Ciclo: Laboratorio de Análisis y de Control de Calidad.

Unidad de Trabajo 06: Toxicidad y Mutagenicidad.

Autora: Luisa Martínez Cervantes

1.- Toxicidad ............................................................................................................................... 1

1.1.- Toxinas naturales y principales tóxicos antropogénicos ................................................. 1
1.2.- Evaluación de la toxicidad .............................................................................................. 3
1.3.- Evaluación de la ecotoxicidad de una sustancia ............................................................. 6
2.- Mutagénesis ........................................................................................................................... 7
2.1.- Mutaciones. Tipos ........................................................................................................... 8
2.2.- Evaluación de la mutagenicidad de una sustancia. Test de Ames ................................ 13

1.- Toxicidad

Se puede definir un agente tóxico como:

"Toda sustancia química que, incorporada al organismo vivo a determinada concentración,

produce, en virtud de su estructura química y a través de mecanismos fisicoquímicos y
bioquímicos, alteraciones de la fisicoquímica celular, que pueden ser transitorias o
permanentes, siempre incompatibles con la salud y en algunos casos con la vida."

Símbolo de sustancia tóxica.

1.1.- Toxinas naturales y principales tóxicos antropogénicos

Una toxina es un compuesto con actividad tóxica producido por un ser vivo. Da lugar, en
general, a intoxicaciones agudas de carácter muy grave y de origen alimentario. Algunas de
ellas se encuentran entre los tóxicos más potentes conocidos.

Algunas toxinas naturales pueden tener origen:

 Vegetal: por ejemplo, toxinas fúngicas como las de Amanitas phalloides.

 Animal: por ejemplo, tetrodoxina del pez globo.
 Microorganismos:
o Bacterias: por ejemplo, toxina botulínica.
o Dinoflagelados del plancton marino (mareas rojas) que contaminan moluscos
bivalvos (mejillón, almejas…).
o Hongos filamentosos (mohos) que producen micotoxinas consideradas
contaminantes alimentarios. Muchos de ellos tienen efectos mutagénicos.

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Los principales tóxicos antropogénicos son contaminantes ambientales de origen industrial

y agrícola:

 Productos de uso industrial: bifenilos policlorados (PCBs), ésteres del ácido ftálico
(ftalatos)...
 Productos derivados de la actividad industrial y de procesos de combustión: dioxinas,
hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs)…
 Metales y derivados.
 Plaguicidas organoclorados (DDT, lindano) y organosfosforados (malatión).

PCBs Ftalatos Dioxinas

PAHs Naftaleno Antraceno Benzopireno

Hexaclorociclohexano Dicloro Difenil Tricloroetano Malatión

(Lindano) .

Muchos de ellos forman la gran familia de Contaminantes Orgánicos Persistentes (COPs) y

se introducen en la cadena alimentaria, por lo que el ser humano puede estar expuesto a
través del aire que respira, del agua de bebida y de los alimentos. La mayoría son
mutágenos.

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1.2.- Evaluación de la toxicidad

Deben distinguirse dos tipos de comportamientos de los efectos tóxicos: gradual y cuántico.

Comportamiento tóxico gradual.

El efecto producido por un tóxico aumenta progresivamente con un incremento de la dosis

(concentración de tóxico). Este efecto queda representado en la imagen siguiente: en el eje
horizontal se representa la dosis aplicada, y en el eje vertical, el efecto producido.

Idealmente, la representación se asimilaría a una hipérbole con una asíntota horizontal que
indicaría la dosis (Dm) a partir de la cual el efecto es máximo (Em) y, como tal, ya no
aumenta. Pero, en realidad, la curva experimental que se obtiene se asimila más a una curva
sigmoidea, tal y como se indica en la imagen siguiente.

