Ensayos Biotecnológicos.

Modalidad e-learning

DETERMINACIÓN DE LA TOXICIDAD AGUDA, EC50

Con esta tarea se conseguirá determinar la acción tóxica aguda de una sustancia química sobre el
crustáceo marino, Dafnia magna, a partir de un supuesto práctico. Se trata de un bioensayo para
determinar la ecotoxicidad de una sustancia química. La sustancia química en estudio será la
cafeína.

FUNDAMENTO

Cuando se realiza una experimentación de este tipo se selecciona un número de individuos de

experimentación y se colocan en un medio con una concentración determinada de la sustancia
analizada, se obtiene el valor EC50 (concentración efectiva media). EC50 es la concentración de la
sustancia estudiada, que en un periodo de tiempo definido (24-48 horas), inmoviliza al 50% de la
población, en este caso, de Dafnia magna.
Cuando se planea un bioensayo se debe tener en cuenta que no se puede evaluar una única
concentración, sino que debe probarse un grupo de ellas en forma de progresión geométrica.
Un método para determinar la EC50 consiste en transformar los resultados obtenidos (% de
mortalidad) a unidades Probit. Probit son unidades de desviación estándar incrementadas en cinco
con la finalidad de evitar el uso de números negativos. En la representación del % de mortalidad
frente a la concentración de la sustancia ensayada se obtiene una gráfica sigmoidea. En la
representación de los valores Probit frente al logaritmo de la concentración de la sustancia ensayada
se obtiene una recta, cuya ecuación permite obtener el valor de EC50 (valor Probit 5).

PROCEDIMIENTO

Obtención de Dafnia magna a partir de los huevos

1. Se ponen a eclosionar huevos de Dafnia magna en agua de crianza
(agua salada).

Ensayo
2. Se prepara una disolución de cafeína de 10 mg/ml utilizando como disolvente agua de crianza.
3. Se preparan 50 ml de disoluciones conteniendo distintas concentraciones de cafeína con agua
de crianza (concentraciones en progresión geométrica: 0'01, 0'02, 0'04, 0'08, 0'16, 0'32, 0'64,
1'28 mg/ml).
4. Se dividen las disoluciones anteriores en dos alícuotas de 25 ml cada una de ellas.
5. Se preparan dos recipientes de control que contengan solo 25 ml de agua de crianza.

Elaborado por Luisa Martínez Cervantes Página 1

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6. Al tercer día de haber puesto a eclosionar los huevos de Dafnia

magna, se añaden unos diez individuos a cada uno de los
recipientes del ensayo. Durante esos 3 días y mientras dura el
ensayo no se les proporciona ningún alimento.

7. Se realiza el recuento de organismos vivos y muertos, en los dos replicados del control y de
cada una de las concentraciones ensayadas, a las 24 y 48 horas. Se agita suavemente el
recipiente para comprobar la movilidad. Si no se desplazan se consideran inmovilizadas,
aunque muevan las aletas.

Foto de Dafnia magna al microscopio:

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ESQUEMA DEL PROCEDIMIENTO

DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS

Organismos inoculados
[cafeína] (mg/ml) Replicado 1 Replicado 2 Total
0,00 12 10 22
0,01 12 12 24
0,02 11 11 22
0,04 11 9 20
0,08 11 10 21
0,16 13 10 23
0,32 12 10 22
0,64 10 12 22
1,28 12 8 20

Solo se realizará el recuento a las 48 horas.

Organismos vivos tras 48 horas de exposición

[cafeína] (mg/ml) Replicado 1 Replicado 2 Total
0,00 12 10 22
0,01 11 12 23
0,02 11 10 21
0,04 9 8 17
0,08 8 8 16

Elaborado por Luisa Martínez Cervantes Página 3

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0,16 8 6 14
0,32 5 3 8
0,64 1 2 3
1,28 0 0 0

RESULTADOS

1. Valor de la toxicidad aguda de la cafeína para Dafnia magna, como el parámetro EC50 a las
48 horas.

Para hallar EC50, se debe transformar el % de mortalidad en valores Probit para cada concentración.
Para ello consultar la tabla que aparece en la NTP 291 publicada por el INSHT. En la siguiente
dirección se puede obtener dicha tabla:
http://www.insht.es/InshtWeb/Contenidos/Documentacion/FichasTecnicas/NTP/Ficheros/201a300/
ntp_291.pdf
Para comparar los EC50 con valores publicados, consultar la Ficha de datos de Seguridad de la
cafeína, de la marca comercial de reactivos químicos Sigma-Aldrich-Merck (sección 12).

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