopoyticos. La ELPT incluyen las siguientes entidades: a) lesiones precoces (early lessions): hiperplasia plasmoctica reactiva y ELPT similares a mononucleosis infecciosa; b) ELPT polimrfico; c) ELPT monomrfico; y d) linfoma de Hodgkin.(Tabla 5) Esta proliferacin linfoide aparece como consecuencia de las pautas de inmunosupresin que son instauradas tras el trasplante, las cuales condicionan un descenso en la funcin de clulas T especficas frente al VEB. Esto desencadena una proliferacin incontrolada de clulas B infectadas por dicho virus. La mayora de ELPT estn asociados al VEB y corresponden a proliferaciones clonales de clulas B o, con menor frecuencia, policlonales. El patrn de expresin de los productos de latencia es del tipo III, similar al de las lneas celulares linfoblastoides obtenidas in vitro. No obstante, se han descrito ocasionalmente patrones de latencia de los tipos I y II. Las caractersticas clnicas de los ELPT son variables y dependen del tipo de inmunodepresin, del rgano trasplantado y del tipo morfolgico. En los pacientes sometidos a trasplante de rgano slido (TOS) la incidencia de ELPT es del 1 al 30%, dependiendo del tipo de trasplante y de la edad del paciente. La incidencia de ELPT vara segn el tipo de trasplante, y son el trasplante pulmonar y el de intestino delgado los que presentan mayor incidencia (5-32%) y el trasplante renal el de menor riesgo, con una incidencia inferior al 1%. Estas diferencias pueden deberse a la mayor intensidad de la inmunosupresin empleada en estos tipos de trasplante,la cual es uno de los factores de riesgo ms importantes para el desarrollo de ELPT. En este sentido, se ha evidenciado que la induccin y el tratamiento del rechazo con OKT3 y globulina antitimoctica se relacionan con un mayor riesgo de ELPT25. En la poblacin peditrica sometida a trasplante de hgado, la incidencia es del 10%, con una mortalidad del 60% y con una alta morbilidad que incluye la prdida del rgano trasplantado. El perodo de mayor riesgo de aparicin de ELPT es el primer ao postrasplante. En receptores de TOS la mediana del tiempo de comienzo de ELPT es de 6 meses, mientras que en el caso del trasplante de progenitores hematopoyticos (TPH) es de 2 meses tras el trasplante, presentndose generalmente con formas ms extensas y agresivas de la enfermedad (Figura 3). En aproximadamente el 20% de todos los ELPT no se demuestra ninguna asociacin con el VEB. De hecho, para el diagnstico de ELPT no se requiere la presencia de VEB en las clulas tumorales. Por ejemplo, en el contexto del trasplante renal, hasta en la mitad de los ELPT no se demuestra presencia del virus. La mayora de los linfomas que no albergan el virus se diagnostican cuando han pasado ms de cinco aos desde el trasplante renal y presentan mayor mortalidad. Curiosamente, estos ELPT no asociados al VEB tambin se benefician de la disminucin de los tratamientos inmunosupresores.

TABLA 5. Clasificacin actual de la OMS de la enfermedad linfoproliferativa postrasplante ELPT hiperplsica lesiones precoces Hiperplasia plasmtica reactiva Mononucleosis infecciosa Hiperplasia linfoide atpica ELPT polimrfica ELPT linfomatosa (ELPT monomrfica) Linfoma de clulas B Linfoma difuso de clulas grandes

Linfoma de Burkitt/Burkitt-like Linfoma MALT Linfoma de clulas T Linfoma perifrico de clulas T Linfoma anaplsico de clulas grandes Linfoma hepatoesplnico de culas gamma-delta Otros (p. ej. clulas T-citotxicos) Otras Plasmocitoma Mieloma Linfoma B de clulas grandes tipo enfermedad de Hodgkin ELPT: enfermedad linfoproliferativa postrasplante; MALT: linfoma del tejido linfoide asociado a mucosas; OMS: Organizacin Mundial de la Salud

Figura 3. Cronologa de la infeccin viral tras el trasplante En la actualidad no existen datos concluyentes sobre la asociacin particular entre algunos de los frmacos inmunosupresores con el desarrollo de ELPT. Aunque existe discusin a este respecto sobre los efectos del tacrolimus en comparacin con ciclosporina A, el frmaco ms reciente micofenolato mofetil no se ha asociado con mayor riesgo de ELPT. El efecto de los inhibidores de la serina-treonina cinasa de mamferos, sirolimus y evorolimus no se ha aclarado an. Sin embargo, podramos pensar que dado su efecto inhibidor sobre las celulas derivadas de ELPT en modelos animales, su empleo no se asocie a mayor riesgo de ELPT. En general, podemos concluir que probablemente el grado de inmunosupresin global ms que cada frmaco inmunosupresor en particular, interviene de forma ms importante en el desarrollo de ELPT. Adems de con la inmunosupresin, la ELPT se ha relacionado con el estado serolgico del receptor frente al donante respecto al VEB. De esta forma, los receptores seronegativos que reciben rganos de donantes seropositivos presentan entre 10 y 50 veces mayor riesgo de ELPT como consecuencia del desarrollo de infeccin primaria por VEB. Esto justifica adems la mayor incidencia de ELPT en la poblacin peditrica en perodos precoces tras el trasplante. El mayor riesgo de ELPT en receptores seronegativos que reciben injertos de donantes seropositivos frente a VEB ha posibilitado que se haya sugerido la inmunizacin pretrasplante frente al virus como una de las estrategias de prevencin de la enfermedad. Sin embargo, y aunque se encuentra en desarrollo, en la actualidad no se dispone de una vacuna frente al VEB. Por otro lado, existen datos contradictorios sobre la utilidad de la profilaxis frente a CMV para la prevencin de ELPT. Se ha observado que el CMV es cofactor de reactivacin del VEB y factor de riesgo independiente de ELPT en este tipo de pacientes, por lo que la correcta profilaxis frente a CMV en esta poblacin es crucial para evitar la ELPT asociada al VEB. La localizacin donde puede desarrollarse la ELPT parece estar en relacin con el tiempo transcurrido desde la realizacin del trasplante. En receptores de trasplante pulmonar, ms del 50% de todas las ELPT durante el primer ao se desarrollan sobre el injerto, mientras que esta localizacin se afecta solamente en el 15% de las ocasiones tras este perodo. Este hecho se ha comprobado igualmente en el caso del trasplante renal.