La explicación de ambos tipos de respuesta reside en el hecho de que los organismos vivos
poseen unos mecanismos de regulación que les permiten amortiguar los efectos de dosis
pequeñas, por lo que la parte inicial de la curva se suaviza, retardando los efectos mayores a
dosis superiores. El comportamiento gradual solo aparece en estudios in vitro de órganos
aislados, tejidos o células, puesto que no disponen por sí mismos de mecanismos de
regulación.

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Comportamiento tóxico cuántico.

A este comportamiento también se lo conoce como el “todo o nada”. Como se puede

deducir, el individuo manifiesta la alteración máxima o no experimenta ningún tipo de
alteración.

Este tipo de comportamiento requiere una representación distinta a la anterior, puesto que la
cuantificación del efecto no es posible: se trata de SÍ o NO, blanco o negro, afectado o no
afectado. Por este motivo, se representa la respuesta (el % de letalidad) de la población al
tóxico en forma de proporción de individuos muertos.

En la gráfica anterior se representa la letalidad acumulada de una población frente a dos

tóxicos distintos. Se puede observar claramente que los efectos del tóxico A son mucho más
devastadores que los del tóxico B, ya que, a igual concentración, la sustancia A puede matar
prácticamente a toda la población, mientras que, en el caso de B, afectaría a un porcentaje
mucho menor.

Las representaciones anteriores permiten determinar algunos parámetros característicos de

un tóxico. Estos se presentan a continuación:

 Dosis letal absoluta (DL100): concentración mínima que asegura la mortalidad total,
es decir, que provoca la muerte de todos los individuos de la población.
 Dosis letal 50 (DL50): concentración que provoca la muerte del 50% de la población.
 Dosis letal mínima (DLm): concentración mínima capaz de provocar la muerte a un
individuo de la población.
 Dosis umbral (DU): concentración que asegura que, por debajo de ella, no provoca
daño de ningún tipo a ningún individuo de la población.

El parámetro más significativo de los anteriores es el DL50, que permite hacerse una idea de
la toxicidad de una sustancia, comparando su valor con la tabla siguiente:

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Toxicidad de una sustancia.

Categoría DL50
Extremadamente tóxico < 1 mg/kg
Altamente tóxico 1-50 mg/kg
Moderadamente tóxico 50-500 mg/kg
Ligeramente tóxico 0,5-5 g/kg
No tóxico 5-15 g/kg

Los parámetros anteriores carecen de validez si se obvia otro parámetro de gran

importancia: el tiempo de exposición. Así pues, en función del periodo de exposición, se
pueden encontrar dos tipos de toxicidad:

Aguda: toxicidad derivada de un tiempo de exposición corto frente a una dosis elevada de la
sustancia.
Crónica: toxicidad consecuencia de una exposición más prolongada ante una dosis pequeña
del tóxico.

La determinación de la DL50 por si sola ha quedado actualmente relegada a valor de

referencia y a una determinación inicial en la obtención de otros parámetros, y ha dado paso
a nuevos parámetros capaces de evaluar de un modo más completo el efecto tóxico de una
sustancia:

 Coeficiente de acción tóxica aguda (CATA): relación entre la dosis letal 50 y la dosis
umbral referente a una exposición aguda.

DL50
CATA =
D U (exposición aguda)

 Coeficiente de acción tóxica crónica (CATC): relación entre la dosis umbral para una
exposición aguda y la dosis umbral referente a una exposición crónica.

D U (exposición aguda)
CATC =
D U (exposición crónica)

Así pues, conociendo el valor de ambos parámetros, se puede clasificar una sustancia según
su potencial tóxico.

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Ejemplo: Cálculo del coeficiente de acción tóxica aguda (CATA) de la sustancia a partir de
la información que se presenta en el gráfico:

Solución:

DL50 3,8 g/Kg

CATA = = = 7,6 potencial tóxico alto
D U (exposición aguda) 0,5 g/Kg

También se utilizan los términos:

 NOEL (NOAEL) es el nivel sin efecto adverso observado, o la dosis más alta que no
produce efecto tóxico.
 LOEL es la mínima dosis efectiva observada en una curva de dosis-respuesta, es
decir, la dosis mínima que produce un efecto.

