Manual LAII2022 2

LABORATORIO DE
ALIMENTOS II
SEMESTRE 21-2
ACATZI SILVA ABRAHAM ITZCÓATL
AGUILAR NAVARRO JEANETTE ADRIANA
BEAZ RIVERA JESÚS ANTONIO
GARCÍA SATURNINO VERÓNICA
GÓMEZ SIERRA TANIA
GONZÁLEZ OSNAYA LILIANA
LUCAS FLORENTINO BERNARDO
SÁNCHEZ CHINCHILLAS ARGELIA
ÍNDICE
Página
UNIDAD 1. AGENTES TÓXICOS EN ALIMENTOS
Cuestionario general 1
1.1 Determinación de la dosis letal media de cafeína en ratones por vía oral 2
1.2 Determinación semicuantitativa de lectinas en leguminosas y derivados 12
1.3 Determinación de metanol en bebidas alcohólicas 19
1.4 Determinación de malatión residual en alimentos de origen vegetal 26
UNIDAD 2. ALIMENTOS FUNCIONALES

2.1 Determinación del contenido de polifenoles en alimentos 34
2.2.Efecto de la temperatura y tiempo sobre el contenido de antocianinas 40
UNIDAD 3. VIDA DE ANAQUEL Y PRUEBAS ACELERADAS

3.1 Evaluación de la vida de anaquel y pruebas aceleradas 46
Anexo 1. Metodologías
I. Evaluación sensorial del color. Uso de la guía de color: Pantone. 56
II. Determinación de humedad 57
III. Extracción de grasa por lotes 58
IV. Determinación del índice de Kreiss 59
V. Determinación del índice de p-anisidina 61
VI. Determinación del contenido de ácido ascórbico en alimentos 63
VII. Acidez titulable en leche en polvo 65
VIII. Determinación de la Relación de Proteína Neta (RPN) 66
UNIDAD 4. ADITIVOS ALIMENTARIOS

4.1 80
Efecto del pH y la temperatura en colorantes naturales
4.1.1 Determinación espectrofotométrica de clorofila 82
4.1.2 Medición instrumental de la intensidad de color 87
4.2 Determinación de benzoatos en productos alimenticios 95
UNIDAD 5. APLICACIÓN DE ADITIVOS ALIMENTARIOS

5.1 Efecto de agentes emulsificantes y estabilizantes sobre las características 102
reológicas
y sensoriales de un producto alimenticio
5.2 Efecto de agentes gelificantes sobre la textura de un producto alimenticio 112
CUESTIONARIO GENERAL UNIDADES I Y II
1. Definir agente xenobiótico, factor tóxico y factor antinutrimental e indicar dos ejemplos de
cada uno de ellos.
2. Indicar dos factores tóxicos encontrados en los alimentos por contaminación accidental,
generados durante el procesamiento y de origen natural.
3. Investigar el significado de los siguientes términos: Nivel más bajo de ingesta en que se
observan efectos adversos y Nivel más alto donde no se observan efectos adversos
(LOAEL y NOAEL por sus siglas en inglés) y para qué se utilizan en estudios toxicológicos.
4. Definir Ingesta Diaria Admisible (IDA) y Límite Máximo Residual (LMR) e indicar la
información toxicológica necesaria para establecer cada uno de ellos.
5. Investigar las diferencias en las reacciones de biotransformación, bioactivación,
bioeliminación y metabolismo.
1
1.1 DETERMINACIÓN DE LA DOSIS LETAL MEDIA DE CAFEÍNA EN RATONES POR VÍA
ORAL
Introducción
La acción de un agente xenobiótico sobre un organismo puede producir una alteración en el estado
fisiológico o de la salud. De esta manera, una intoxicación se define como una enfermedad, y como
tal, su evolución está en función del tiempo, por lo que se clasifica en:
 Toxicidad aguda: implica una administración del agente xenobiótico en un período de 24
horas como máximo.
 Toxicidad subaguda (corto plazo): se realizan varias administraciones del agente
xenobiótico en un período de aproximadamente el 10% de la vida del animal de prueba.
 Toxicidad crónica (largo plazo): se llevan a cabo administraciones en un período de tiempo
que corresponde a toda la vida de los animales de prueba o una fracción importante de
ella.
Para realizar un estudio de toxicidad aguda de un agente xenobiótico es necesario definir varios
factores, entre los cuales destacan:
 Selección del organismo apropiado para la prueba, por ejemplo: especie, sexo, edad y
peso.
 Dosis. Es la cantidad de agente xenobiótico (expresada en µg, mg o g dependiendo de su
toxicidad) que se administra al organismo en estudio con base a su peso corporal (kg).
 Tipo de dosis: única o repetitiva.Para dosis repetitivas deberán administrarse en un lapso
no mayor a 24 horas después de haberse administrado la primera dosis.
 Dosificación. Es el volumen a administrar de la dosis en relación al peso corporal del
organismo seleccionado. Para roedores, la dosificación utilizada es en el rango de 1D (0.01
mL/g de peso corporal) a 5D (0.05 mL/g de peso corporal. Se recomienda emplear una
dosificación intermedia, es decir, 3D (3D= 0.03 mL/g).
 Vía de administración. Es la forma por la cual el agente xenobiótico entrará en contacto
con el organismo de prueba. Se considera importante ya que de ésta dependerá la
velocidad de absorción y el número de barreras biológicas que debe atravesar el agente
xenobiótico para ejercer su efecto biológico. Algunos ejemplos son: oral, intraperitoneal,
intravenosa, cutánea, sublingual.
 Tipo de respuesta a evaluar. Se establece con base al objetivo del estudio. Si se determina
la dosis letal de un agente xenobiótico la respuesta a observar será la muerte.
La dosis letal media de un agente xenobiótico (DL50) se expresa como la cantidad de agente
xenobiótico/ kg de peso corporal necesaria para provocar la muerte al 50% de los animales en
2
estudio. Cuando se traza la relación “dosis-efecto” se observa que el 50% es donde a la menor
variación de la dosis se presenta una mayor variación en el efecto. Por esta razón, la DL 50 es la
que puede determinarse con mayor precisión por lo que se adopta este valor como el más
representativo para expresar la toxicidad aguda de un agente xenobiótico. La evaluación de la
respuesta “dosis-efecto” puede ser calculada por el método estadístico de Litchfield y Wilcoxon.
En la Tabla 1 se presentan valores de la DL50 de diferentes sustancias, mientras que en la Tabla 2

se muestra la clasificación de las sustancias de acuerdo a su toxicidad en ratones después de ser
administrados con una dosis única de la sustancia.
Tabla 1. Dosis letal media de algunos agentes xenobióticos

Agente Especie DL50 (mg/kg de peso corporal,
vía oral)
Etanol Ratón 10,000
Cloruro de sodio Ratón 4,000
Sulfato ferroso Rata 1,500
Sulfato de morfina Rata 900
Dicloro-difenil-tricloroetano (DDT) Rata 100
Picrotoxina Rata 5
Sulfato de estricnina Rata 2
Nicotina Rata 1
Tetradotoxina Rata 0.1
Dioxina Conejillo de Indias 0.001
Toxina botulínica Rata 0.00001
3
Tabla 2. Clasificación de los agentes xenobióticos de acuerdo a su dosis letal media (ratón,
vía oral)
Categoría DL50
Súper tóxico <5 mg/kg
Extremadamente tóxico 5–50 mg/kg
Altamente tóxico 50–500 mg/kg
Moderadamente tóxico 0.5–5 g/kg
Ligeramente tóxico 5–15 g/kg
Prácticamente no tóxico >15 g/kg
Cuestionario previo
1. ¿De qué factores depende la variabilidad intraespecie?
2. ¿Qué características debe tener la sustancia utilizada como vehículo en un estudio de
toxicidad? Dé un ejemplo de un vehículo que utilizaría para evaluar la toxicidad aguda de
un agente xenobiótico liposoluble.
3. Explicar el mecanismo de acción de la cafeína en humanos.
4. Investigar el valor de la DL50 teórico de la cafeína para ratones macho por vía oral y vía
intraperitoneal y discutir las posibles causas por las cuales los valores son distintos.
Objetivo
Determinar la dosis letal media de la cafeína por vía oral en ratones empleando el método
estadístico de Litchfield y Wilcoxon, para que el estudiante relacione dicho parámetro con el grado
de toxicidad de una sustancia y se familiarice con el procedimiento para la realización de un
estudio de toxicidad aguda.
Material
 Espátula 1
 Jaula de acrílico con tapa y bebedero 6
 Jeringa de insulina de 1 mL 5
 Matraz volúmetrico cap. 10 mL 5
 Sonda para administración esofágica 5
 Vaso de precipitados cap. 25 mL 5
Reactivos
 Cafeína R.A.
4
Equipo
 Balanza analítica
 Balanza granataria para animales de laboratorio
Organismo de Prueba
 25 Ratones del mismo sexo y cepa de 25 ± 5 g de peso corporal
Preparación de reactivos
Preparar 10 mL de cada una de las dosis a evaluar (75, 150, 225, 300 y 375 mg cafeína/kg de
peso corporal) con agua destilada a 70 °C y esperar a que la temperatura descienda hasta 25 °C.
Procedimiento
1. Utilizar ratones con un periodo de ayuno de 12 horas (retirar sólo el alimento).
2. El día del estudio acomodar a los ratones en los diferentes lotes de acuerdo a la
distribución denominada “culebra japonesa”; la cual se describe a continuación:
a. Pesar al azar y marcar los ratones (el marcado se hace en la base de la cola por
medio de rayas de diferentes colores). Registrar el número de ratón y su peso
correspondiente.
b. Ordenar los pesos de forma ascendente o descendente:
P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9…Pn
c. Construir una tabla en la que el número de columnas corresponde al número de
dosis. Acomodar los pesos de los ratones de manera horizontal, simulando el
movimiento de una culebra, como se ejemplifica a continuación:
Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3 Dosis n

