TINCIÓN DE GRAM

PRÁCTICA #4
Carolina Ruiz Cuello, Marcela Nieves Sánchez, Kelly Toro Valencia, Samir Gómez González,
Daniel Cardona Hernández, José Díaz Martínez
Docente: Gabriel Montes Fuentes
Microbiología
Universidad de Córdoba
Facultad de Ingenierías
Ingeniería Ambiental
2022
RESUMEN: En este laboratorio se aprenderá a diferenciar las bacterias en Gram positivas y
Gram negativas, a través de la interpretación de los resultados obtenidos. De esta forma se
clasificarán las especies bacterianas, ya sean gram positivas o gram negativas, según su tinción
de Gram. Se pudo evidenciar que las bacterias gram negativas se tiñen de rosado y las gram
negativas de morado debido a la estructura de las paredes celulares de ambos tipos de bacteria
(Gram positivas y Gram negativas).
Palabras claves: gram positivas, gram negativas, especies bacterianas, pared celular.
1. OBJETIVOS:
 Adquirir destreza en la técnica de la coloración de Gram.
 Aprender a diferenciar las bacterias Gram positivas de las Gram negativas
 Interpretar los resultados obtenidos en la aplicación de esta técnica.
 Clasificar algunas especies bacterianas en Gram negativas o Gram positivas de acuerdo a la
tinción de Gram.
2. INTRODUCCIÓN:
En la década de 1880, en un hospital de Berlín trabajó el médico danés Hans Christian Gram,
quien desarrolló la más importante tinción bacteriológica. Él desarrolló una técnica de tinción en
la cual observaba bacterias en tejidos de pulmones de pacientes que morían de neumonía. El
procedimiento que desarrolló, ahora llamado tinción de Gram, demostró dos categorías generales
de bacterias que causaban neumonía: algunas se teñían de violeta y otras se teñían de rojo.
Las bacterias teñidas de azul fueron conocidas como Gram positivas, y las teñidas de rojo como
Gram negativas. Pero fue hasta 1963 cuando M.R.J. Salton explicó el mecanismo de
diferenciación de la técnica de Gram.
La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio
bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad
práctica es indiscutible en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología.

3. MARCO TEÓRICO:
La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en
microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su
nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto
para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera
aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las
bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de
color rosa o rojo.
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram
positivas como Gram negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto
formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para
solubilizar el yodo, y actúa de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor
intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I2 entra en las células y forma un complejo
insoluble en solución acuosa con el cristal violeta. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega,
sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta.
Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.
Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la
coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas
permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para
hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término
del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si
no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).
La tinción de Gram es un tipo de tinción que se realiza sobre las bacterias para observarlas mejor
bajo el microscopio. Según la distribución del peptidoglicano de la pared celular que las
envuelve, se tiñen de una forma u otra. Así, las bacterias que no se tiñen mediante esta técnica se
denominan Gram negativas. Están formadas por una pared más fina formada por menos capas de
peptidoglicano y una segunda membrana rica en lípidos (que repele la tinción Gram), al
microscopio aparecen incoloras.
Las Gram positivas tienen una pared celular mucho más gruesa, formada por un gran número de
capas de peptidoglicanos entre las que se inserta la tinción Gram, dando un color violeta intenso
al microscopio y se clasifican como Gram +.
La tinción de Gram puede proporcionar información rápida para diagnósticos de infecciones,
puede revelar los agentes causales incluso con una toma de muestra no adecuada. También hace
posible distinguir entre contaminación de la muestra y una verdadera infección. Puede ayudar al
clínico a seguir o cambiar un tratamiento antibiótico inicial antes de los resultados del cultivo, y
en algunos casos, es capaz de mostrar la necesidad de una atención médica urgente. Actualmente
la tinción de Gram sigue siendo un método eficaz e importante en el laboratorio, además de que
es rápido y económico, por lo que se debe estandarizar para evitar errores técnicos o de
interpretación.
4. DATOS OBTENIDOS:
5. MATERIALES Y MÉTODOS:
MATERIALES:
Cultivos de bacterias Gram (+) y Gram (-).
Portaobjetos
Papel absorbente
Puente de coloración
Mecheros
Aceite de inmersión
Cristal violeta
Lugol
Safranina
Alcohol acetona
Asas
 Microscopio
Agua destilada
PROCEDIMIENTO:
1. Extienda y fije la muestra.
2. Cubra el extendido con cristal violeta. Déjelo actuar durante 1 minuto.
3. Lave el exceso de colorante con agua.
4. Cubra el extendido con solución yodada (lugol). Durante 1 minuto. Este actúa como un
mordiente.