1.3.- Evaluación de la ecotoxicidad de una sustancia

La ecotoxicología es el estudio del efecto de compuestos químicos tóxicos sobre los seres
vivos, especialmente en cuanto a poblaciones, comunidades y ecosistemas. La
ecotoxicología es un campo multidisciplinario, que integra la toxicología, la ecología y la
química ambiental.

Ensayo de movilidad de Daphnia magna: Se ha comprobado que el invertebrado de la

clase de los crustáceos, Daphnia magna (pulga de agua), resultaba sensible a un amplío
rango de estructuras químicas. Esta característica se ha utilizado para determinar la
concentración inicial de un tóxico, que en el transcurso de cuarenta y ocho horas, como
máximo causa la inmovilización del 50% de la población de Daphnia magna expuesta bajo
unas condiciones determinadas de laboratorio. Según este bioensayo, se considera que una

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sustancia es tóxica si presenta una concentración efectiva media (EC50) inferior o igual a
750 mg/litro.

Ensayo de bioluminiscencia de Photobacterium phosphoreum (Vibrio fischeri): La

bacteria marina, Photobacterium phosphoreum, se caracteriza por su emisión de luz
(bioluminiscencia) y su gran sensibilidad a una amplia variedad de sustancias tóxicas.

La concentración efectiva de muestra que causa una disminución de luz del 50%, conocida
como EC50, se usa como indicador de la medida de toxicidad. Según este bioensayo, se
considera que un producto es tóxico si presenta una EC50 (15°C, 15 min) inferior o igual a
3000 mg/l.

2.- Mutagénesis

La producción de modificaciones genéticas se conoce como mutagénesis. Se generan

mutaciones o cambios en el material genético debidas a un tóxico, que permanecen estables
y se transmiten a las células hijas durante la división celular. A esos tóxicos se los denomina
agentes genotóxicos.

Un agente mutagénico es un compuesto que ejerce su toxicidad sobre el DNA, que es capaz
de alterar su estructura química. Para determinar la capacidad de un compuesto para
interaccionar con el DNA necesitamos modelos experimentales in vitro. La respuesta es
positiva o negativa, pero no hay umbral.

Estos agentes mutagénicos se pueden clasificar en:

 Mutágenos químicos. Son compuestos químicos capaces de alterar las estructuras del
DNA de forma brusca, como por ejemplo el ácido nitroso (agente desaminizante),
bromo y algunos de sus compuestos.
 Mutágenos físicos. Son radiaciones que pueden alterar la secuencia y estructura del
DNA. Son ejemplos la radiación ultravioleta que origina dímeros de pirimidina
(generalmente de timina), y la radiación gamma y la alfa que son ionizantes.
También se consideran agentes físicos los ultrasonidos, con 400000 vibraciones por
segundo, que han inducido mutaciones en Drosophila y en algunas plantas
superiores, y centrifugación, que también producen variaciones cromosómicas
estructurales.
 Mutágenos biológicos. Son aquellos organismos "vivos" que pueden alterar las
secuencias del material genético de su hospedador; como por ejemplo: virus,
bacterias y hongos. Son ejemplo los transposones (fragmentos autónomos de DNA).
 Factores que no son agentes mutágenos. Pero que determinan si una mutación tendrá
lugar o no: temperatura, presión de oxígeno, envejecimiento.
 Mutágenos que resultan de sustancias no tóxicas metabolizadas. Por ejemplo, el
benzopireno es la sustancia resultante del metabolismo del hígado.

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2.1.- Mutaciones. Tipos

La mutación es un cambio estable y transmisible en la estructura del DNA.

Tipos:
 En función del tamaño.
o Génicas o puntuales.
o Cromosómicas.
 En función del efecto.
o Detectables por el fenotipo.
o No detectables por el fenotipo.