P1 P2 P3 P4
P8 P7 P6 P5
P9 P10 P11 P12
P16 P15 P14 P13
P17 P18 P19 P20
d. Calcular el promedio del peso de los ratones para cada lote. Si la diferencia entre
los promedios es mayor a 1 gramo, cambiar los ratones con valores extremos de
peso por otros y rehacer la culebra japonesa.
3. Colocar los ratones de cada dosis en jaulas por separado y etiquetar cada una con la dosis
respectiva.
5
4. Determinar el volumen a administrar, multiplicando el peso del ratón por la dosificación a
utilizar: 3D.
5. Para realizar la administración vía oral, seguir los siguientes pasos (ver Figura 1):
a) Sujetar al ratón de la base de la cola y colocarlo en la rejilla de la caja.
b) Sostener la cola con el dedo pulgar e índice de la mano derecha jalando
ligeramente hacia atrás, posteriormente con la mano izquierda, sujetar la piel
detrás de las orejas con los dedos pulgar e índice.
c) Pasar la cola a la mano izquierda que sujeta el ratón y sostenerla con el dedo
meñique (verificar que el ratón esté sujeto firmemente).
d) Con la mano derecha introducir la sonda a la parte posterior de la faringe a través
del esófago y administrar el agente xenobiótico lentamente con la jeringa.
e) Una vez que se ha administrado al ratón, retirar la sonda con cuidado para no
lastimar al animal y colocarlo en la jaula correspondiente.
Figura 1. Pasos para la administración por vía oral en ratón

Adaptado de: Suckow, et al., 2001, Donovan y Brown, 2006.
6. Restituir el alimento y agua. Mantener a los ratones en observación durante 48 horas

máximo. Registrar el número de muertes observadas en cada uno de los lotes en el
siguiente formato.
Dosis (mg/kg p.c.) Animales tratados Animales muertos
75
150
225
6
300
375
Durante la administración del xenobiótico, el periodo de observación y al término del

bioensayo colocar los cadáveres dentro del congelador ubicado en el Bioterio. Los
animales vivos serán entregados al encargado del Bioterio para su eutanasia.
Guardar los desechos del agente xenobiótico en un frasco debidamente etiquetado
para su posterior tratamiento.
7. Con los resultados obtenidos calcular la DL50 de la cafeína empleando el método

estadístico de Litchfield y Wilcoxon. Es importante mencionar que para realizar el análisis
estadístico se debe contar con al menos tres porcentajes de mortalidad (uno de ellos
puede ser el 0 o el 100% de mortalidad).
Análisis estadístico
El método estadístico de Litchfield y Wilcoxon se describe a continuación:
1. Calcular el porcentaje de mortalidad observado para cada dosis, para ello considerar como
100% el número de ratones tratados en cada lote.
2. Localizar los porcentajes de mortalidad observados para las dosis estudiadas en el papel
log-probit (ver hoja log-probit al final de éste protocolo) y omitir los valores para el 0 y 100%
de mortalidad (ya que en la escala no existe el 0 y 100% de mortalidad).
3. Corregir el 0 y 100% de mortalidad con las fórmulas propuestas por Miller y Tainter y
considerar dichos porcentajes como el valor observado.
Para 0% de mortalidad: 100 (0.25/n)
Para 100% de mortalidad: 100[(n-0.25)/n]
En donde n es el número de ratones en los lotes en donde se observó el 0 y el 100% de

mortalidad, respectivamente.
4. En el papel log-probit, trazar una línea recta que pase lo más cercano posible a todos los
puntos y obtener el porcentaje de mortalidad esperado, interpolando los datos para cada
dosis a la recta trazada.
5. Hacer la prueba de CHI2 con los valores de mortalidad esperados y observados de las
dosis probadas:
7
 n (%observado  % esperado ) i2 
(CHI ) = 
2 
 i 1
(%esperado )(100  % esperado ) 

N 
 K 
Donde:
N = número de ratones tratados
K = número de dosis analizadas
Comparar la CHI2 de la línea trazada con la CHI2 crítica (obtenida de una tabla con g. l.=
K–2 y p= 0.05). Si la CHI2 experimental es menor a la CHI2 crítica, los datos son
homogéneos y la recta se considera adecuada. En caso contrario, es necesario volver a
trazar la recta y realizar nuevamente los cálculos hasta obtener datos homogéneos.
6. De la recta correspondiente interpolar los valores de la DL 50, DL16 y DL84 y calcular la
pendiente (S) de acuerdo a la siguiente fórmula:
( DL84 DL50 )  ( DL50 DL16 )

S
2
7. Para determinar los límites de confianza para la DL50 con una p= 0.05, es necesario
obtener el siguiente factor (f):
2.77
fDL50  S N'
Donde:
f = factor para obtener el intervalo de confianza
N’ = número de ratones tratados entre 16 y 84% de respuesta esperada
S = función pendiente
Límite superior= DL50 x fDL50
Límite inferior= DL50 / fDL50
Reporte de resultados
a) Incluir la gráfica y los cálculos realizados para el análisis estadístico, así como la dosis letal
media con su intervalo de confianza expresada en mg/kg peso corporal y el cuestionario
final que se anexa.
b) Comparar el valor de la DL50 obtenido con el valor de la DL50 teórico para ratones por
vía oral reportado en la literatura y explicar a qué se debe la diferencia (si existe)
entre los valores.
c) Clasificar a la cafeína de acuerdo a su grado de toxicidad aguda, considerando la dosis
letal media obtenida.
8
HOJA Log-probit para el cálculo de la dosis letal media
9
Referencias
Desphande, S. Handbook of Food Toxicology; Marcel Dekker: New York, 2002.

Donovan, J., Brown, P. Handling and Restraint. In: Current Protocols in Inmunology; John Wiley &
Sons: Hoboken, New Jersey, 2006.
Klaasen, C., Watkins III, J. Manual de toxicología, Casarett and Doull; 5ª.Ed. McGraw-Hill
Interamericana: México, 2001.
Litchfield, J., Wilcoxon F. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1949, 96,99-113.
http://www2.humboldt.edu/geology/for_download/graphpaper/2_cycle_log_probability_bw.pdf
10
DIAGRAMA ECOLÓGICO
DETERMINACIÓN DE LA DOSIS LETAL MEDIA DE CAFEÍNA EN RATONES
Elaboración de “culebra japonesa” para la

distribución de lotes
Calcular el volumen a administrar de las

dosis de cafeína
Administrar por vía oral la dosis de Dosis de cafeína

cafeína correspondiente
Restituir alimento y agua

R1
Mantener a los ratones en
R3 observación por 48 h
Registrar el número de animales

muertos por lote y calcular la DL50
R2
Tratamiento:
R1: Con base en su relación costo-beneficio recuperar la cafeína por evaporación o desechar en el
drenaje con abundante agua.
R2: Entregar los animales al encargado del Bioterio para su eutanasia en cámara de CO2 y manejo
de los cadáveres de acuerdo a la NOM-062-ZOO-1999.
11
1.2 DETERMINACIÓN SEMICUANTITATIVA DE LECTINAS
EN LEGUMINOSAS Y DERIVADOS
Cuestionario previo
1. ¿Qué son las lectinas? Discutir si son factores tóxicos o antinutrimentales con base en su
mecanismo de acción.
2. ¿A qué se debe la especificidad de las lectinas?
3. Explicar en qué consiste la sensibilización de los eritrocitos.
Objetivo
Determinar el efecto de distintos tratamientos térmicos sobre la capacidad aglutinante de las
lectinas presentes en leguminosas mediante una técnica semicuantitativa, para que el estudiante
comprenda la importancia de un tratamiento térmico adecuado en la disminución de este tipo de
factores en los alimentos.
Muestras
5-10 g de leguminosas crudas o sometidas a tratamiento térmico (tostado, enlatado, deshidratado,
cocido). La muestra será asignada por el profesor.
Material
 Agitador magnético 1
 Espátula 1
 Embudo de filtración rápida 2
 Gradilla para tubos de hemólisis 1
 Matraz Erlenmeyer de 125 mL 2
 Matraz volumétrico cap. 25 mL 2
 Mortero con pistilo 1
 Papel filtro o gasa
 Pipeta graduada de 1 mL 2
 Piseta 1
 Probeta de 10 mL 1
 Propipeta o jeringa 1
 Termómetro de 0-100 °C 1
 Tubo de hemólisis 21
 Tubo para centrífuga de 50 mL 8
 Vaso de precipitado de 100 mL 3
12
Reactivos
 Cloruro de sodio R.A.
 Heparina de 10,000 UI
 Sangre de conejo proporcionada por el Bioterio del Edificio A de la Facultad de Química
 Tripsina de páncreas bovino R. A.
Equipo
 Balanza de dos platos
 Centrífuga para 2500 rpm
 Estufa con control de temperatura a 37 °C
 Parrilla de agitación
I. Disolución salina isotónica: disolver 8.5 g de cloruro de sodio en 1000 mL de agua
destilada.
II. Disolución de cloruro de sodio al 1%.
III. Disolución de tripsina (1 mg/mL en disolución salina isotónica).
Problema
¿Existe diferencia en la cantidad de leguminosa necesaria para causar aglutinación de eritrocitos
de conejo en función al género o especie de la leguminosa y al tratamiento térmico al que fue
sometida?
Procedimiento
Sensibilización de los eritrocitos