5. Lave con agua.
6. Decolore con alcohol acetona durante 10 a 15 segundos aproximadamente.
7. Lave con agua.
8. Cubra el extendido con safranina. Déjela actuar durante 1 minuto.
9. Lave con agua, seque al ambiente y observe al microscopio con el objetivo de inmersión.
6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS:
7. CONCLUSIONES:
8. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS:
A. ¿Cuáles son las fuentes de error más comunes en la tinción de Gram?
R/. La tinción de Gram no solo sirve para bacterias, sino también para algunos hongos y
parásitos; no obstante, esta técnica tiene algunos inconvenientes, como la contaminación con
otros microorganismos y la imposibilidad de visualizar algunas bacterias, entre ellas Legionella
pneumophila, Leptospira spp y Bartonella spp. También se encuentran errores comunes como:
no esterilizar el asa de inoculación, el cristal violeta tiende a formar precipitados lo cual puede
ser causa de observación de estructuras falsas de frotis, el exceso de calor provoca un cambio
físico en la pared celular de las bacterias que puede afectar la retención de colorantes, lavado
muy fuerte de la placa durante la tinción, etc.
B. ¿Cuál es el fundamento de la técnica de Gram?
R/. La coloración de Gram cuenta con 4 pasos fundamentales: tinción, fijación, decoloración y
contratinción.
 Cristal violeta (tinción): de naturaleza básica con afinidad a sustancias cargadas
negativamente como las paredes celulares bacterianas, así se tiñen de morado las bacterias
Gram positivas y Gram negativas inicialmente. Enjuague con agua.
 Lugol (mordiente): aumenta la fijación del cristal violeta sobre la pared celular, creando un
complejo insoluble en agua (no se pierde durante el enjuague con agua). Las bacterias Gram
positivas tienen gran cantidad de ácidos teicoicos tienen gran afinidad por agentes oxidantes
como el Lugol. Enjuague
 Alcohol acetona (disolvente orgánico): este decolora la pared bacteriana al disolver el
complejo cristal violeta-lugol, afectando a las bacterias Gram negativas, pero no a las Gram
positivas (debido a la estructura de la pared de las Gram positivas que es más gruesa
propiciando una barrera a la salida del colorante cristal violeta). Enjuague
 Safranina (contratinción):al ser catiónico tiñe las paredes bacterianas ya que estas tienen
cargas negativas, donde las Gram negativas se tiñen de color rosa, pero las bacterias Gram
positivas no se tiñen porque su pared celular está saturada de cristal violeta impidiendo la
entrada de la safranina.
C. ¿Porque las bacterias Gram negativas se tiñen de rosado a diferencia de las Gram
positivas (morado) siendo el procedimiento de tinción el mismo?
R/. Esta diferencia de tinciones se debe a la estructura de las paredes celulares de ambos tipos de
bacterias. Las bacterias Gram positivas tienen una pared gruesa compuesta de peptidoglucanos y
polímeros, e impermeable, que hace que resista la decoloración. En cambio, las bacterias Gram
negativas tienen una capa delgada de peptidoglucanos más una bicapa de lipoproteínas que se
puede deshacer con la decoloración.
D. Investiga. Además del calor que otros métodos de fijación pueden ser usados para
tinciones diferenciales.
R/. La fijación química se utiliza para proteger las subestructuras celulares finas y la morfología
de los microrganismos más grandes. Los fijadores químicos penetran en la célula y reaccionan
con los componentes celulares, normalmente se unen a proteínas y lípidos para inactivarlos,
insolubilizarlos e inmovilizarlos. Las mezclas comunes de fijadores contienen sustancias como
etanol, ácido acético, cloruro de mercurio, formaldehído y glutaraldehído.
E. ¿Cuál es la función del Lugol en la técnica anterior?
R/. El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el
cual está presente para solubilizar el yodo, y actúa de mordiente, haciendo que el cristal violeta
se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I2 entra en las células y forma
un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
 Rodríguez, P., Arenas, R., & Gea, M. Hans Christian Gram y su tinción Hans Christian
Gram and His Staining. Tomado de: https://www.medigraphic.com/pdfs/cosmetica/dcm-
2018/dcm182n.pdf
 Eva Ormaeche. (2021, March 11). Tinción de Gram. Canal Salud. Tomado de:
https://www.salud.mapfre.es/pruebas-diagnosticas/otras-pruebas-diagnosticas/tincion-de-
gram/
 ‌Antonio, G., & Alejandro Vélez Hoyos. (2012). Tinción de Gram de tejido: alcances y
limitaciones. Medicina y Laboratorio. Tomado de:
https://medicinaylaboratorio.com/index.php/myl/article/view/313#:~:text=La%20tinci
%C3%B3n%20de%20Gram%20no,Leptospira%20spp%20y%20Bartonella%20spp.
 Adrián Contreras Garrido. (2013, May 8). Preparación y tinción de. Tomado de:
https://seramix.blogs.uv.es/2013/05/08/preparacion-y-tincion-de-muestras/
 Mdmadmin. (2020). Nunca olvidemos el fundamento de la coloración de Gram. – MDM
Científica. Tomado de: https://mdmcientifica.com/nunca-olvidemos-el-fundamento-de-la-
coloracion-de-gram/