2.1.1.- Mutaciones génicas o puntuales

Son cambios que alteran la secuencia de nucleótidos del DNA. Las mutaciones génicas se
detectan en sistemas experimentales si la mutación produce un cambio en el fenotipo. El
ensayo más utilizado es el Test de Ames que se realiza con bacterias de Salmonella
typhimurium. En el proceso de evaluación de la genotoxicidad es de los primeros que se
realiza como screening.

Las mutaciones génicas se pueden clasificar en las siguientes categorías y subcategorías.

 Mutaciones génicas: son modificaciones del material genético pequeñas que afectan
a pocos pares de bases de la cadena. Dentro de las mutaciones génicas se pueden
diferenciar dos clases de alteraciones.
o Sustitución de una base por otra: esta modificación puede dar lugar a
mutaciones de muy distinta gravedad.
 El cambio de la base no afecta al aminoácido que codifica el triplete,
por lo que derivaría en una mutación silenciosa; ya que no afectaría a
la proteína.
 El cambio de la base implica la incorporación de un nuevo aminoácido,
que derivaría en una mutación errónea y su gravedad depende de la
posición relativa del nuevo aminoácido dentro de la proteína.
 El cambio de la base convierte un triplete codificador en un triplete
terminador, por lo que la proteína será más corta y producirá una
mutación sin sentido.
o Desfase: esta clase de modificación consiste en la adición o eliminación de
una base de la cadena, por lo que la pauta de lectura de la cadena se desplaza.
Como consecuencia, los aminoácidos que codificaban la cadena cambian, y
con ellos, la proteína entera.

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Ejemplos:

1.- Si se tiene el siguiente fragmento de DNA que tiene una mutación de sustitución de la
base subrayada por citosina (C).
3'...T-G-A-C-G-G-C-C-A-A-T-G-T-T-T-C-A-T...5'
¿Qué consecuencias tendrá esta mutación?

Solución:

Cuando se transcribe el DNA la secuencia en el RNA mensajero será:

Sin mutación: 5' ACU-GCC-GGU-UAC-AAA-GUA 3'
Con mutación: 5' ACU-GCC-GGU-UAG-AAA-GUA 3'
Cuando el RNA mensajero se traduzca en los ribosomas, el triplete original que era UAC y
codificaba el aminoácido tirosina, será, con la mutación, el triplete UAG que es un triplete
stop, por lo que terminará la traducción y la proteína será más corta, la mutación tendrá un
efecto grave.

2.- Si se tiene el siguiente fragmento de DNA que tiene una eliminación de la base
subrayada
3'...T-G-A-C-G-G-C-C-A-A-T-G-T-T-T-C-A-T...5'
¿Qué consecuencias tendrá esta mutación?

Solución:

La mutación varía la proteína, puesto que a partir de la base eliminada, el patrón de lectura
de los tripletes a lo largo de la proteína cambia, con lo que varían todos los tripletes
siguientes.

3.- Si se tiene el siguiente fragmento de DNA que tiene una mutación de sustitución de la
base subrayada por guanina (G).
3'...T-G-A-C-G-G-C-C-A-A-T-G-T-T-T-C-A-T...5'
¿Qué consecuencias tendrá esta mutación?

Solución:

Cuando se transcribe el DNA la secuencia en el RNA mensajero será:

Sin mutación: 5' ACU-GCC-GGU-UAC-AAA-GUA 3'
Con mutación: 5' ACU-CCC-GGU-UAC-AAA-GUA 3'
Cuando el RNA mensajero se traduzca en los ribosomas, el triplete original que era GCC y
codificaba el aminoácido alanina, será, con la mutación, el triplete CCC que codifica el
aminoácido prolina. Las consecuencias de este hecho dependen de la posición relativa del
nuevo aminoácido dentro de la proteína.
CCU, CCC, CCA, CCG codifican prolina
GCU, GCC, GCA, GCG codifican alanina

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4.- Si se tiene el siguiente fragmento de DNA que tiene una mutación de sustitución de la
base subrayada por citosina (C).
3'...T-G-A-C-G-G-C-C-A-A-T-G-T-T-T-C-A-T...5'
¿Qué consecuencias tendrá esta mutación?