1. Trasvasar la sangre de conejo con heparina a un tubo de centrífuga para lavarla dos veces
con la disolución isotónica (disolución I) en una proporción sangre: disolución salina de 1:5.
2. Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos.
3. Eliminar el sobrenadante por decantación y una vez terminado el segundo lavado diluir el
paquete de glóbulos rojos al 4%, para lo cual, por cada mL de paquete de eritrocitos se
deben añadir 24 mL de disolución isotónica (disolución I).
4. Por cada 10 mL de glóbulos rojos al 4%, agregar 1 mL de disolución de tripsina (disolución
III) y colocarla en la incubadora durante 45 minutos a una temperatura de 37 °C.
13
5. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, centrifugar nuevamente para eliminar la
enzima y a continuación lavar tres veces con disolución isotónica (disolución I), de la
misma manera que en la primera parte.
6. Después del último lavado, resuspender el paquete de eritrocitos al volumen original (4%)
del paso 3 y conservar en refrigeración bien etiquetado hasta su uso.
Preparación de extractos
1. Pesar la muestra: 1 g para muestras secas y 5 g para muestras húmedas y moler con
ayuda de un mortero. Trasvasar cuantitativamente a un matraz Erlenmeyer de 125 mL y
adicionar 25 mL de cloruro de sodio al 1% (disolución II).
2. Extraer con agitación continua y transcurrida una hora, dejar sedimentar y filtrar. Llevar al
aforo de 25 mL con cloruro de sodio al 1% (disolución II) y guardar en refrigeración
etiquetado (grupo, equipo, muestra utilizada, fecha de elaboración del extracto) hasta su
uso.
Determinación semicuantitativa de lectinas

1. Colocar 10 tubos de hemólisis en una gradilla y numerar del 1 al 10. Adicionar en cada
tubo 0.5 mL de disolución salina isotónica (disolución I).
2. Diluir en forma seriada 0.5 mL del extracto con una pipeta graduada de 1 mL como se
muestra a continuación:
Desechar
0.5 mL
0.5 mL de
extracto
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
3. Agregar 0.5 mL de suspensión de glóbulos rojos al 4% a cada tubo y homogeneizar

invirtiendo el tubo suavemente tres veces.
4. Preparar un control negativo con 0.5 mL de disolución isotónica (Disolución I) y 0.5 mL de
disolución de eritrocitos al 4%.
5. Realizar la dilución seriada por duplicado e Incubar las series de tubos a 37 °C durante una
hora.
14
6. Comparar el control negativo con la serie de tubos. Aquellos tubos que sean distintos al
control negativo, es decir que presenten aglutinación, se consideran prueba positiva.
Considerar como el título de la serie al último tubo que presenta aglutinación.
Guardar los desechos en frascos debidamente etiquetados para su posterior

tratamiento.
a) Calcular la cantidad mínima de muestra (expresada en µg) que produce aglutinación
(considere el título, peso de la muestra y el volumen de aforo) y completar la siguiente
Tabla:
Tratamiento Cantidad de muestra necesaria para causar
Leguminosa Título
térmico aglutinación (mg)
b) A partir de los resultados del grupo, trazar un gráfico de barras para comparar la cantidad
mínima de muestra necesaria para causar aglutinación entre leguminosas y tratamientos
térmicos estudiados. Discutir las posibles razones por las que se presentaron dichas
diferencias.
15
Referencias
Jaffé, W.G.; Levy, A.; Gonzalez, D.I. Phytochemistry. 1974, 13, 2685-2693.
Lajolo, K.M.; Genovese, M.I.; J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 6592-6598.
Liener, I. Plant lectins: Properties, nutritional significance and function. In: Antinutrients and
phytochemicals in food. Shahidi, F. ed. American Chemical Society Symposium Series 662:
Washington DC, 1997.
Flores, C. Tesis, Facultad de Química, UNAM. México, D.F., 2010.
16
DIAGRAMA ECOLÓGICO
DETERMINACIÓN SEMICUANTITATIVA DE LECTINAS

(SENSIBILIZACIÓN DE ERITROCITOS)
Trasvasar la sangre con anticoagulante a

tubos de centrífuga
Agregar disolución isotónica en proporción 1:5

(sangre: disolución isotónica)
Centrifugar a 2500 rpm durante 10 min
Sobrenadante Eliminar el sobrenadante por decantación
Paquete de glóbulos rojos

R1 Después del segundo lavado
Diluir paquete de glóbulos rojos al 4%
Añadir 1 mL de disolución tripsina por cada 10 mL de eritrocitos al 4%
Incubar por 45 min a 37 °C
Centrifugar a 2500 rpm durante 10 min
Lavar tres veces con disolución isotónica
Paquete de glóbulos rojos resuspender al volumen original (4%)
Tratamiento:
R1: Adicionar hipoclorito de sodio comercial y desechar en el drenaje con abundante agua.
17
DIAGRAMA ECOLÓGICO
DETERMINACIÓN SEMICUANTITATIVA DE LECTINAS

(PREPARACIÓN DE EXTRACTOS Y DETERMINACIÓN)
Pesar muestra, moler y adicionar 25 mL

de disolución salina al 1%
Papel filtro con

Agitar durante 1 h, sedimentar y filtrar sedimento
Extracto de muestra
Aforar el filtrado a 25 mL con
sobrante
disolución salina al 1%
R1
Realizar diluciones seriadas

R2 0.5 mL disolución isotónica + 0.5 mL de extracto y preparar un
control negativo con 0.5 mL de disolución isotónica
Agregar 0.5 mL de la suspensión de glóbulos

rojos a cada tubo de hemólisis
Homogeneizar
Incubar las series de tubos a 37 °C

durante 1 h
Observar aglutinación positiva de

eritrocitos
R3
Tratamiento:
R1: Dejar secar el papel filtro con los sólidos en la campana de extracción y una vez seco
recolectar y depositar en los residuos orgánicos.
R2: Desechar el extracto de la muestra en el drenaje.
R3: Dejar sedimentar la disolución salina isotónica con lectinas y suspensión de glóbulos rojos, y
decantar. Entregar el residuo sólido para incineración especializada.
Al residuo líquido adicionarle hipoclorito de sodio comercial y desechar en el drenaje con
abundante agua.
18
1.3 DETERMINACIÓN DE METANOL EN BEBIDAS ALCOHÓLICAS
Cuestionario previo
1. Describir el mecanismo de toxicidad del metanol en humanos.
2. ¿Cómo se trata una intoxicación con metanol? Explicar su fundamento bioquímico.
3. ¿Cuáles son las posibles causas por las que se encuentra metanol en bebidas
alcohólicas?
4. ¿Cuál es el motivo por el que no se recomienda el uso de pectinesterasas para la
clarificación del brandy cuando procede de jugos fermentados? Escribir la reacción de
desmetilación de pectinas por la acción de la enzima pectinesterasa.
Objetivo
Determinar la concentración de metanol contenida en una bebida alcohólica, para que el estudiante
relacione mediante el NOAEL el riesgo toxicológico que puede existir al ingerirla.
Muestra
El profesor proporcionará 100 mL de la bebida alcohólica a cada equipo, indicando el tipo de
muestra y el contenido de etanol en la misma.
Material
 Bureta de 25 mL 5
 Celda de vidrio de 1 cm 1 juego
 Equipo de destilación simple con capacidad de 500 mL 1
 Espátula 1
 Matraz volumétrico de 100 mL 2
 Mechero Bunsen con manguera y tela de asbesto 1 juego
 Perla de ebullición 4
 Pinza para bureta 1
 Pinza para refrigerante 3
 Piseta 1
 Recipiente para baño de hielo 1
 Soporte universal 1
19
Reactivos
 Ácido cromotrópico R.A.
 Ácido fosfórico concentrado R.A.
 Ácido oxálico R.A.
 Ácido sulfúrico concentrado R.A.
 Etanol R.A.
 Metanol R.A.
 Permanganato de potasio R.A.
Equipo
 Baño de agua con control de temperatura
 Espectrofotómetro UV-Visible
I. Disolución patrón de metanol (1 mg/mL). Preparar esta disolución considerando que la
densidad del metanol es de 0.790 g/mL.
II. Disolución de permanganato de potasio/ácido fosfórico: Disolver 3.0 g de KMnO 4 en una
mezcla de 15 mL de H3PO4 y 70 mL de agua destilada y llevar a 100 mL con agua
destilada. Preparar la disolución en la campana y utilizar lentes de seguridad y
guantes.
III. Disolución de ácido oxálico al 5% (m/v): Disolver 5.0 g de ácido oxálico en 50 mL de agua
y mezclar en un baño de hielo con 50 mL H2SO4, adicionando el ácido al agua lentamente
y con mucha precaución. Preparar la disolución en la campana y utilizar lentes de
seguridad y guantes.
IV. Disolución de ácido cromotrópico al 5% (m/v)
V. Disolución de etanol al 5% (v/v)
Problema
a) Comparar el contenido de metanol encontrado en la muestra con el límite máximo
establecido por la normativa nacional vigente.
b) A partir del contenido de metanol en la muestra, calcular la cantidad de bebida que podrá
consumir un adulto (65 kg de peso corporal) al día sin presentar efectos adversos.
Considerar que el NOAEL para metanol es de 500 mg/kg peso corporaldía para rata
macho vía oral.
20
Procedimiento
Destilación
1. A partir del contenido alcohólico de la bebida, realizar el ajuste a 5% de etanol (v/v).
2. Colocar 100 mL en el equipo de destilación simple y destilar (revisar que el equipo de
destilación no presente fugas), recibir el destilado en baño de hielo.
3. Recolectar los primeros 15 a 20 mL y llevar al aforo de 100 mL con agua destilada.
Oxidación del metanol y formación del compuesto colorido