Adems de la implicacin del injerto, otras localizaciones extralinfoides pueden verse afectadas por la ELPT; predomina fundamentalmente el tracto gastrointestinal. Se ha especulado que la continua exposicin antignica que tiene lugar en esta localizacin podra desencadenar una respuesta inflamatoria local que sera la responsable de la aparicin de ELPT. Otras localizaciones frecuentemente afectadas por la ELPT son los senos paranasales, el sistema nervioso central, los ganglios linfticos y la piel. Para el diagnstico precoz de ELPT se requiere un alto grado de sospecha clnica, debido a que generalmente no existen formas clnicas especficas de presentacin. Esto es especialmente importante cuando se produce afectacin del injerto por ELPT. Los receptores de trasplante renal con ELPT del injerto se presentan por lo general con insuficiencia renal, hidronefrosis o fiebre. En estos casos, la ultrasonografa puede revelar la presencia de adenopatas. Si se tiene en cuenta que el aparato gastrointestinal es una localizacin frecuente de ELPT, la aparicin de sntomas como diarrea o sangrado digestivo deben hacernos pensar en la posibilidad de ELPT como causante del cuadro. Debido a la inespecificidad de los sntomas, resulta necesario el empleo de mtodos diagnsticos que permitan establecer un diagnstico de certeza de la forma ms precoz posible. Entre estos mtodos se encuentra la deteccin del ADN de VEB mediante tcnicas de PCR, entre las cuales se considera de eleccin la de PCR cuantitativa en tiempo real. Sin embargo, existen dudas respecto al tipo de muestra a emplear (plasma, clulas mononucleares de sangre perifrica o sangre total) y en cuanto a los valores de carga viral ms adecuados como punto de corte. Estas limitaciones condicionan que el incremento en la carga viral de VEB en un paciente concreto, en lugar de los valores aumentados sobre un determinado punto de corte, presente mayor valor para identificar a los pacientes en riesgo de ELPT31. Adems de la deteccin del ADN viral, otros autores han sugerido que la deteccin de las concentraciones de interleucina-10, un factor que interviene en el crecimiento de las clulas B transformadas por el VEB, podra tener un valor predictivo de desarrollo de ELPT, lo cual ha de ser confirmado en posteriores estudios. En cuanto al diagnstico por imagen, la tomografa por emisin de positrones con fluodeoxiglucosa se ha mostrado superior a la tomografa computarizada y a la ultrasonografa en la visualizacin de linfomas malignos,en la deteccin de localizaciones extralinfoides y en la evaluacin de enfermedad residual tras el tratamiento. Respecto al tratamiento de la ELPT, no existen grandes ensayos prospectivos y aleatorizados, por lo que la mayora de las recomendaciones se han establecido a partir de resultados extrados de series de casos y anlisis retrospectivos. En general, el tratamiento de la ELPT debe orientarse hacia el aumento de la respuesta inmune, la destruccin de las clulas malignas y la eliminacin del VEB. La reduccin en la inmunosupresin se considera la primera lnea de tratamiento de la ELPT. El grado de reduccin del tratamiento inmunosupresor debe individualizarse en cada paciente, y puede estar limitado por el riesgo de rechazo o cuando el injerto es imprescindible para la supervivencia del paciente. Esta estrategia presenta diferentes tasas de respuesta, que oscilan entre el 0 y el 89%, en funcin de factores pronsticos tales como valores elevados de lctico deshidrogenasa, la afectacin multiorgnica de ELPT y la presencia de disfuncin orgnica en el momento del diagnstico. La quimioterapia citotxica convencional puede ser empleada en pacientes con ELPT que no presentan respuesta o cuando resulta imposible reducir el grado de inmunosupresin. Varios regmenes de quimioterapia como el CHOP (ciclofosfamida, adriamicina, vincristina y prednisona)han sido empleados en estos pacientes con buenos resultados, aunque la alta mortalidad asociada a las complicaciones del tratamiento limita su empleo en numerosas ocasiones. En cuanto al valor de los frmacos antivirales como aciclovir o ganciclovir en el tratamiento de la ELPT existe una experiencia limitada que incluye un pequeo nmero de estudios no aleatorizados con diferentes poblaciones de riesgo y dosificaciones desiguales. Finalmente, los anticuerpos monoclonales constituyen una opcin atractiva para el tratamiento de ELPT debido a su baja capacidad inmunosupresora, su actividad frente a clulas linfocitarias y su potencial para activar las clulas del sistema inmune. Entre este grupo, rituximab, un anticuerpo monoclonal quimrico anti-CD20 ha demostrado los mejores resultados. Choquet et al realizaron un ensayo prospectivo y multicntrico de rituximab en pacientes con ELPT en el que se incluyeron pacientes peditricos y adultos tratados con dosis estndar de 375 mg/m2 semanalmente durante 4 semanas. El 68% de los pacientes present respuesta mantenida al ao de seguimiento con una baja incidencia de efectos adversos. Hasta hace poco tiempo, los pacientes con ELPT sin respuesta a la disminucin del tratamiento inmunosupresor eran sometidos a tratamiento con quimioterapia citotxica convencional. En la actualidad no existen estudios que hayan comparado de forma prospectiva y aleatorizada las pautas de quimioterapia frente a rituximab. Sin embargo, en un estudio retrospectivo que incluy a 35 pacientes, las tasas de supervivencia y curacin fueron similares en ambos grupos, aunque con una menor toxicidad y mortalidad relacionada con el tratamiento en el grupo que recibi rituximab. Estos resultados han posibilitado que algunos autores sugieran que rituximab debera ser considerado antes que la quimioterapia como segunda lnea de

