INSTITUTO DE EDUCACIÓN SUPERIOR DANIEL ALCIDES CARRIÓN

INSTITUTO DE EDUCACIÓN SUPERIOR

DANIEL ALCIDES CARRIÓN

CARRERA DE LABORATORIO CLÍNICO Y

ANATOMÍA PATOLÓGICA

CURSO: Métodos y Técnicas de

Estudio Bacteriológico I

PRÁCTICA #1: Proceso de la Tinción Gram

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Profesor: Tasayco Torres, Josue Enrique

Alumno: Galarza Artica Tony
I. INTRODUCCIÓN

En este informe hare mención sobre las bacterias y la importancia de la tinción

para diferenciar gram-negativa de las gram-positiva, también sobre su
procedimiento y la función de cada sustancia empleada.

II. MARCO TEÓRICO.

TINCION GRAM: Las bacterias son incoloras y se observan con dificultad al

microscopio óptico. Los cocos y los bacilos se pueden identificar por su forma,
agrupación y por la afinidad a los colorantes utilizados en la tinción de Gram.
Las bacterias Gram positivas retienen el color azul violeta y las bacterias Gram
negativas el color rojo pálido. En general la tinción de Gram no es aplicable a
otros microorganismos como protozoos y hongos, exceptuando a las levaduras
que se tiñen como Gram positivas.
Las diferencias de composición de las paredes de las bacterias Gram positivas,
que contienen una gruesa capa de peptidoglucano con numerosos enlaces
cruzados de ácido teicoico, y las paredes de las células gramnegativos, en las que
la capa de peptidoglucano es más delgada, explican las diferencias de la tinción
de Gram entre estos dos grupos principales de bacterias es probable que la gran
cantidad de enlaces cruzados de ácido teicoico de los microorganismos Gram
positivos contribuya a su capacidad de resistir la decoloración con alcohol. Si
bien el colorante de contraste puede ser captado por los microorganismos
Grampositivos, su color violeta no se altera.

III. MATERIALES Y MÉTODOS

a) MATERIALES

 Asa de siembra de aro

 Microscopio óptico
 Mechero de alcohol
 Gradilla
 Agua destilada
 Lamina porta objeto
 Aceite de inmersión
 Cultivo agar manitol salado con crecimiento bacteriano
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 Cultivo agar macconkey con crecimiento bacteriano

 Colorante cristal violeta 2%
 Lugol (yodo)
 Alcohol acetona 50:50
 Safranina 0.25%
 Bandeja de coloración

b) PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Se comenzó esterilizando el Asa de siembra con la llama del mechero, luego se

tomó con la punta del Asa en forma de circulo una gota muy pequeña de agua
destilada, se colocó en la lámina porta objeto, se esterilizo nuevamente el Asa,
para tomar una colonia del agar manitol salado, luego se agregó a la gota que ya
estaba en la lámina, se mezcló suavemente de adentro hacia afuera en forma de
circulo. De igual forma se hizo con la muestra del agar macconkey, luego se
esperó a q ambas muestra secaran, se flamearon 3 veces las láminas y luego
comenzamos con el procedimiento del colorante.

1. Agregamos par de góticas al frotis con cristal violeta y dejamos por 1

minuto. Luego se inclina el portaobjetos ligeramente y se enjuaga
suavemente con agua del grifo o agua destilada.

El colorante cristal violeta es un tinte soluble en agua que ingresa a la capa de

peptidoglicano en la pared celular bacteriana.

2. aplicamos al frotis yodo de Gram y dejamos por 1 minuto. Luego se

inclina el portaobjetos ligeramente y se enjuaga suavemente con agua del
grifo o agua destilada. El frotis quedo de color purpura.

Se agrega una solución de yodo de Gram yodo y yoduro de potasio para

formar un complejo con el cristal violeta, que es mucho más grande y es
insoluble en agua.

3. Decolore el frotis con alcohol etílico al 95% o acetona. Incline el

portaobjetos ligeramente y aplique el alcohol gota a gota hasta que el
alcohol salga casi transparente 5-10 segundos. Enjuague inmediatamente
con agua para evitar una decoloración excesiva.

El decolorante deshidrata la capa de peptidoglicano, encogiéndola y

tensándola. En las bacterias Gram positivas, los complejos de cristal violeta-
yodo grandes no pueden penetrar y escapar de la capa gruesa de
peptidoglicano, lo que da como resultado células teñidas de púrpura. Sin
embargo, en las bacterias Gramnegativas, la membrana externa se degrada,
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la fina capa de peptidoglicano no puede retener los complejos cristal violeta-

yodo y el color se pierde.

4. Agregamos el contratinción de safranina y lo dejamos durante 45

segundos. Luego se inclina el portaobjetos ligeramente y enjuagamos
suavemente.