Solución:

Cuando se transcribe el DNA la secuencia en el RNA mensajero será:

Sin mutación: 5' ACU-GCC-GGU-UAC-AAA-GUA 3'
Con mutación: 5' ACU-GCC-GGU-UAC-AAG-GUA 3'
Cuando el RNA mensajero se traduzca en los ribosomas, el triplete original que era AAA y
codificaba el aminoácido lisina, será, con la mutación, el triplete AAG que codifica el
mismo aminoácido. La mutación no tiene consecuencias visibles en la cadena polipeptídica.
AAA  lisina
AAG  lisina

5.- Dadas las dos secuencias de DNA mostradas, realizar el alineamiento entre ellas (con la
misma notación del programa Blast) e indicar las coincidencias y huecos entre las dos
secuencias, así como las posibles causas de las diferencias entre ellas.

Buscada 1 AAGCGTTAAAGGTCCCCTAGCTCCAAAAAGTTTCCAGCCTAGCTAGCTG 49
Encontrada 40 AAGCCTTAAGGTCCCCTTAGCTCCAATAAGTTTCCAGCTAGCTACCTG 87

Solución:

Buscada 1 AAGCGTTAAAGGTCCCCT-AGCTCCAAAAAGTTTCCAGCCTAGCTAGCTG 49
|||| |||| |||||||| |||||||| ||||||||||| |||||| |||
Encontrada 40 AAGCCTTAA-GGTCCCCTTAGCTCCAATAAGTTTCCAGC-TAGCTACCTG 87

Coincidencias: 44/50 (88%)

Huecos: 3/50 (6%)

 En la secuencia buscada en la posición 5 hay guanina y en la secuencia encontrada en

la posición 45 hay citosina. Se puede deber a una mutación de sustitución a partir de
un ancestro común.
 En la secuencia buscada en la posición 10 hay adenina y en la secuencia encontrada
entre la posición 49 y la 50 hay un hueco. Se puede deber a una mutación de
eliminación a partir de un ancestro común.
 En la secuencia buscada entre la posición 18 y 19 hay un hueco y en la secuencia
encontrada en la posición 58 hay timina. Se puede deber a una mutación de
eliminación a partir de un ancestro común.
 En la secuencia buscada en la posición 27 hay adenina y en la secuencia encontrada
en la posición 67 hay timina. Se puede deber a una mutación de sustitución a partir
de un ancestro común.

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 En la secuencia buscada en la posición 39 hay citosina y en la secuencia encontrada

entre la posición 77 y la 78 hay un hueco. Se puede deber a una mutación de
eliminación a partir de un ancestro común.
 En la secuencia buscada en la posición 46 hay guanina y en la secuencia encontrada
en la posición 84 hay citosina. Se puede deber a una mutación de sustitución a partir
de un ancestro común.

2.1.2.- Mutaciones cromosómicas

Son modificaciones que afectan a un fragmento grande de la cadena genética o, incluso,

cromosomas enteros. Son alteraciones en el número o en la estructura de los cromosomas.
Se deben a errores durante la gametogénesis (formación de los gametos por meiosis) o de
las primeras divisiones del cigoto. Son de gran tamaño, irreversibles y se detectan en
ensayos citogenéticos, que permiten obtener un cariotipo, es decir las parejas de
cromosomas de una célula ordenadas por tamaño y estructura.

 Mutaciones numéricas. Estas anomalías se denominan también mutaciones

genómicas, ya que varía el número de cromosomas del genoma. El caso más común
es la aneuploidía, que se produce cuando un individuo presenta accidentalmente
algún cromosoma de más o de menos en relación con su condición diploide. Se
denominan monosomías, cuando en lugar de dos cromosomas homólogos solo hay
uno, y trisomías, cuando en lugar de dos hay tres cromosomas homólogos. Ejemplo:
Trisomía del cromosoma 21, más conocida como Síndrome de Down.