tratamiento en los casos de ELPT CD20 positivos, reservando la quimioterapia para los pacientes en los que no pueda usarse o que no respondan a rituximab HEPATITIS La primoinfeccin por el virus de EB ocasiona hepatitis generalmente leve y autolimitada en pacientes inmunocompetentes (Tabla 6). Es una manifestacin comn de la mononucleosis infecciosa, afectando al 90 % de los pacientes. Se caracteriza por una elevacin moderada de las enzimas hepatocelulares, dos o tres veces por encima del lmite superior de la normalidad y ocasionalmente de la bilirrubina (9%).El curso suele ser benigno y autolimitado sin progresin a la cronicidad. Excepcionalmente se describen casos de hepatitis fulminante, como sucede en el sndrome de Duncan (Tabla 7).Se trata de una rara enfermedad linfoproliferativa ligada al cromosoma X y caracterizada por el desarrollo de fracaso heptico en varones jvenes con historia familiar de fracaso heptico, linfoma, dficit de inmunoglobulinas o pancitopenia tras la primoinfeccin por el VEB y uniformemente fatal. La hepatitis persistente es una manifestacin del sndrome de infeccin crnica activa por el VEB. Este sndrome se define por cuatro criterios: a)enfermedad prolongada, de ms de 3 meses tras la primoinfeccin por el VEB, incluyendo fiebre, hepatitis persistente, linfadenopatas, hepatoesplenomegalia, pancitopenia, uvetis, neumona intersticial o hipersensibilidad a las picaduras de mosquito. b)ttulos elevados de anticuerpos frente al VEB (IgG anti- VCA >1:5,120) y anti-EA (>1:612), persistencia de IgA frente a esos complejos antignicos y ausencia de anticuerpos anti-EBNA-1, junto a la demostracin del ADN del VEB en los tejidos enfermos o sangre perifrica. c)Evidencia histolgica de afectacin de rgano, neumonitis, uvetis, sndrome hemofagoctico, linfadenitis o hepatitis persistente d) Ausencia de alteracin inmunolgica previa o reciente que pueda explicar las alteraciones. El pronstico de los pacientes con este sndrome es malo, con una mortalidad del 43% a los 11 aos de la infeccin aguda. Se ha descrito la curacin de 2 casos de pacientes con la enfermedad de Duncan tratados con rituximab.

Tabla 6. Principales infecciones causadas por el virus Epstein-Barr

Tabla 7.Principales caractersticas clnicas de la hepatitis por el virus Epstein-Barr ROTURA ESPLNICA La rotura espontnea de bazo es una complicacin rara, pero bien documentada de la MI. La incidencia de esta complicacin est estimada en el 0,1% de las MI diagnosticadas. Casi todos los casos se han producido dentro de las 4