1. De la disolución obtenida en el paso anterior, tomar una alícuota de 5 mL y depositarla en
el fondo de un matraz volumétrico de 25 mL, a continuación adicionar con una bureta 2 mL
de la disolución de permanganato de potasio/ácido fosfórico (disolución II). Colocar el
tapón y agitar, dejar reposar por 15 minutos.
2. Transcurrido el tiempo adicionar 2 mL de la mezcla de ácido oxálico/ácido sulfúrico
(disolución III) con una bureta, tapar y agitar, con mucho cuidado aflojar el tapón para
permitir la salida del CO2 liberado y dejar 15 minutos en reposo. Transcurrido este tiempo
adicionar con bureta 1 mL de ácido cromotrópico (disolución IV) y 5 mL de H 2SO4
concentrado (Precaución: el ácido debe estar lo más frío posible y debe adicionarse
resbalándolo por la pared del matraz. Realice esta operación en la campana de
extracción).
3. Colocar el matraz en un baño de agua con control de temperatura entre 65-68 °C por 20
minutos.
4. Enfriar el matraz hasta 25 °C y llevar al aforo con agua destilada. Tomar una fracción
homogeneizada y leer la absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de onda de
570 nm. Ajustar a cero con el blanco de la curva.
5. Para realizar el blanco de la muestra, tomar una alícuota de 5 mL del destilado llevado al
aforo y trabajar de la misma manera que la muestra; sustituyendo el ácido cromotrópico
por 1 mL de agua destilada.
21
Elaboración de la curva patrón
Preparar los siguientes matraces para la curva patrón:
Reactivos (mL) Matraz Matraz 1 Matraz 2 Matraz 3
Blanco
Disolución patrón (Disolución I) 0.0 0.3 0.5 1.0
Etanol al 5% (Disolución V) 5.0 4.7 4.5 4.0
Disolución de KMnO4/H3PO4 (Disolución II) 2.0 2.0 2.0 2.0
15 minutos a 25 °C
Disolución de ácido oxálico al 5% (Disolución III) 2.0 2.0 2.0 2.0
15 minutos a 25 °C
Ácido cromotrópico al 5% (Disolución IV) 1.0 1.0 1.0 1.0
H2SO4 concentrado y FRÍO 5.0 5.0 5.0 5.0
20 minutos a 65-68 °C
Enfriar a 25 °C y llevar al aforo de 25 mL con agua destilada, leer la absorbancia a 570 nm
Guardar los desechos en frascos debidamente etiquetados para su posterior tratamiento.
a) Completar la siguiente Tabla:
Concentración de
Disolución Absorbancia
metanol
patrón (mL) =570 nm
(mg/mL)
0.0 r
0.3 m
0.5 b
1.0
b) Calcular la cantidad de metanol contenida en la presentación de la bebida, expresada en

ppm y en mg metanol/100 mL de alcohol anhidro. Comparar este valor con el límite
máximo señalado en la normatividad nacional vigente, desglosando los cálculos para cada
una de las lecturas de absorbancia tomando en cuenta las diluciones realizadas.
Concentración Concentración (mg metanol/100 mL de
Lectura Absorbancia
(ppm) alcohol anhidro)
1
2
Promedio
22
c) Relacionar el valor obtenido con el riesgo potencial de la ingestión frecuente del metanol
contenido en la bebida alcohólica analizada.
23
Referencias
Amerine, M.A.; Ough, C.S. Methods for analysis of musts and wines. Wiley Interscience
Publication: Washington DC, 1980.
Davis, L.; Hudson, A.; Benson, B.; Jones E.L.; Coleman, J.K. J. Clin. Toxicol. 2002, 40, 499-505.
Secretaría de Salud. NOM-142-SSA1-1995. 1995. Bienes y Servicios. Bebidas alcohólicas.
Especificaciones sanitarias. Etiquetado sanitario y comercial. Diario Oficial de la
Federación. 1995.
24
DIAGRAMA ECOLÓGICO
DETERMINACIÓN DE METANOL EN BEBIDAS ALCOHÓLICAS
Ajuste de la muestra al 5% de etanol
Destilar. Colectar los primeros 15-20 mL

Residuo destilación
Llevar al aforo de 100 mL con agua destilada

R1
Muestra: Tomar dos alícuotas de 5 mL Blanco de muestra: Tomar una
alícuota de 5 mL
Adicionar 2 mL de disolución ácida de

KMnO4 y dejar reposar 15 min
Adicionar 2 mL de disolución ácido

(Muestra) oxálico/H2SO4 y dejar reposar 15 min (Blanco)
Adicionar 1 mL de ácido cromotrópico Adicionar 1 mL de agua destilada

y 5 mL de H2SO4 concentrado y 5 mL de H2SO4 concentrado
Colocar en baño con temperatura

controlada a 65-68 °C por 20 min
Enfriar y llevar al aforo de 25 mL con agua destilada
Leer la absorbancia a 570 nm
R2
Tratamiento:
R1: Desechar el destilado en el drenaje.
R2: Tratar el compuesto colorido-ácido sulfúrico con carbón activado hasta que la disolución quede
incolora, filtrar, neutralizar y desechar en el drenaje. Enviar el carbón activado a incineración.
25
1.4 DETERMINACIÓN DE MALATIÓN RESIDUAL EN ALIMENTOS DE ORIGEN VEGETAL
Cuestionario previo
1. Señalar la diferencia entre plaguicida e insecticida.
2. ¿Qué es el malatión? Dibujar su estructura química.
3. ¿Qué ventajas presenta el uso de insecticidas organofosforados con respecto a los
insecticidas organoclorados?
4. ¿Cuáles son las enzimas utilizadas en mamíferos e insectos para la biotransformación de
malatión? ¿Qué productos genera cada una?
5. ¿Cuál es el mecanismo de toxicidad del malatión?
6. ¿Qué reacción se lleva a cabo con el malatión en medio básico y en presencia de etanol?
7. Indicar el valor del límite máximo residual (LMR) de malatión para frutas cítricas y
vegetales de acuerdo a la legislación vigente.
8. Investigar la densidad y la polaridad de todos los disolventes que utilizará en el
protocolo.
Objetivo
Determinar la concentración de malatión residual en la superficie de frutas y vegetales para que el
estudiante relacione la cantidad encontrada con el riesgo toxicológico mediante el NOAEL para
este insecticida y el consumo de dichos alimentos a largo plazo.
Muestra
250 g de frutos cítricos (naranja, lima, limón o toronja) o solanáceas (jitomate, tomate verde, papa,
chile, pimiento) que serán asignados a cada equipo por el profesor.
Material
 Embudo de separación de 250 mL 2
 Espátula 1
 Frasco de vidrio (la capacidad depende de la muestra) 1
 Matraz volumétrico cap.100 mL 1
 Papel filtro
 Papel pH
 Piseta 1
26
 Probeta graduada de 100 mL 2
 Soporte universal con anillo metálico 2 juegos
 Tubo de ensayo de 16 x 150 mm 2
Reactivos
 Ácido clorhídrico concentrado R.A.
 Cloruro férrico R.A.
 Diclorometano R.A.
 Disulfuro de carbono Q.P.
 Etanol R.A.
 Fenolftaleína al 1% en etanol
 Hidróxido de sodio R.A.
 Malatión al 50% (m/v)
 Sulfato cúprico R.A.
 Sulfato de sodio R.A.
 Sulfato de sodio anhidro R.A.
Equipo
I. Disolución patrón: Medir 0.1 mL de malatión al 50% (m/v) en un matraz volumétrico de 100
mL y llevar al aforo con etanol, de esta disolución tomar 8 mL y llevar al aforo nuevamente
a 100 mL con etanol. Preparar la disolución en la campana y utilizar lentes de
II. Disulfuro de carbono al 0.5% (v/v) en diclorometano. Preparar la disolución en la
campana y utilizar lentes de seguridad y guantes.
III. Disolución de sulfato de sodio al 9% (m/v)
IV. Disolución ácida de sulfato de sodio. A 100 mL de la disolución anterior, adicionar 3 mL de
HCl concentrado. Preparar la disolución en la campana y utilizar lentes de seguridad y
guantes.
V. Hidróxido de sodio 6 N. Preparar la disolución en la campana y utilizar lentes de
VI. Ácido clorhídrico 2 N. Preparar la disolución en la campana y utilizar lentes de
27
VII. Disolución de cloruro férrico al 5% (m/v). Pesar 5 g de cloruro férrico y disolver en 3 mL de
HCl 2 N, después llevar al aforo de 100 mL con agua.
VIII. Disolución de sulfato cúprico al 3.5% (m/v)
Problema
a) Determinar el contenido de malatión residual en la muestra vegetal. Calcular la cantidad de
vegetal que podrá consumir un adulto (60 kg de peso corporal) sin presentar efectos
adversos. Para ello, considerar que el NOAEL en ratas macho para malatión es de 29
mg/kg peso corporaldía.
Procedimiento
Precaución: es estrictamente necesario el uso de guantes y lentes de seguridad en la

