MICROBIOLOGÍA

LABORATORIO N0 4

COLORACIÓN DE GRAM

INTRODUCCIÓN

La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico y con
el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad práctica es indiscutible en el trabajo
microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología. La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo
de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras
clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza
tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera
aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se
visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.

El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como
Gram negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I 2 (yodo) en
equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el yodo, y actúa de mordiente,
haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I 2 entra en
las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.La mezcla de alcohol-
acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo
I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo
hacen.
Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es
un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células
Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. La safranina puede o no
utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las
bacterias Gram negativas. Al término del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram
negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).
OBJETIVOS:

Que el estudiante:

⮚ Adquiera destreza en la técnica de la coloración de Gram.

⮚ Aprenda a diferenciar las bacterias Gram positivas de las Gram negativas

⮚ Interprete los resultados obtenidos en la aplicación de esta técnica.

⮚ Clasifique algunas especies bacterianas en Gram negativas o Gram positivas de acuerdo a la tinción
de Gram.

MATERIALES Y REACTIVOS:

⮚ Cultivos de bacterias Gram (+) y Gram (-).

⮚ Portaobjetos

⮚ Papel absorbente

⮚ Puente de coloración
 ⮚ Mecheros

⮚ Aceite de inmersión

⮚ Cristal violeta

⮚ Lugol

⮚ Safranina

⮚ Alcohol acetona

⮚ Asas

⮚ Microscopio

⮚ Agua destilada

METODOLOGÍA:

1. Extienda y fije la muestra.

2. Cubra el extendido con cristal violeta. Déjelo actuar durante 1 minuto.
3. Lave el exceso de colorante con agua.
4. Cubra el extendido con solución yodada (lugol). Durante 1 minuto. Este actúa como un mordiente.
5. Lave con agua.
6. Decolore con alcohol acetona durante 10 a 15 segundos aproximadamente.
7. Lave con agua.
8. Cubra el extendido con safranina. Déjela actuar durante 1 minuto.
9. Lave con agua, seque al ambiente y observe al microscopio con el objetivo de inmersión.
10. Haga esquemas y describa lo observado.

PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN

Explique:

⮚ ¿Cuáles son las fuentes de error más comunes en la tinción de Gram?

⮚ ¿Cuál es el fundamento de la técnica de Gram

⮚ Porque las bacterias Gram negativas se tiñen de rosado a diferencia de las Gram positivas (morado)
siendo el procedimiento de tinción el mismo?
⮚ Investiga. Además del calor que otros métodos de fijación pueden ser usados para tinciones
diferenciales.
⮚ ¿Cuál es la función del lugol en la técnica anterior?
Bacilos Gram negativas Cocos Gram positivos