primeras semanas del comienzo de los sntomas y la mayor incidencia se observa en la segunda o tercera semana de la enfermedad. Aproximadamente un 50% de los casos ocurre espontneamente, sin traumatismo previo. No hay correlacin entre la gravedad de la enfermedad, la anormalidad de los valores analticos o el examen fsico ( bazo palpable) y la susceptibilidad a la rotura. Por ello, todos los pacientes con MI son susceptibles de sufrir rotura de bazo. Razn por la que se les recomienda evitar actividad fsica intensa durante 1 mes tras el comienzo de los sntomas, y de esta forma minimizar el riesgo de esta complicacin potencialmente fatal. El bazo se infiltra de linfocitos, normales y atpicos , y aumenta de tamao, llegando a alcanzar un volumen dos o tres veces superior a lo normal. Por otra parte,las estructuras de sostn de la cpsula y las trabculas estn muy adelgazadas debido a la infiltracin linfocitaria masiva. En estas condiciones, el bazo se vuelve frgil y un pequeo traumatismo y los valsalvas de la tos, el vmito o la defecacin lo convierten en vulnerable a la rotura. Una vez recuperado de su enfermedad los pacientes asplnicos tienen riesgo incrementado de sufrir infecciones graves por bacterias capsulaza. Los adultos en estas condiciones deben recibir las vacunas antineumoccica 23-valente, anti-H. influenzae tipo b y antineumoccica. Tambin es recomendable la vacunacin antigripal anual. Los pacientes deben ser instruidos sobre el riesgo de sufrir infecciones graves. La sepsis posesplenectoma puede ser fulmionante. Por ello, ante la aparicin de sntomas que pueden indicar una infeccin bacteriana, loa pacientes deben automedicarse de forma emprica con Amoxicilina/cido clavulnico, cefuroxima, levofloxacino o moxifloxacino. La profilaxis antibitica diaria continuada se recomienda en nios, pero no hay consenso sobre su indicacin en adultos. DIAGNSTICO SEROLGICO En los cuadros de mononucleosis infecciosa producidos por el VEB aparecen diversos anticuerpos, tanto frente a los antgenos especficos de este virus como, dependiendo de la edad, frente a protenas no codificadas por l: los llamados anticuerpos heterfilos (AH), que se caracterizan por provocar la aglutinacin de los eritrocitos de diversos mamferos. Al inicio de la infeccin aparecen anticuerpos del tipo IgM e IgG frente al VCA, y de la clase IgG frente al EAd. Los anticuerpos VCA-IgM y EAd-IgG se mantienen unos dos o tres meses, mientras que los de tipo IgG frente al VCA pueden seguir detectndose de por vida. Los anticuerpos frente a los antgenos EBNA no aparecen al inicio de la infeccin, sino unos meses ms tarde, por lo general coincidiendo con el declinar de los anticuerpos VCA-IgM, y se mantienen igualmente de por vida. Aunque ste es el patrn de respuesta habitual (Figura 4 y Tabla 8), hay que tener en cuenta diversas situaciones excepcionales. Por ejemplo, los anticuerpos IgM frente al VCA pueden estar ausentes en la infeccin primaria, o persistir durante meses e incluso aos; asimismo, la respuesta inmune al antgeno EBNA puede no aparecer nunca, o volverse negativa en el caso de una inmunodepresin; por ltimo, en un 4-20% de las personas que han pasado la infeccin, la respuesta a los antgenos precoces puede persistir de manera excepcional, por lo que no pueden tomarse, de forma absoluta, como un marcador de infeccin reciente. Un patrn de infeccin pasada estara definido por la presencia de anticuerpos VCA-IgG y anti-EBNA, junto con la ausencia de AH y de anticuerpos especficos del tipo VCA-IgM. La respuesta de AH alcanza su valor mximo generalmente en la segunda o tercera semana del inicio de la enfermedad y se mantiene durante varios meses. Son anticuerpos de tipo IgM principalmente, aunque tambin se han detectado de las clases IgA e IgE; slo en un 5% de los casos, estos anticuerpos son del tipo IgG. Obviamente, este tipo de anticuerpos no est relacionado con antgenos especficos del VEB. En los pacientes inmunodeprimidos, la interpretacin de los resultados serolgicos para el diagnstico de reactivacin es difcil y compleja, debido a la escasa o nula produccin de anticuerpos. En los pacientes con tumores asociados al VEB se observa una elevacin de los ttulos de anticuerpos IgG anti-EA y anti-VCA, con posible disminucin de los ttulos antiEBNA. Siendo anti EAr en el linfoma de Burkitt e inmunodepresin propiamente dicha y anti EAd en el carcinoma nasofarngeo. Sin embargo, este patrn no es uniforme La mayor parte de los enfermos con carcinoma nasofarngeo, una forma de neoplasia muy frecuente en ciertas regiones de China, desarrollan respuesta de IgA a diferentes protenas del VEB, las pruebas serolgicas ms utilizadas en esta situacin son la determinacin de IgA frente al VCA y EA. Recientemente, se ha estudiado que la deteccin de IgA frente a la glucoprotena mayor de la envuelta gp350 podra ser igualmente til. Estas determinaciones tienen valor tanto en el diagnstico como en el seguimiento de la evolucin de este tipo de tumor. Algunos estudios indican que los ttulos elevados a VCA y EAr tendran valor pronstico en el linfoma de Burkitt. En algunos individuos la infeccin queda activa de forma crnica, con ttulos elevados a las protenas de la fase replicativa del ciclo viral. Aparecen sntomas persistentes, tales como esplenomegalia, y se produce un patrn recurrente que dura meses o aos, que se manifiesta, por ejemplo, por una pancitopenia. En estos enfermos, suelen detectarse ttulos elevados de anticuerpos anti-VCA y anti-EA, sin la presencia concomitante de anti-EBNA.