realización de esta práctica.
Extracción
1. Frutos cítricos: Pesar 250 g de la muestra y retirar la cáscara, pesar 25 g de la cáscara y
colocarlos en un frasco de vidrio de boca ancha con tapa metálica, añadir 50 mL de
diclorometano, tapar y agitar vigorosamente por 5 minutos.
2. Solanáceas: Pesar 100 g de muestra y colocarlos en un frasco de vidrio de boca ancha con
tapa metálica, añadir 80 mL de diclorometano, tapar y agitar vigorosamente por 5 minutos.
3. Filtrar el extracto a través de un papel filtro y medir el volumen del filtrado utilizando una
probeta.
Reacción de β-eliminación
1. Del filtrado anterior, tomar dos alícuotas de 15 mL con pipeta graduada, una de ellas
corresponderá al blanco de muestra, colocar cada alícuota en un embudo de separación.
2. Adicionar 5 mL de etanol y 0.2 mL de disulfuro de carbono 0.5% (disolución II), agitar
suavemente los embudos. Posteriormente, adicionar 15 mL de disolución ácida de sulfato
de sodio (disolución IV) y agitar suavemente por 1 minuto.
3. Recolectar la fase orgánica en un vaso de precipitado.
4. Transferir cada fase orgánica en el mismo embudo de separación del cual proviene.
5. Añadir 5 mL de etanol, agitar y añadir 0.2 mL de NaOH 6 N (disolución V) agitando
nuevamente por 5 minutos, dejar reposar 1 minuto y adicionar 15 mL de la disolución de
sulfato de sodio (disolución III), agitar y descartar la fase orgánica.
6. A la fase acuosa añadir 5 mL de diclorometano y una gota de indicador de fenolftaleína al
1%. Ajustar el pH a 5 agregando gota a gota HCl 2 N (disolución VI). Verificar la acidez con
tiras indicadoras. Añadir 0.2 mL de la disolución de cloruro férrico (disolución VII), agitar y
desechar la fase orgánica.
28
Formación del compuesto de coordinación
1. A la fase acuosa que corresponde al blanco de muestra, añadir 8 mL de diclorometano y
0.3 mL de agua destilada. A la otra fase acuosa añadir 8 mL de diclorometano y sustituir el
volumen de agua destilada por 0.3 mL de disolución de sulfato cúprico (disolución VIII).
2. Agitar suavemente los embudos por 1 minuto, colectar las fases orgánicas y secar con
sulfato de sodio anhidro. Ajustar a cero el espectrofotómetro con diclorometano y leer el
porcentaje de transmitancia de las muestras a 420 nm.
Elaboración de la curva patrón

1. Preparar tres tubos como se indica a continuación:
Disolución patrón Etanol
Tubo
(mL) (mL)
1 1.0 4.0
2 2.5 2.5
3 5.0 0.0
2. Colocar el contenido de cada tubo en un embudo de separación y adicionar 10 mL de

diclorometano. Proceder de la misma forma que en la reacción de -eliminación a partir del
punto 2 (adición de 0.2 mL del disulfuro de carbono al 0.5%).

tratamiento.
a) Completar la siguiente Tabla:
Concentración
Volumen de
de malatión Transmitancia Absorbancia
disolución
(mg/mL fase (%,= 420 nm) (= 420 nm)
patrón (mL)
orgánica)
0 r
1.0 m
2.5 b
5.0
b) Calcular la concentración de malatión expresándola en ppm y comparar con el valor

consultado en la normativa vigente. Realizar los cálculos tomando en cuenta las diluciones
realizadas.
29
Lectura Absorbancia Concentración (ppm)
1
2
Promedio
c) Incluir en el reporte la resolución del inciso a) del problema planteado. Relacionar el valor
obtenido con el riesgo potencial de la ingestión frecuente de malatión contenido en la
muestra vegetal analizada.
30
Referencias

Food and Agriculture Organization of the United Nations. Submission and evaluation of pesticide
residues data for the estimation of maximum residue levels. FAO Plant Production and
Protection Paper 197; FAO: Rome, 2009.
Norris, M.; Voil, W.; Averall, P. J. Agric. Food Chem. 1954, 2, 570-573.
31
DIAGRAMA ECOLÓGICO
DETERMINACIÓN DE MALATIÓN RESIDUAL EN ALIMENTOS DE ORIGEN VEGETAL
Pesar cáscara de fruto cítrico (25 g) o solanácea (100 g)
De acuerdo a la muestra agregar 50 u 80 mL de CH2Cl2
Filtrar y medir el Residuo sólido

volumen de filtrado
Tomar dos alícuotas de 15 mL

R1
Filtrado
Adicionar 5 mL de etanol, 0.2 mL de CS2 al 0.5% y
15 mL de disolución ácida de Na2SO4
R2
Separar fases
Fase orgánica Fase acuosa
Añadir 5 mL de etanol, 0.2 mL de NaOH 6 N. Agitar y

adicionar 15 mL de disolución de Na2SO4 R3
Separar fases
Añadir 5 mL de CH2Cl2 y 1 gota de fenolftaleína

R4
Neutralizar gota a gota con HCl 2 N y agitar
Neutralizar. Añadir 0.2 mL de FeCl3. Agitar
Separar fases
Fase acuosa Fase orgánica R5
Continúa en la siguiente página
32
DIAGRAMA ECOLÓGICO
DETERMINACIÓN DE MALATIÓN RESIDUAL EN ALIMENTOS DE ORIGEN VEGETAL

(Continuación)
Fase acuosa
Muestra: Adicionar 8 mL de CH2Cl2, 0.3 mL Blanco: Adicionar 8 mL de CH2Cl2, 0.3

de disolución de sulfato cúprico mL de agua destilada
Agitar
Separar fases
Leer el porcentaje de
transmitancia a 420 nm R6
R7
Tratamiento:
R1: Dejar secar los residuos sólidos en la campana de extracción y una vez secos, recolectar y
enviar a incineración.
R2: Recuperar el CH2Cl2 por destilación para su reutilización. Enviar el residuo de malatión a
incineración.
R3 y R6: Neutralizar y desechar en el drenaje.
R4, R5: Recuperar el CH2Cl2 y el etanol por destilación fraccionada para su reutilización.
R7: Tratar el compuesto de coordinación con carbón activado (0.5%) hasta la eliminación del color
amarillo. Filtrar y recuperar el CH2Cl2 por destilación para su reutilización. Enviar el carbón activado
a incineración.
33
2.1 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE POLIFENOLES EN ALIMENTOS
Cuestionario previo
1. Definir compuesto nutracéutico y alimento funcional. Completar el siguiente cuadro con la
información solicitada.
Alimento funcional Compuesto con actividad biológica Beneficio a la salud
1.
2.
3.
2. ¿Qué son los polifenoles y cómo se clasifican de acuerdo a su estructura química?

3. ¿Por qué los alimentos que contienen polifenoles se consideran funcionales?
4. Discutir brevemente el mecanismo de acción de los polifenoles en el organismo y señalar
la Ingesta Diaria Admisible.
Objetivo
Determinar la concentración de polifenoles totales presentes en distintos alimentos a través del
método ISO 9648-1988, para que el estudiante lo relacione con el efecto benéfico asociado a ellos
en la literatura.
Muestra
10 g de frutos rojos, especias, cereales, café, té o producto alimenticio derivado de los alimentos
mencionados, que será asignado a cada equipo por el profesor.
Material
 Espátula 1
 Papel filtro
34
 Piseta 1
 Tubos de ensayo de 16 x 150 mm 3
Reactivos
 Ácido tánico R.A.
 Citrato férrico amoniacal R.A.
 Dimetilformamida R.A.
 Hidróxido de amonio R.A.
Equipo
 Parrilla con agitación
I. Disolución de dimetilformamida al 75% (v/v). Llevar al aforo con agua destilada.
II. Disolución patrón de ácido tánico 0.2% (m/v). Llevar al aforo con agua destilada.
III. Disolución de citrato férrico amoniacal. El contenido de hierro debe estar entre el 17 y 20%.
Preparar una disolución de 0.35 g/100 mL 48 horas antes de su uso.
IV. Disolución acuosa de amoníaco. Preparar una disolución que contenga 0.8 g de NH3/100
mL de agua. Es necesario realizar los cálculos para medir el amoníaco que se encuentra
en el hidróxido de amonio. La densidad del hidróxido de amonio es 0.89 g/mL. Preparar la
disolución en la campana y utilizar lentes de seguridad y guantes.
Procedimiento
Preparación del extracto