 Mutaciones estructurales. Son los cambios en posición o presencia de fragmentos

cromosómicos, se originan por la rotura de los cromosomas y recomposición de los
segmentos resultantes. Cuando se rompe un cromosoma aparecen dos extremos
adherentes o "pegajosos" inestables que se unen rápidamente con otro extremo,
puede ser el original u otro. Pueden afectar uno, dos o más cromosomas. El índice de
roturas cromosómicas aumenta por radiaciones ionizantes, agentes mutágenos,
predisposición y virus. Se producen en 1 de cada 1000 gametos.

 Deleción. Es un tipo especial de anomalía estructural cromosómica que consiste

en la pérdida de un fragmento de DNA de un cromosoma.

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 Duplicación. Es el aumento del número de copias de un fragmento de DNA.

Generalmente no presentan efectos, aunque si la región duplicada contiene
reguladores de la división celular pueden causar neoplasias.

 Inversión. Se producen por la inversión de 180º del segmento que queda entre las
dos roturas de un cromosoma. Generalmente no producen anomalías clínicas,
aunque están relacionadas con un elevado riesgo de producir descendencia con
una alteración cromosómica importante.

 Traslocación. Se producen por la ruptura de dos cromosomas no homólogos que

intercambian fragmentos entre si, de manera que los genes que originalmente
estaban en un cromosoma pasan al otro cromosoma. Generalmente esto determina
una expresión alterada de los genes en la región traslocada y determina el
desarrollo de enfermedades neoplásicas como algunos tipos de leucemia.

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Las deleciones y duplicaciones pueden modificar grandes segmentos del cromosoma. Las
inversiones y traslocaciones dan lugar a una pequeña o ninguna pérdida de información
genética.

2.2.- Evaluación de la mutagenicidad de una sustancia. Test de Ames

Una posible consecuencia de una mutación es que la sustancia tenga, además de efecto
mutagénico, un carácter cancerígeno. Es cierto que no todos los compuestos mutagénicos
son cancerígenos, pero se ha encontrado una gran relación entre ambos, por lo que un
compuesto mutagénico probablemente es cancerígeno.

El test consiste en comprobar si unos microorganismos sufren una mutación de retroceso al

estar en contacto con la sustancia "sospechosa". De ser así, la sustancia sería catalogada de
mutagénica y, por lo tanto, sería motivo de estudios posteriores sobre su capacidad
cancerígena, puesto que el 90% de las sustancias que dan positivo en el test de Ames
resultan, posteriormente, ser cancerígenas.

Los microorganismos más utilizados en esta prueba son cepas mutantes de Salmonella
typhimurium, que requiere histidina, ya que no puede sintetizar este aminoácido. El medio
en que se cultivan dichos organismos no contiene histidina, por lo que solo podrán crecer las
células que retrocedan o reviertan (sufran una nueva mutación, esta vez de retroceso) a su
estado natural, en el que no requieren histidina.

Así pues, se siembran células de la cepa en el medio correspondiente (no contiene histidina).
Unas tratadas con la sustancia "sospechosa" y otras no (control). Las células control
sembradas, no deberían crecer ya que carecen del agente genotóxico, sin embargo, se puede
observar crecimiento. Este hecho viene justificado por la mutación espontánea que, por
probabilidad, siempre puede darse.

El medio en el que se cultivan posee una pequeña cantidad de histidina que permite a las
bacterias crecer por un tiempo inicial y tener la oportunidad de mutar. Cuando la histidina se
agota, solo las bacterias que hayan mutado para obtener la capacidad de producir su propia
histidina van a sobrevivir y multiplicarse.

Según el test de Ames una sustancia, natural o sintética, se considera mutagénica cuando el
coeficiente de reversión, C.R., es mayor que 2.

Nº colonias revertientes por placa ensayada

C.R. =
Nº colonias revertientes por placa control - espontáneas -

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