Por ello, se considera que la serologa no es til para el diagnstico de SLPT y se recomienda el empleo de otras tcnicas, como la deteccin de DNA del VEB mediante carga vrica para evaluar las reactivaciones en pacientes inmunodeprimidos y correlacionar los resultados con las manifestaciones clnicas. Figura 4. Evolucin de los anticuerpos en la mononucleosis infecciosa

Tabla 8. Marcadores serolgicos en las infecciones por el VEB. Tipo de anticuerposa Heterfilos VCA-IgM VCA-IgG Anti-EAd Anti-EAr + + + + + + + + +/+ + +/+ + +/Anti-EBNA

No infectados Mononucleosis Infeccin antigua Reactivacin Linfoma de Burkitt Carc. nasofarngeo

a+: presente; : ausente; El diagnstico serolgico de la mononucleosis infecciosa por el VEB puede realizarse mediante la deteccin de AH, o empleando pruebas serolgicas especficas que detectan la presencia de anticuerpos producidos frente a los antgenos del VEB. La aparicin precoz de los AH y de VCA-IgM, junto con el perfil especfico de otros tipos de marcadores serolgicos en los enfermos con este sndrome, permite el diagnstico en una nica muestra de suero de la fase aguda,coincidiendo con la aparicin de los sntomas. Para la deteccin de los AH se han empleado tcnicas de hemaglutinacin, de aglutinacin con ltex, inmunoenzimticas e inmunocromatogrficas. Algunas de estas pruebas son muy populares por la facilidad y rapidez de realizacin, su bajo coste y por medir anticuerpos de una forma eficiente en el subgrupo de edad (la adolescencia) en donde encontramos la mayor parte de los casos clnicos. Los AH aparecen en el 90-96% de los enfermos adultos con el sndrome de mononucleosis infecciosa por el VEB. En estas condiciones, la deteccin de estos anticuerpos (por ejemplo, mediante la tcnica clsica de Paul-BunnellDavidsohn), constituye la prueba fundamental para el diagnstico. Es conocido, que hasta un 50% de los nios menores de 5 aos no desarrolla AH, pero el hecho de que este cuadro no sea muy frecuente en este segmento de poblacin mantiene la validez general de la deteccin de esos anticuerpos. Como adems, los AH no aparecen en las infecciones por otros herpesvirus, en ocasiones, ayudan a diferenciar cuadros de mononucleosis originados por el CMV de los causados por el VEB. El diagnstico de la mononucleosis infecciosa mediante tcnicas de deteccin de anticuerpos producidos frente a los antgenos especficos del VEB, se basa habitualmente en la deteccin de los anticuerpos VCA-IgM. Un inconveniente de esta determinacin es que puede ser positiva en los enfermos con infeccin por el CMV, debido a un estmulo policlonal. Por otra parte, hasta en un 30% de los casos de mononucleosis por VEB pueden detectarse anticuerpos IgM frente al CMV. Sin embargo, un ttulo alto de los anticuerpos VCA-IgG, junto con la positividad de los anticuerpos anti-EA y la ausencia (o ttulos bajos) de los anticuerpos anti-EBNA, puede ser igualmente indicativo de una infeccin aguda por el VEB. Para la deteccin de antgenos especficos frente a VEB se utilizan, habitualmente, tcnicas de inmunofluorescencia (IFI) y ELISA. La determinacin de VCA-IgM debe realizarse tras separar la fraccin de las inmunoglobulinas IgM del suero