1. Muestras sólidas: Moler de 1 a 5 gramos de la muestra hasta obtener una harina
homogénea. Pesar 1 gramo de la harina en caso de cereales y 0.5 g para el café soluble y
té verde. Trasvasar cuantitativamente a un matraz Erlenmeyer de 125 mL, agregar 20 mL
de dimetilformamida al 75% (disolución I) y agitar durante una hora. Transcurrido este
tiempo, dejar sedimentar, filtrar y llevar al aforo de 25 mL con dimetilformamida al 75%
(disolución I).
35
2. Muestras líquidas: Filtrar la muestra en caso de tener sólidos en suspensión y tomar un 1
mL de la muestra para desarrollar color.
Desarrollo de color
1. Rotular tres tubos (uno será el blanco y dos la muestra problema) y agregar los reactivos
de acuerdo a la siguiente Tabla:
Blanco Problema 1 Problema 2

Reactivo y muestra
(mL) (mL) (mL)
Muestra 1 1 1
Agua destilada 6 5 5
Citrato férrico amoniacal (Disolución III) 0 1 1
Amoniaco (Disolución IV) 1 1 1
Agitar después de cada adición
2. Dejar que la reacción se lleve a cabo a 25 °C por 10 minutos. Posteriormente leer la

absorbancia a una longitud de onda de 525 nm. Ajustar el espectrofotómetro con un blanco
de agua.
Preparación de la curva patrón

1. Rotular 4 matraces volumétricos de 25 mL y agregar 1, 3, 5, y 7 mL de la disolución patrón
de ácido tánico (disolución II), respectivamente a cada matraz. Llevar al aforo con la
disolución de dimetilformamida al 75% (disolución I).
2. Rotular 5 tubos de ensaye (del cero al 4), añadir al tubo cero 1 mL de la disolución de
dimetilformamida al 75% (disolución I), al resto de los tubos agregar 1 mL del matraz
correspondiente. Adicionar 5 mL de agua destilada a cada uno de los tubos y agitar.
3. Añadir 1 mL de la disolución de citrato férrico amoniacal (disolución III) y 1 mL de la
disolución acuosa de amoniaco (disolución IV) a todos los tubos y agitar. Dejar que la
reacción se lleve a cabo por 10 minutos a 25 °C. Leer en el espectrofotómetro a una
longitud de onda de 525 nm.

tratamiento.
36
a) Trazar una gráfica de absorbancia vs la concentración de ácido tánico (g de ácido
tánico/mL), considerar que la ordenada no pasa por el origen y completar la siguiente
Tabla:
Volumen de Concentración de Absorbancia
disolución patrón ácido tánico (=525 nm)
(mL) (µg/mL)
0
1
3 r
5 m
7 b
b) Calcular el contenido de polifenoles presentes en la muestra expresado en g de ácido

tánico/100 g de muestra. Utilizar el siguiente formato.
Absorbancia
Lectura Contenido de
(= 525 nm)
polifenoles
(g/100 g muestra)
1
2
Promedio
c) Con base a la información encontrada en la literatura discutir los posibles efectos

benéficos y adversos de los polifenoles derivados del consumo frecuente del alimento
analizado.
37
Referencias

Girard, R.; Mazza, G. Productos funcionales derivados de las uvas y de los cítricos. En: Alimentos
funcionales: aspectos bioquímicos y de procesado. Mazza, G., ed; Editorial Acribia:
Zaragoza, 2000.
International Organization of Standarization. ISO 9648-1988: Sorghum: Determination of tannin
content. 1988.
Martínez-Valverde, I.; Periago, M.; Ros, G. Archivos Latinoamericanos de Nutrición. 2000, 50 (1),
5-18.
Parr, J.; Bolwell, P. J.Sci. Food Agric. 2000, 80, 985-1012.
38
DIAGRAMA ECOLÓGICO
DETERMINACIÓN DEL CONTENDO DE POLIFENOLES EN ALIMENTOS
Moler y pesar muestra
Adicionar 20 mL de
dimetilformamida al 75%
Agitar 1 h y dejar reposar 20 min
Filtrar R1
Residuo sólido
Extracto de muestra Filtrado: llevar al aforo de 25 mL

sobrante con dimetilformamida al 75%
Blanco: Tomar una alícuota de 1 mL

R2 Tomar dos alícuotas de 1 mL y y adicionar 6 mL de agua destilada
adicionar 5 mL de agua destilada
Adicionar 1 mL de citrato férrico

amoniacal
Adicionar 1 mL de la disolución de
amoniaco
Dejar reposar los tubos durante 10

min. Leer la absorbancia a 525 nm
R3
Tratamiento:
R1: Dejar secar el papel filtro con los sólidos en la campana de extracción y una vez secos,
recolectar y enviar a incineración.
R2: Recuperar la dimetilformamida por destilación para su reutilización, desechar el resto en el
drenaje con abundante agua.
R3: Tratar la mezcla de cromóforo, dimetilformamida y amoniaco con carbón activado hasta la
eliminación de color, filtrar y neutralizar. Enviar el residuo sólido a incineración y recuperar la
dimetilformamida por destilación para su reutilización.
39
2.2 EFECTO DE LA TEMPERATURA Y TIEMPO SOBRE EL CONTENIDO DE
ANTOCIANINAS. (AOAC, 2005.02)
Introducción
Las antocianinas son compuestos fenólicos del grupo de los flavonoides presentes en las plantas
vasculares, se consideran inocuos y de fácil incorporación en medios acuosos, por lo que se
utilizan como colorantes hidrosolubles naturales. Estos pigmentos se encuentran en la mayoría de
las frutas, hortalizas, flores, hojas, raíces y otros órganos de almacenamiento de las plantas, la
coloración de estos pigmentos van desde rojo hasta el violeta y azul.
Existe una gran variedad de antocianinas distribuidas en la naturaleza, las principales diferencias
entre ellas son el número de hidroxilaciones y los azúcares unidos a su estructura. Se han
identificado más de 500 diferentes antocianinas, de las cuales sólo seis son las más comunes:
cianidina, delfinidina, pelargonidina, peonidina, petunidina y malvidina.
Las antocianinas son altamente inestables y muy susceptibles a la degradación. Su estabilidad

está afectada por pH, temperatura, luz, oxígeno, disolventes y la presencia de enzimas,
flavonoides, iones metálicos y proteínas. La estabilización química de éstas es el principal objetivo
en los estudios recientes debido a sus potenciales aplicaciones.
Cuestionario previo
1. Dibujar la estructura química general de las antocianinas y el rango de absorción en el
espectrofotómetro.
2. Investigar cuáles son las antocianinas más abundantes en alimentos.
3. Indicar en qué disolventes son solubles las antocianinas.
Objetivo
Determinar la concentración de antocianinas en alimentos y bebidas sometidas a distintos
tratamientos térmicos, mediante el método AOAC 2005.02, para que el estudiante establezca el
efecto de la temperatura y tiempo sobre el contenido de dicho colorante.
Muestra
15 mL de jugo de frutas o de 1 a 5 g de té o frutos rojos que serán asignados a cada equipo por el
profesor.
Material
40
 Gradilla 1
 Papel filtro
Reactivos
 Acetato de sodio anhidro R.A.
 Ácido clorhídrico R.A.
 Cloruro de potasio R.A.
Equipo
 Baño seco (90 °C)
 Espectrofotómetro UV-Vis
 Potenciómetro
I. Disolución de ácido clorhídrico 2 N. Preparar la disolución en la campana y utilizar
lentes de seguridad y guantes.
II. Disolución de cloruro de potasio 0.025 M, pH 1.0. Pesar 1.86 g de cloruro de potasio y
disolver en 800 mL de agua destilada, ajustar el pH a 1.0 con ácido clorhídrico 2 N y
llevar al aforo de 1 L.
III. Disolución de acetato de sodio 0.4 M, pH 4.5. Pesar 32.81 g de acetato de sodio y
disolver en 800 mL de agua destilada, ajustar el pH a 4.5 con ácido clorhídrico 2 N y
llevar al aforo de 1 L.
Procedimiento
Preparación del extracto

1. Muestras sólidas: Moler de 1 a 5 gramos de la muestra y agregar 20 mL de la disolución de
cloruro de potasio pH 1.0 (disolución II) y agitar durante 30 minutos. Transcurrido este
tiempo, dejar sedimentar y continuar con el tratamiento de las muestras.
2. Muestras líquidas: Filtrar la muestra en caso de tener sólidos en suspensión.
41
Tratamiento de las muestras
1. Colocar en un tubo de ensayo 2.5 mL de la muestra y someterla a los diferentes
tratamientos establecidos en la Tabla 1.
Tabla 1. Tratamientos de trabajo

Lote Tratamiento
CONTROL Mantener a 25 °C
1 Calentar a 90 °C durante 30 minutos
Determinación espectrofotométrica del contenido total de antocianinas monoméricas

1. Mezclar 1 mL de la muestra tratada con 4 mL de la disolución de cloruro de potasio pH 1.0
(disolución II), agitar y mantener a 25 °C durante 20 minutos.
2. Ajustar el espectrofotómetro a cero con la disolución de cloruro de potasio pH 1.0 y leer la
absorbancia a 520 nm y 700 nm. Si la lectura de absorbancia sale del rango 0.2-1.4,
realizar la dilución correspondiente de la muestra tratada.
3. Mezclar 1 mL de la muestra tratada con 4 mL de la disolución de acetato de sodio pH 4.5
(disolución III), agitar y mantener a 25 °C durante 20 minutos.
4. Ajustar el espectrofotómetro a cero con la disolución de acetato de sodio pH 4.5 y leer la
absorbancia a 520 nm y 700 nm.

