COLORACION DIFERENCIAL

Los microorganismos desempeñan un papel fundamental en el planeta, por tal razón los
seres humanos han desarrollado técnicas para su clasificación e identificación. Una de las
técnicas que se emplea universalmente para distinguir a las bacterias en dos grandes
grupos es la Tinción de Gram.

La tinción de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la

visualización de bacterias. Esta técnica fue desarrollada por el bacteriólogo Danés
Christian Gram, en 1884; se utiliza para poder referirse a la morfología celular bacteriana,
considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y
Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.
TINCION DE GRAM

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado

en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Se
utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder
realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose
Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria
Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.

HISTORIA

Hace casi 90 años, el doctor Hans Christian Joachim Gram describió un método de
tinción que le permitía distinguir a las bacterias en cortes de tejidos de mamíferos. Con
otros métodos de tinción, las bacterias resultaban difíciles de visualizar, ya que se teñían
del mismo color de las células, los fragmentos histológicos y la fibrina. Los cortes
histológicos tratados con el colorante de Gram, anilina-violeta de genciana, seguido de
yodo-yoduro de potasio y decolorados a continuación con alcohol para eliminar el
colorante de las células, de los fragmentos histológicos y de la fibrina, sin decolorar las
células, bacterianas, representaba en conjunto un gran avance. Posteriormente, se
demostró que con el método de tinción de Gram ciertas bacterias mantenían el color
azul (grampositivas) mientras que otras eran decoloradas por el tratamiento con alcohol
(gramnegativas). En sabe que existen diferencias estructurales fundamentales entre las
bacterias grampositivas y gramnegativas, aunque los mecanismos exactos de tinción y
decoloración no sean aún totalmente conocidos. Con el tiempo, la técnica de tinción de
Gram ha sido modificada numerosísimas veces, aunque todos los métodos empleados
hoy día se siguen denominando tinción de Gram. La calidad y pureza de los colorantes
ha mejorado considerablemente, y en la actualidad se emplea como colorante primario
el cristal violeta (compuesto químico específico), como contra tinción final se utiliza
usualmente la safranina. Las bacterias Gram positivas pierden esta característica en un
medio acido, que es el que predomina en muchas muestras clínicas. Así pues el
colorante primario debe alcalinizarse, lo cual resulta difícil, ya que las soluciones
alcalinas de cristal violeta son relativamente inestables. El mordiente de yoduro es
también relativamente inestable especialmente si se encuentra en contacto con la luz y
el calor. La eliminación del complejo cristal violeta-yoduro que se halla laxamente
unido a las bacterias y que recibe el nombre de decoloración puede llevarse a cabo
mediante lavado con etanol, una mezcla de etanol y acetona o con acetona. La acetona
por si misma actúa con rapidez excesiva, lo que hace que incluso las bacterias Gram
positivas pueden perder la tinción. El etanol actúa mucho más lentamente y puede no
llegar a decolorar totalmente a las bacterias gramnegativas. En consecuencia se emplea
generalmente una mezcla de etanol y acetona.
METODO

El método más adecuado para practicar una tinción de Gram depende en parte del
microorganismo que se desea teñir, la matriz en que se halla suspendido y los prejuicios
personales del investigador que practica la tinción. Continuamos con la descripción de
la aplicación del método que ha sido útil en la mayoría de los casos.

Técnica

1. Preparar una extensión delgada y uniforme sobre el portaobjetos y dejar secar

sin calentar. En el caso de las muestras obtenidas con gasas o algodones por
frotamiento hay que hacer girar la muestra, apretando firmemente en una
pequeña zona del portaobjetos. Si se trata de líquidos como orina o
cefalorraquídeos se coloca una gota en el centro del portaobjetos y se deja secar
sin extender. Los materiales más densos, como el pus y los esputos, pueden
extenderse uniformemente, evitando sobre todo que queden zonas
excesivamente gruesas.
2. Pasar el portaobjetos por una llama de gas varias veces con el fin de matar las
bacterias y fijarlas a este.
3. Cubrir el portaobjetos con solución de cristal violeta; añadir inmediatamente 2-3
gotas de solución de bicarbonato de sodio y mezclar, inclinando el portaobjetos
o soplando sobre el. Dejar teñir durante 30-60 segundos.
4. Inclinar el portaobjetos para decantar el colorante y cubrir el cristal violeta con
yoduro. Dejar en reposo durante 30-60 segundos.
5. La decoloración constituye el paso mas critico de la técnica. Inclinar el
portaobjeto para decantar la solución de yoduro, y lavarlo con acetona-alcohol,
manteniéndolo en un ángulo de más de 15 grados, hasta que la solución deje
colorearse de azul. No hay que intentar decolorar las zonas mas gruesas de la
extensión, ya que de esta forma se decoloran excesivamente las zonas menos
gruesas, que son precisamente las que podrán ser estudiadas en el microscopio.
6. Lavar inmediatamente el portaobjetos con agua fría corriente para eliminar el
alcohol-acetona, y detener así la decoloración.
7. Cubrir el portaobjetos con safranina; dejar 15-30 segundos y lavar con agua
corriente.
8. Secar con un paño la parte inferior del portaobjetos para eliminar los restos del
colorante; dejar secar al aire.