La safranina es débilmente soluble en agua y tiñe las células bacterianas de un

rojo claro, lo que permite la visualización de las células Gram negativas sin
interferir con la observación del color púrpura de las células Gram positivas.

Por ultimo esperamos que seque el portaobjetos y luego observe el frotis con un
microscopio óptico bajo inmersión en aceite.

CRISTAL LUGOL ALCOHOL SAFRANINA

VIOLETA ACETONA

1.
Aplicación
(colorante
violeta).
PURPURA

IV. RESULTADOS

Se logro observar al microscopio la diferencia de las bacterias. Las bacterias

Gram positivas tienen una apariencia púrpura distintiva cuando se observan al
microscopio después de la tinción de Gram. Esto se debe a la retención de la
tinción violeta cristal púrpura en la capa gruesa de peptidoglicano de la pared
celular. Ejemplos de bacterias Gram positivas incluyen todos los estafilococos,
todos los estreptococos y algunas especies de listeria.
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Las bacterias Gram negativas tienen un color rojizo pálido cuando se observan
con un microscopio óptico después de la tinción de Gram. Esto se debe a que la
estructura de su pared celular no puede retener la tinción de cristal violeta, por
lo que se colorea solo con la contratinción de safranina. Ejemplos de Gram
negativos las bacterias incluyen enterococos, especies de salmonella y especies
de pseudomonas.

Bacterias Gram positiva

Bacterias Gram negativa
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V. Cuestionario

 Colorante: Son sustancias que tienen la capacidad de teñir células,

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estructuras o tejidos; y de acuerdo con su origen, permiten hacer visibles

los objetos microscópicos y transparentes, conocer su forma y tamaño,
así como sus estructuras internas y externas.

 Los mordientes: Intensifican la tinción porque aumentan la

afinidad de la célula por el colorante. También se pueden utilizar para
producir un engrosamiento de ciertas estructuras celulares externas,
como los flagelos, que debido a su delgadez no podrían ser visualizados
de otra forma.

 Tención diferencial: Es cuando el colorante utilizado pone de

manifiesto diferencias entre células bacterianas o entre partes de una
misma célula. Estas técnicas utilizan más de un colorante o bien ciertos
reactivos complementarios para la tinción. Ejemplos: Tinción de
Gram, Tinción de Ziehl-Neelsen, etc.

 Tención Simple: Consiste en la aplicación de un solo colorante a la

muestra, esta debe ser posterior a la fijación de la misma, permitiendo la
visualización de la morfología bacteriana.

 El peptidoglucano (PGN): Es el principal componente de la

pared celular bacteriana. Su metabolismo desempeña un papel central en
la estructura y la forma de la pared, la resistencia a antibióticos y las
interacciones huésped-microorganismo.

 Los ácidos teicoicos: son polímeros de un polialcohol unidos

mediante enlaces fosfodiéster. Estos ácidos se encuentran en la pared
celular de las bacterias Gram-positivas, tales como Staphylococcus,
Streptococcus, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium y Listeria,
extendiéndose sobre la superficie de la capa de peptidoglicano.

 El espacio periplásmico: El espacio periplasmático procariota es

un compartimento subcelular que contiene proteínas esenciales para la
catálisis de los ciclos biogeoquímicos y para la adaptabilidad bacteriana
al medio ambiente. Las bacterias forman uno de los grupos de
organismos más ubicuos y sorprendentes de la biosfera.

 Membrana celular: La membrana plasmática, también llamada

membrana celular, se encuentra en todas las células y separa el interior
de la célula del ambiente exterior. En bacterias y en células de plantas,
hay también una pared celular que se une a la membrana plasmática en
la superficie exterior.
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 El lipopolisacárido (LPS): Se encuentra abundantemente en la

membrana externa de las bacterias gramnegativas y es un potente
estimulador de la respuesta inmunitaria. Al ser la molécula
predominante en la superficie bacteriana también es la de mayor
actividad biológica.

VI. CONCLUSIONES

De este modo se ha podido establecer que la tinción es un procedimiento de

gran utilidad empleado en los laboratorios donde se manejan pruebas
microbiológicas. Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos
colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram
negativas y bacterias Gram positivas.
Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la
pared celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a
cada microorganismo. La pared celular de las bacterias Gram negativas está
constituida por una capa fina de peptidoglicano y una membrana celular
externa, mientras que las bacterias Gram positivas poseen una pared celular
gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular
externa; así pues, la composición química y el contenido de peptidoglicano en la
pared celular de las bacterias Gram negativas y Gram positivas explica y
determina las características tintoriales.

VII. BIBLIOGRAFÍA

 Gram, HC 1884. "Über die isolierte Färbung der Schizomyceten

in Schnitt- und Trockenpräparaten". Fortschritte der Medizin en
alemán. 2: 185-189.