tratamiento.
a) Expresar el contenido total de antocianinas monoméricas como mg cianidina 3-glucósido/L
de extracto o muestra o kg de muestra según sea el caso; para ello considerar:
Absorbancia corregida (AC) = [(A520nm - A700nm) pH 1.0 - (A520nm-A700nm) pH 4.5]
Peso molecular (PM) de la cianidina 3-glucósido = 449.2 g/mol
Coeficiente de absorción molar () de la cianidina 3-glucósido = 26 900 L/cm mol
b) Realizar un gráfico del contenido de antocianinas con respecto al tiempo y discutir la
tendencia observada.
c) Indicar la pérdida del contenido total de antocianinas monoméricas expresada en

porcentaje para cada tratamiento considerando los resultados del control como el 100% del
42
colorante y relacionarlo con los cambios que sufre la molécula con los tratamientos
establecidos.
Referencias
AOAC, 2005. Method. 2005.02. Total monomeric anthocyanin pigment content of fruit juices,
beverages, natural colorants and wines. Official Methods of Analysis of AOAC International.
Castañeda-Ovando, A.; Pacheco, M.; Páez-Hernández, M.; Rodríguez, J.; Galán-Vidal, C. Food
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Kirca, A.; Özkan, M.; Cemeroglu, B. Food Chem. 2006, 101, 212-218.
Jing P.; Zhao S.; Ruan S.; Xie Z;, Dong Y;, Yu L. Food Chem.. 2012, 133, 1569-1576.
Walid E.; Nizar T.; Nizar N.; Yassine Y.; Hédia H.; Nizar C.; Ying, M.; Ferchichi, A. J. Food Sci.
2011, 76, C707-713.
43
DIAGRAMA ECOLÓGICO
EFECTO DE LA TEMPERATURA Y TIEMPO SOBRE EL CONTENIDO DE

ANTOCIANINAS
Muestra
Tratamiento
Alícuota
Mezclar 1 mL de la Mezclar 1 mL de la
muestra con 4 mL de la muestra con 4 mL de la
disolución pH 1.0 disolución pH 4.5
Incubar durante 20 minutos a 25 °C
Ajustar a cero el espectrofotómetro con

la respectiva disolución
Leer la absorbancia a 520 nm y 700 nm
R1
Tratamiento:
R1: Neutralizar y desechar en el drenaje.
44
CUESTIONARIO GENERAL UNIDAD III
1. ¿Cuál es la diferencia entre alimento y producto alimenticio?

2. Escribir la ecuación de velocidad de la siguiente reacción química con respecto a reactivos
y a productos.
3. ¿Cuál es el significado químico de los parámetros cinéticos: k (constante de reacción), Ea

(energía de activación) y n (orden de reacción)?
4. Explicar el modelo cinético de Arrhenius.
5. Definir el concepto de Q10, ¿cómo se determina y cuál es su utilidad para la industria
alimentaria?
6. Explicar cuatro reacciones de deterioro de los alimentos.
7. Explicar cuatro métodos para determinar la calidad de la proteína.
45
3.1 DETERMINACIÓN DE LA VIDA DE ANAQUEL
Introducción
En los alimentos y productos alimenticios ocurren reacciones químicas que conllevan al deterioro
de su calidad nutrimental, sensorial y de su inocuidad, algunas de las más importantes se enlistan
en el Cuadro 1. Estas reacciones involucran distintos sustratos dependiendo de la composición de
los mismos y las condiciones de procesamiento y almacenamiento a las que sean sometidos. La
velocidad en que se llevarán a cabo estas reacciones dependerá de una gran variedad de factores,
algunos de ellos pueden ser controlados por el empaque y almacenamiento del producto, como por
ejemplo: luz, oxígeno, temperatura y humedad.
Cuadro 1. Ejemplos de reacciones químicas de deterioro de la calidad de un alimento o

producto alimenticio
Pardeamiento no enzimático
Hidrólisis de lípidos
Oxidación de lípidos
Desnaturalización de proteínas
Hidrólisis de oligo y polisacáridos
Hidrólisis de proteínas
Degradación de pigmentos naturales
La vida de anaquel de un alimento, producto alimenticio o bebida, se define como el periodo de

tiempo, después de la producción, durante el cual el producto almacenado bajo determinadas
condiciones ambientales (como temperatura, luz, y humedad relativa), continúa presentando
características aceptables para el productor, consumidor y la legislación vigente.
De acuerdo al Codex Alimentarius, la vida de anaquel o vida útil de un producto alimenticio, es el
periodo de tiempo durante el cual el producto mantiene una adecuada calidad microbiológica y
sensorial a una temperatura de almacenamiento dada.
Cabe señalar que el concepto de vida de anaquel difiere de los distintos términos utilizados para
los fines del "marcado de la fecha" de los alimentos pre-envasados; por ejemplo, de acuerdo al
Codex Alimentarius se entiende por:
 Fecha de fabricación: la fecha en la que el alimento se transforma en el producto descrito.
 Fecha de envasado: la fecha en la que el alimento es colocado en el envase en el que será
puesto a la venta.
 Fecha límite de venta: la última fecha en la que se ofrece el alimento para la venta al
consumidor después de la cual queda un plazo razonable de almacenamiento en el hogar.
46
 Fecha de duración mínima ("consumir preferentemente antes de"): la fecha en que, bajo
determinadas condiciones de almacenamiento, expira el período durante el cual el
producto es totalmente comercializable y mantiene cuantas cualidades específicas se le
atribuyen tácita o explícitamente. Sin embargo, después de esta fecha, el alimento puede
ser todavía enteramente satisfactorio.
 Fecha límite de utilización (fecha límite de consumo recomendada o fecha de caducidad):
la fecha en que termina el período después del cual el producto, almacenado en las
condiciones indicadas, no tendrá probablemente los atributos de calidad que normalmente
esperan los consumidores. Después de esta fecha, no se considerará comercializable el
alimento.
De acuerdo a la fecha señalada en el envase, los puntos de venta manejan primeras entradas
primeras salidas (PEPS); es decir, los productos con “fecha de caducidad” o “fecha de consumo
preferente” más próxima se localizan al frente del anaquel o mostrador, de esta manera se busca
que el producto sea adquirido por el consumidor antes de dicha fecha.
Con base en su fecha de caducidad, los productos alimenticios se clasifican en productos de

caducidad: corta (perecederos), media (semi-perecederos) y larga (no perecederos). Los productos
de caducidad corta son aquellos que tienen una vida de anaquel promedio de una semana, por lo
que la toma de muestra para determinar su deterioro durante el almacenamiento debe hacerse
diariamente desde el inicio del estudio de vida de anaquel; como ejemplos de estos productos se
encuentran la leche y sus derivados, huevo, carne, pescado, frutas y ensaladas frescas.
Los productos que tienen una caducidad de hasta tres semanas se clasifican como productos de
caducidad media y se sugiere determinar su deterioro durante los días 0, 7, 14, 19, 21 y 25 de
almacenamiento; como ejemplos de esta clasificación están los productos de panificación y los
frutos secos. Los productos que tienen una caducidad mayor a un año son denominados productos
de caducidad larga y la determinación de su deterioro se sugiere realizar en los meses 0, 1, 2, 3, 6,
12 y en ocasiones 18 de su almacenamiento; como ejemplo de este tipo de productos se tiene a
los quesos madurados, salmueras, vinagretas, harinas y pastas. En estos productos la evaluación
realizada dentro de los primeros tres meses es principalmente con el objetivo de buscar el
desarrollo de microorganismos no deseados en el producto, por lo que después de este tiempo el
análisis se realiza a los seis meses y después cada seis meses.
Determinación de la vida de anaquel de un producto

Es necesario establecer la vida de anaquel de un producto cuando se requiere estudiar los efectos
de algunos factores específicos o una combinación de ellos, como por ejemplo, temperatura de
47
almacenamiento, materiales de empaque, parámetros de proceso o el efecto de algunos aditivos
en la vida útil del producto. También es necesaria esta estimación cuando se trata del desarrollo de
un nuevo producto o inclusive de un prototipo.
Se han desarrollado varios criterios y metodologías para determinar la vida de anaquel de un
alimento o producto, algunos ejemplos son:
a) Estudio bibliográfico. La vida de anaquel se obtiene de un producto análogo previamente