mediante cromatografa o una vez tratadas las muestras con un antisuero anti-IgG humana que elimine este tipo de inmunoglobulinas. De otra forma, conducira a una falta de sensibilidad de la prueba, por competencia con las IgG especficas, as como de especificidad, por la presencia del factor reumatoideo. Las tcnicas de IFI son ms especficas, pero son ms laboriosas, difciles de interpretar y requieren personal bien entrenado, por lo que sera deseable la utilizacin de pruebas de ms fcil ejecucin y ms objetivas, como las de ELISA, aunque, en la actualidad, la mayora de los laboratorios siguen empleando aqullas. La IFI est especialmente indicada para la confirmacin de los resultados dudosos por ELISA, como tcnica de la investigacin y como mtodo de referencia para la evaluacin de otros. Se pueden encontrar tcnicas de ELISA, para medir anticuerpos a VCA, con antgenos crudos, gp125 purificada o con protenas recombinantes (p18) con una sensibilidad y especificidad que oscilan entre el 54 y el 100%. En general, puede alcanzarse una mayor sensibilidad en las pruebas que emplean antgenos no purificados, pero a costa de una menor especificidad. Para la deteccin de anticuerpos contra el complejo EBNA, se pueden utilizar tcnicas de inmunofluorescencia anticomplementaria o de ELISA, empleando antgenos recombinantes, con una sensibilidad entre el 86% y el 100%, y una especificidad que oscila entre el 79% y el 100%. Existen igualmente pruebas de ELISA para la deteccin de anticuerpos anti-EA tambin con antgenos recombinantes: la sensibilidad y especificidad son del 92% y 94%, respectivamente. Se han realizado estudios que determinan la avidez de los anticuerpos IgG frente al VCA y el EA, mediante tcnica de IFI, con buenos resultados. Estas tcnicas tendran un papel relevante en las infecciones agudas que cursan con ausencia o bajos niveles de IgM anti-VCA. Tambin en la fase de convalecencia en la que persisten o se reactivan los anticuerpos VCA-IgM, o en ausencia de anti-EBNA debido a una inmunodepresin. Como vemos, a pesar de los grandes avances que se han conseguido en el diagnstico de la mononucleosis infecciosa por el VEB, ste es un campo que todava cabe perfeccionar. Sin embargo, la mayor dificultad a la hora de evaluar los resultados de los estudios de las nuevas tcnicas serolgicas, es la ausencia de un buen patrn de referencia,como sera el cultivo del microorganismo, si ste fuese factible en la prctica. Por esta razn, la mayor parte de las comparaciones con los nuevos mtodos o marcadores, se realizan enfrentndolos a tcnicas serolgicas ya existentes, lo que puede complicar su interpretacin. A esto debiramos aadir las limitaciones metodolgicas (pequeo tamao de la muestra, por ejemplo), presentes en algunos estudios. Por ltimo, puesto que el perodo de vigencia de las verdades cientficas es, por definicin, limitado, deberamos preguntarnos si no puede haber otros posibles agentes etiolgicos del cuadro de mononucleosis infecciosa no conocidos hasta el momento que pudieran explicar algunos patrones serolgicos atpicos. A modo de resumen, se podra concluir que, en el diagnstico serolgico de la mononucleosis por el VEB se pueden emplear como cribado, las tcnicas de deteccin de AH. Cuando stas son negativas, o en pacientes con sintomatologa atpica, es necesario el empleo de tcnicas de deteccin de anticuerpos especficos. Una estrategia razonable para abordar el diagnstico sera emplear, conjuntamente, una prueba de AH y otra de VCA-IgM. Otra posible alternativa es la de emplear una tcnica de deteccin de anticuerpos anti-EBNA, puesto que un resultado positivo por una tcnica suficientemente sensible, excluira un diagnstico de infeccin reciente por el VEB en la mayor parte de los casos. Caso de ser negativa la deteccin de anti-EBNA, habra que realizar una determinacin de IgM frente al VCA. Insistir, en que la utilizacin de las pruebas serolgicas especficas es fundamental en el diagnstico de la mononucleosis infecciosa en el mbito peditrico para nios menores de 5 aos. Las IgM pueden ser de un peso molecular 7S o 19S, siendo el primer tipo el que se detecta en infecciones no primarias. Se ha pretendido utilizar estas diferencias entre las IgM para distinguir entre las que se originan en las infecciones primarias y las que se originan en el resto de los casos (reinfecciones o reactivaciones). La IgG informan de la susceptibilidad a una infeccin primaria (cuando no existe), o potencial reactivacin en el curso de una inmunosupresin (cuando est presente). Aparece precozmente en la infeccin primaria, si la viremia es importante y se emplea una prueba con sensibilidad suficiente. Sus niveles se incrementan slo en las recurrencias clnicas con importante afectacin sistmica. La IgG est presente mucho tiempo, a veces durante toda la vida. Esto puede ser consecuencia de reinfecciones o reactivaciones La afinidad o "avidez" de la IgG para neutralizar el antgeno se va incrementando progresivamente en el curso de la infeccin primaria. De tal forma, se va reduciendo la cantidad de IgG que tiene una menor avidez y se incrementa la que tiene una avidez o capacidad de neutralizacin normal del antgeno. A los seis meses de la infeccin primaria prcticamente toda la IgG presente tiene una importante afinidad. La demostracin, entre toda la IgG especfica presente en una muestra de suero, de un predominio de la IgG de "baja avidez" pondra de manifiesto que se trata de una infeccin primaria reciente (menos de seis meses) por un agente determinado. Una vez alcanzada la avidez adecuada, sta no se modifica a lo largo de la vida del sujeto, independientemente de las oscilaciones de los niveles en suero, como consecuencia de las reinfecciones o reactivaciones. Por lo tanto, la medicin de la avidez de la IgG constituye una prueba que se debera acoplar en los informes que parten de nuestro laboratorio con un resultado de IgM positiva, ante la posibilidad de que sta no se deba a una infeccin primaria sino a una recurrencia clnica importante o un estmulo