Limitaciones

La duración de cada paso no es crítica, y puede variar en unos segundos y hasta 5

minutos. De hecho los reactivos pueden aplicarse sucesivamente con tanta rapidez como
permita la manipulación de los colorantes. La decoloración es la fase mas critica. La
tendencia es siempre decolorar excesivamente, lo cual hace que las bacterias
grampositivas parezcan gramnegativas. Hay que lavar el portaobjetos con acetona-
alcohol hasta que deje de colorearse la solución de azul en las zonas menos gruesas. A
continuación hay que lavar el portaobjetos y dejar secar el contenido al aire para
posteriormente estudias en el microscopio. En caso de urgencia, puede secarse con
papel absorbente. Sin embargo, a pesar que se seque de la forma más cuidadosa posible,
siempre se arrastra parte del material.

Aplicaciones
Prácticamente, todas las muestras clínicas deben ser estudiadas en el microscopio, para
determinar la proporción de microorganismos y los elementos celulares presentes. Para
este tipo de preparación, la coloración de Gram constituye la técnica mas adecuada. En
la tinción de Gram se da esta diferencia ya que las de Gram negativas se da esta
diferencia ya que las Gram negativas se decoloran. Si la tinción es buena, los elementos
celulares presentan un color rosado o rojizo (todas las células de los mamíferos son
gramnegativas) y las bacterias se tiñen de color azul oscuro (grampositivas) o rojo
(gramnegativas). Si existen hongos estos son siempre grampositivos. Ciertas bacterias
grampositivas se decoloran con mayor facilidad que otras, especialmente en muestras
clínicas y en cultivos antiguos con medios artificiales. Aunque ciertas bacterias
grampositivas pueden aparecer como gramnegativas, lo contrario no ocurre nunca. En
las muestras clínicas se encuentran con frecuencia artefactos, que puede confundirse con
bacterias lo cual puede conducir a conclusiones erróneas

Fuentes

 Paul D. Hoeprich, M. D. Tratado de enfermedades infecciosas. Tomo I. Pág. 77.

Edición Revolucionaria. La Habana. Cuba. 1982.

COLORACION DE ZIEHL NEELSEN

La tinción de Ziehl-Neelsen en una técnica de coloración para identificar

microorganismos alcohol-ácido resistentes (AAR). El nombre de este procedimiento de
microbiología hace referencia a sus autores: el bacteriólogo Franz Ziehl y el patólogo
Friedrich Neelsen.

Esta técnica es un tipo de coloración diferencial, lo que implica el uso de distintos

colorantes con la finalidad de crear contraste entre las estructuras que se desean
observar, diferenciar y posteriormente identificar. La tinción de Ziehl-Neelsen sirve
para identifica ciertos tipos de microorganismos.

Algunos de estos microorganismos son micobacterias (por ejemplo, Mycobacterium

tuberculosis), nocardias (por ejemplo, Nocardia sp.) y algunos parásitos unicelulares
(por ejemplo, Cryptosporidium parvum). Muchas de las bacterias pueden clasificarse a
través de una técnica común llamada tinción de Gram.

No obstante, algunos grupos bacterianos requieren otros métodos para poder

identificarlos. Técnicas como la tinción de Ziehl-Neelsen requieren combinaciones de
colorantes con calor para fijar el primero a la pared celular.

Luego viene un proceso de decoloración que permite obtener dos resultados: resistencia
o sensibilidad a la decoloración por ácidos y alcoholes.
FUNDAMENTO

El fundamento de esta técnica de tinción se basa en las propiedades de la pared celular

de estos microorganismos. La pared está formada por un tipo de ácidos grasos llamados
ácidos micólicos; estos se caracterizan por presentar cadenas muy largas.

Cuando los ácidos grasos presentan estructuras muy largas, estos pueden retener los
colorantes con mayor facilidad. Algunos géneros de bacterias son muy difíciles de teñir
mediante tinción de Gram, debido al alto contenido de ácidos micólicos de la pared
celular.

En la tinción de Ziehl-Neelsen se utiliza el compuesto fenólico carbol fucsina, un

colorante básico. Este tiene la capacidad de interactuar con los ácidos grasos de la pared
celular, la cual es de textura cerosa a temperatura ambiente.

La tinción con carbol fucsina es mejorada en presencia de calor, debido a que la cera se
derrite y las moléculas de colorante se mueven con mayor rapidez hacia el interior de la
pared celular.

El ácido que se usa posteriormente sirve para decolorar las células que no fueron teñidas
porque su pared no era lo suficientemente afín al colorante; por lo tanto, la fuerza del
decolorante ácido es capaz de eliminar el colorante ácido. Las células que resisten esta
decoloración se llaman ácido-resistentes.

Colorante secundario

Después de la decoloración de la muestra, esta se contrasta con otro colorante llamado

colorante secundario. Generalmente se utiliza el azul de metileno o el verde de
malaquita.

El colorante secundario tiñe el material de fondo y, en consecuencia, crea contraste a las

estructuras que fueron teñidas en el primer paso. Solo las células decoloradas absorben
el segundo colorante (contra-tinción) y toman su color, mientras que las células ácido-
resistentes conservan el color rojo.
Este procedimiento se usa frecuentemente para la identificación de Mycobacterium
tuberculosis y Mycobacterium leprae, las cuales son llamadas bacilos ácido-alcohol
resistentes.

Reactivos

Colorante primario

Se usa carbol fucsina al 0,3 % (filtrado). Este colorante se prepara a partir de una
mezcla de alcoholes: fenol en etanol (90 %) o metanol (95 %), y en esta mezcla se
disuelven 3 gramos de fucsina básica.

Solución decolorante

En este paso se pueden emplear soluciones de ácido alcohol al 3 % o ácido sulfúrico al

25 %.

Colorante secundario (contra-colorante)

El colorante más empleado para realizar el contraste en las muestras suele ser el azul de
metileno al 0,3 %. Sin embargo, también se pueden emplear otros, como el verde
malaquita al 0,5 %.