clonal inespecfico. Esta puntualizacin es de especial transcendencia en el caso de las viremias importantes por parvovirus, CMVH, VHH-6, VEB y virus del herpes simple, de la varicela, rubola, sarampin y parotiditis. En muchas de estas infecciones las manifestaciones clnicas son poco especficas, la respuesta de IgG es precoz, y no se puede demostrar la seroconversin, pero s se puede realizar un anlisis de su avidez, coexistiendo con varias IgM, o con una sola porque no se han realizado ms estudios. Adems, ante una sospecha clnica importante de infeccin por un agente y una IgM negativa (como en las infecciones primarias o reinfecciones vacunales o no por el virus de la rubola, para diferenciar ambas) tambin se podra analizar la avidez de la IgG presente para descartar la posibilidad de un falso negativo de la IgM. As se diferencian procesos que tienen una trascendencia clnica muy diferente. Finalmente, tambin se puede estudiar la IgA. sta tiene un comportamiento similar a la IgM, aunque est presente menos tiempo y en menor cantidad. Su presencia en suero se ha asociado a la infeccin crnica persistente por un agente vrico. Sin embargo, la dificultad en su deteccin, los falsos negativos debido al exceso de IgG y los falsos positivos en sujetos con enfermedad heptica crnica, ha hecho que sea escasamente estudiada en los laboratorios hospitalarios. Tabla 9 . Pruebas para la deteccin de la infeccin por agentes vricos comunes mediante Serologa (actualizacin de Cartera de Servicios, SEIMC, 1999)._ Virus y clase de anticuerpo _ Prueba empleada_ Comentarioa_ Epstein-Barr VCA, IgG, IgA, IgM_ IFI, ELISA 3, 2a, 2b_ Epstein Barr EBNA, IgG, IgM_ IFI, ELISA_ 3, 2a, 2b_ Epstein Barr EA/D-R, IgG, IgM_ IFI, ELISA_ 3, 2a, 2b_ Epstein Barr (Ag total), IgG, IgM_ ELISA_ 2a, 2b_ Epstein-Barr, anticuerpos heterfilos (Paul AGLUTINACIN 1 -Bunnell)_ aComentarios. 1: Slo requieren equipo bsico de laboratorio. 2: Las tcnicas de ELISA se pueden efectuar en autoanalizadores (2a) (para procesar gran nmero de muestras con diferentes pruebas), o por mtodos manuales o semimanuales usando un equipo mnimo (lavador de microplaca, fotmetro, estufa) (2b). Todo este proceso se puede automatizar mediante "procesadores abiertos de microplacas de ELISA". 3: Microscopio de fluorescencia. 4: En el caso del Inmunoblot existen tcnicas automatizadas (4a) y manuales o semimanuales (4b)._ MTODOS DE DIAGNSTICO DE LAS NEOPLASIAS ASOCIADAS AL VEB La deteccin del VEB en laboratorio puede abordarse desde distintos enfoques (tabla 8), pero los avances ms importantes en los ltimos aos han sido debidos al anlisis molecular de los cidos nucleicos. En tejidos, la deteccin molecular de RNA derivados del VEB mediante hibridacin in situ se considera la tcnica de referencia para determinar si las lesiones histopatolgicas contienen el virus. La hibridacin in situ de EBER y la inmunohistoqumica de LMP1 son las tcnicas rutinarias para detectar la infeccin latente por VEB en los tejidos afectados por SLPT. La carga vrica del VEB en sangre se considera actualmente una tcnica de gran valor para la evaluacin clnica de los pacientes con riesgo de adquisicin de una neoplasia asociada a este virus. A continuacin se detallan algunas caractersticas metodolgicas de las pruebas ms tiles para establecer el estado de sndrome linfoproliferativo asociado a la infeccin por el VEB. Hibridacin in situ Es una tcnica de referencia para detectar la infeccin latente del VEB en los tejidos y posibilita la identificacin de la clula infectada, combinando la hibridacin in situ con la inmunohistoqumica. Puede aplicarse en tejidos fijados en formol e incluidos en parafina y en preparaciones citolgicas, siendo la tcnica ms recomendada para el diagnstico histolgico. Actualmente, los protocolos para hibridacin de los EBER (presentes en las clulas infectadas de forma latente en un gran nmero de copias) utilizan distintas sondas: oligonucletidos para DNA, sondas para RNA (ribosondas) y sondas para cidos nucleicos. Estas sondas pueden estar marcadas con biotina,digoxigenina,fluorescena, etc. La transcripcin de los EBER puede dar resultados falsos negativos por la degradacin del RNA, problema que disminuye con la utilizacin de controles de hibridacin. Aunque, en la prctica, la deteccin de DNA del virus es poco utilizada, salvo en situaciones en las que el RNA est degradado; en estos casos se emplean sondas dirigidas contra la secuencia BamHIW, una regin repetida del genoma del virus que permite una mayor sensibilidad en la deteccin cualitativa del virus. En general, en todas las clulas neoplsicas asociadas al VEB, incluyendo carcinomas, sarcomas y linfomas se observa positividad para los EBER, mientras que stos estn ausentes en las clulas normales adyacentes. Una vez identificado el tumor en el paciente y su asociacin con el virus, los EBER pueden usarse como marcadores de recurrencia de la enfermedad.

Southern blot El anlisis por southern blot se utiliza para determinar la clonalidad de los tejidos infectados por el VEB con respecto a la estructura del genoma vrico. Precisa de grandes cantidades de ADN de alto peso molecular, por lo que requiere utilizar tejido congelado en el que se realizar marcaje radiactivo. (Tabla 9) La tcnica se basa en la presencia de un nmero variable de secuencias de repeticin terminales presentes en el extremo de cada molcula de DNA lineal. En las clulas infectadas, los extremos TR del genoma se unen para formar el episoma. Para realizar esta prueba, el DNA de la zona de la lesin se digiere con enzimas de restriccin. Despus de la electroforesis y trasferencia, se aade una sonda marcada para detectar los fragmentos que contienen las zonas terminales repetidas. Los patrones de bandas que se observan en la electroforesis pueden ser monoclonales, oligoclonales y policlonales. En los tumores monoclonales se detecta una nica banda de elevado peso molecular, mientras que en los policlonales se observan varias bandas. En los pacientes inmonodeprimidos los tumores oligoclonales y policlonales tienen mejor pronstico. Amplificacin del DNA del VEB La amplificacin de zonas conservadas del genoma del VEB para detectar la infeccin vrica en diversas muestras clnicas como tejidos, sangre, saliva, etc. ha sido empleada desde hace algn tiempo para relacionar esta infeccin con diversas situaciones clnicas. Sin embargo, se ha observado la presencia de DNA del VEB en linfocitos de individuos sanos, por lo que la deteccin cualitativa del virus en sangre no permite distinguir entre infeccin crnica y reactivacin. La cuantificacin del DNA se muestra una tcnica ms til. En tejidos la situacin es similar, por ello se utiliza la hibridacin in situ de los EBER en lugar de la amplificacin mediante PCR para detectar las lesiones asociadas al VEB en las muestras de biopsia. Una excepcin significativa a todo esto sera la deteccin cualitativa del DNA del VEB en lquido cefalorraqudeo en pacientes con sida, que es indicativa del linfoma primario del sistema nervioso central y no requiere la confirmacin del diagnstico con biopsia cerebral. La desaparicin del DNA del virus en esta muestra biolgica tras el tratamiento se asocia con una buena evolucin del linfoma. PCR Actualmente, la forma ms comn de determinar la carga vrica del VEB se basa en pruebas de PCR. La PCR cuantitativa en tiempo real, al detectar durante la amplificacin la fluorescencia de los productos de PCR, requiere poca manipulacin y permite el seguimiento de un mayor nmero de pacientes y muestras. Los sistemas Taqman (Applied Biosystems) y de LightCycler (Roche Diagnostics) son los mtodos ms empleados actualmente. Con respecto a la seleccin de la muestra ms adecuada, la utilizacin de sangre total requiere poco volumen de muestra, siendo un argumento de peso para el seguimiento de nios y pacientes graves. Adems, no precisa pasos previos a la extraccin del DNA, que puede utilizarse extrado de parafina. Esta tcnica, es ms sensible que el Southern Blot, permite tipificar la cepa del VEB (Tipo 1 o 2) y detectar la presencia de delecin en el oncogn LMP-1.Aunque ninguna de estas dos tcnicas permite identificar las clulas infectadas por el virus. Los niveles de carga vrica hallados en las clulas de sangre perifrica y en sangre total, son generalmente ms elevados que los hallados en plasma. La carga vrica asociada a las clulas sanguneas puede persistir a elevados niveles, pero no acompaarse con la deteccin en plasma, o detectarse a valores bajos. Esta tcnica de PCR en suero,asume que slo se detectara genoma vrico en los pacientes con una alta carga sistmica de VEB, lo que se correlacionara con la presencia de un proceso linfoproliferativo postrasplante. Dicha tcnica debera de aplicarse con precaucin en los trasplantes peditricos, en los que la prueba podra ser positiva debido a una primoinfeccon por VEB. Otra estrategia sera la deteccin, mediante el mtodo de amplificacin NASBA, de diversos mRNA del VEB (transcritos de los genes EBNA1,LMP1, LMP2, BARF1 y el no codificante EBER1). As, el EBNA 1 aparece en cualquier tipo de linfoma asociado al VEB. El mRNA del LMP2, en los linfomas Hodgkin y en el carcinoma nasofarngeo. Por ltimo, el BARF1 parece estar relacionado con el carcinoma nasofarngeo. Tcnicas inmunohistoqumicas para la deteccin de diferentes protenas virales Existen anticuerpos comerciales para la deteccin de LMP-1, EBNA-1, EBNA-2 . Algunos de estos antgenos se pueden detectar en tejidos procesados de forma rutinaria; estos mtodos permiten identificar a la clula infectada y valorar la expresin de los productos del VEB en la poblacin tumoral. Tabla 10. Tcnicas para la deteccin del VEB

Tcnica H ibridacin In situ Ensayo de clonalidad southern blot del V m EB ediante anlisis por

U tilidad Identificacin de R A EB o D Adel EB en tipos N ER N ER celulares especficos con lesiones histolgicas Evaluacin de la clonalidad de las lesiones con respecto a la estructura del D A del V . D N EB iferenciar la infeccin latente de la replicativa basndose en la estructura del genom a D eteccin de D Aviral en los tejidos N C uantificacin de D A del V en sangre o fluidos N EB corporales paras m onitorizar la enferm edad a lo largo del tiem po (L P1 y 2A EB A1y2) M , N Identificacin de las protenas de expresin del V en EB tipos celulares especficos y con lesiones histolgicas Identificacin de viriones com pletos presentes en la infeccin ltica. N es prctico para uso habitual o M edir la respuesta de anticuerpos a las protenas vricas. Perm distinguir entre infeccin aguda y crnica. ite D eteccin y m edicin sem icuantitativa de los viriones infecciosos. N es prctico para uso rutinario. Prueba o com pleja, laboriosa y de escaso coste -beneficio.

A plificacin del D A del V m N EB C arga vrica del V EB

Inm unohistoqum ica M icroscopa

electrnica

Serologa (anticuerpos frente al V , EB A EA y CA N , heterfilos ) C ultivo de V o de linfocitos B infectados por V EB EB

Tabla 11. Tcnicas moleculares empleadas para la deteccin del VEB Cmo detectar el VEB en un tejido? Qu detecta? Southern blot PCR Hibridacin in situ Inmunohistoqumica Genoma viral (ADN) Genoma viral (ADN) ARN o ADN LMP-1, EBNA-1, ZEBRA, etc. Ventajas Clonalidad Sensibilidad Parafina y cong. Sensibilidad Localizador Localizador Demostracin de funcionalidad Inconvenientes Slo congelacin No localizador No localizador Caro No siempre se detecta expresin