publicado en la literatura o basándose en la información provista por las compañías
productoras.
b) Tiempo de recambio (Turnover time). Es el tiempo promedio que un producto permanece
en los anaqueles comerciales; este tiempo se estima haciendo un registro de las ventas en
las tiendas de autoservicio. Esta metodología no estima el valor “real” de vida de anaquel,
solamente la vida de anaquel mínima requerida, asumiendo que el producto aún es
aceptable transcurrido este tiempo de recambio.
c) Estudio de punto final. En esta metodología, se obtienen muestras al azar del producto en
tiendas de autoservicio y se realizan pruebas de laboratorio para estimar su calidad. De
estos resultados se obtiene una vida de anaquel con mayor validez que en las
metodologías anteriores debido a que el producto ha estado expuesto a condiciones reales
de manejo y ambientales, durante el almacenamiento en tienda, venta y transporte.
d) Pruebas de envejecimiento acelerado (ASLT: Accelerated Shelf Life Testing). Este tipo de
estudios se llevan a cabo en laboratorios especializados, en los cuales las condiciones
ambientales se controlan con el fin de producir un deterioro en el producto de una manera
más rápida que la que tendría lugar normalmente. En este método se requiere medir el
efecto que tienen estas condiciones ambientales en la vida de anaquel. En las pruebas de
envejecimiento acelerado se asume que los principios de cinética química pueden
aplicarse para cuantificar los efectos que tienen factores como la temperatura, humedad,
aire y luz en las reacciones de deterioro. Cuando un alimento se somete a condiciones
ambientales en las que uno de los factores se mantiene en un nivel superior al normal, el
grado de deterioro se acelerará, por lo que se observarán signos en el alimento que
indicarán cuando ya no es apto para el consumidor.
Este método es particularmente aplicable para productos en los que la vida de anaquel
anticipada es larga y en donde la práctica de almacenar muestras por varios meses o
inclusive años podría causar un retraso innecesario para el lanzamiento del producto al
mercado. La ASLT es una manera de “comprimir” la vida de anaquel de un producto dentro
de un lapso de tiempo, usualmente aumentando la temperatura de almacenamiento. Esto
significa que los cambios que ocurren en un producto durante su almacenamiento se
aceleran y son utilizados para estimar la vida de anaquel a una temperatura de
48
almacenamiento real. Los resultados de ASLT se necesitan interpretar con cuidado ya que
en algunos casos los principios de esta metodología no son aplicables.
Durante el desarrollo de la ASLT es necesario tener en cuenta ciertos aspectos, entre ellos se
encuentran:
 Diseño del estudio:

Definir la variable que se evaluará de acuerdo al objetivo del estudio, es decir, si por ejemplo, se
desea estimar el efecto de la humedad relativa en el producto, entonces es necesario establecer
las distintas condiciones de humedad a las cuales se almacenará el producto.
 Muestreo en pruebas de almacenamiento:

El producto se debe almacenar en el mismo empaque en el que se va producir a gran escala y
comercializar, todos estos empaques deben ser almacenados bajo las mismas condiciones.
Mientras que el número de muestras a analizar dependerá del tipo de producto, uso esperado,
caducidad prevista o requerida y las pruebas para determinar sus cambios durante el
almacenamiento.
 Condiciones de temperatura de almacenamiento

Los productos deben ser almacenados al menos bajo tres condiciones distintas:
a) Condiciones óptimas: Proporcionan datos sobre el tiempo de caducidad más largo que
pueda tener el producto. Por ejemplo, la temperatura óptima de un yogurt es cercana a la
temperatura de congelación, mientras que la de una leche ultrapasteurizada es la
temperatura de refrigeración.
b) Condiciones típicas: Proporcionan datos para establecer el tiempo de caducidad para la
mayoría de la producción en cualquier época en que se elabore. Estas condiciones son a
las que estará sometido el producto una vez que haya sido producido, durante su
almacenamiento y mientras esté en el anaquel para su venta. Siguiendo con el ejemplo del
yogurt, la temperatura típica es la de refrigeración y para la leche ultrapasteurizada es a
una temperatura aproximada de 25 °C.
c) Condiciones adversas: Los datos obtenidos al someter a un producto a estas condiciones,
son útiles para establecer el tiempo mínimo de conservación. Estas condiciones se pueden
dar cuando el producto es sometido a temperaturas mayores a las de condiciones típicas.
Para el yogurt puede ser a partir de 27 °C, debido a que es un producto que se obtiene de
la fermentación de la leche y por lo tanto los microorganismos presentes en el yogurt
inician la fermentación; mientras que para la leche ultrapasteurizada es a partir de 37 °C
49
donde se empiezan a acelerar las reacciones de deterioro, como por ejemplo:
pardeamiento no enzimático y oxidación de lípidos.
Cuestionario previo
1. Calcular el contenido energético (kcal/100 g y kJ/100 g) y de macronutrimentos del producto en
estudio. Considerar la información nutrimental indicada en los empaques de las materias primas
o la proporcionada por el profesor. Expresar los resultados por 100 g de producto.
2. De acuerdo a la composición del producto en estudio, ¿qué reacciones de deterioro podrían
ocurrir durante el almacenamiento bajo condiciones de temperatura óptima, típica y adversa?
Fundamentar la respuesta.
3. Elaborar una tabla y describir en ella el fundamento de las metodologías analíticas para
determinar: acidez titulable, índice de Kreiss, contenido de humedad y vitamina C.
Objetivo
Identificar los parámetros que influyen en el deterioro y estabilidad de un producto alimenticio y
realizar pruebas de envejecimiento acelerado, para que el estudiante estime la vida de anaquel y
proponga la fecha de caducidad del mismo.
Procedimiento
I. Formulación y envasado del producto alimenticio

Con el fin de estudiar el deterioro de un producto alimenticio y estimar su vida de anaquel, se
elaborará un producto alimenticio a base de leche entera en polvo y con un alto contenido lipídico y
proteínico. Preparar el producto alimenticio empleando la formulación de la Tabla 1.
Tabla 1. Formulación general del producto alimenticio

Ingrediente g/ 100 g
Leche entera en polvo 57.7
Lípido* 20.0
Vitamina C 1.0
Fécula de maíz 21.3
*El profesor indicará la fuente de lípidos que trabajará cada equipo.
Para la preparación y envasado del producto alimenticio se requiere de lo siguiente:
50
Materias primas
 Aceite de soya o manteca vegetal (INCA®)*
 Fécula de maíz (Maizena®)*
 Leche entera en polvo (Fortileche®)*
Material
 Bolsas de polietileno con doble cierre (Ziploc®)
 Cucharas
 Espátula
 Etiquetas adhesivas*
 Recipientes para mezclar
 Recipientes para pesar
Reactivos
 Ácido ascórbico R.A.
Equipo
 Balanza granataria
 Cámaras de vida de anaquel
 Refrigerador
*Material que deberá traer el estudiante de acuerdo a la cantidad a preparar del producto
alimenticio indicada por su profesor.
Pesar los ingredientes (±0.1 g) y mezclar hasta obtener un producto homogéneo. Para la adición
de antioxidante de la formulación del diseño experimental B, disolverlo en la menor cantidad de
etanol posible e incorporarlo a la fuente de lípidos con agitación suave.
Una vez preparado el producto, envasar en bolsas de polietileno con doble cierre tipo Ziploc®
como se indica a continuación:
1 bolsa con 800 g de producto
5 bolsas de 60 g de producto c/u
Elaborar una etiqueta para cada bolsa (NO escribir con marcador sobre la bolsa directamente) en
la que se indique el número de tiempo de muestreo del producto, fecha de elaboración, número de
equipo y la condición de almacenamiento (ver apartado II) a la que será sometida la muestra y que
le será asignada por el profesor.
51
La bolsa que contienen 800 g de producto se utilizará para el bioensayo de Relación de Proteína
Neta (RPN), mientras que las bolsas con 60 g de producto se utilizarán para las pruebas ASLT
como se explica en el apartado III.
II. Condiciones de almacenamiento para la ASLT
El estudio de evaluación de vida de anaquel tendrá una duración aproximada de 2 meses, cada
producto se almacenará como se indica en la Tabla 4.
Tabla 4. Condiciones de temperatura para ASLT (ºC)*

Control Óptima
Temperatura 1 Típica
Temperatura 2 Adversa
Temperatura 3 Adversa
*Cada equipo almacenará su producto a la temperatura que le sea asignada por su profesor.
III. Parámetros de evaluación de deterioro
Para determinar la vida de anaquel del producto, observar y evaluar los efectos que producirá el
almacenamiento a distintas condiciones de temperatura aplicando principios de cinética química.
Los parámetros a cuantificar son:
 Sensoriales: Color
 Físicos: Humedad
 Químicos: deterioro de lípidos y acidez titulable
 Nutrimentales: Vitamina C y Relación de Proteína Neta (RPN)
Las determinaciones se realizarán al inicio del periodo de almacenamiento (t0) y posteriormente

cada quince días, a excepción de la determinación de RPN que se realizará al término del
almacenamiento para la prueba ASLT.
Las metodologías de estas determinaciones se encuentran en el Anexo 1 al final de este protocolo.
52
a) Emplear el siguiente formato para recopilar los datos obtenidos durante el estudio.
Producto:
Condiciones de almacenamiento:
Periodo de Deterioro de Vitamina Color
Humedad Acidez
tiempo lípidos C (Guía Pantone)
________ ________
(15 días) ________ ________
0
1
2
3
4
b) Calcular el tiempo de vida de anaquel respecto a los cambios observados en la acidez

titulable, contenido de vitamina C y deterioro lipídico del producto, empleando el modelo
cinético de Arrhenius. Incluir en el reporte el siguiente formato para los parámetros
analizados y discutir los resultados.
Parámetro evaluado k Tiempo de vida útil

Temperatura (°C)
-1
____________________ (min ) (meses)
Energía de activación
5
___________________
k0
18
____________________
[D]0
30
____________________
[D]t
40
____________________
Producto:___ Tiempo de vida útil (meses)

T (°C) Deterioro de lípidos Vitamina C Acidez titulable
5
18
30
40
53
c) Calcular la RPN y RNPa en forma individual y el valor promedio con su correspondiente
desviación estándar. Con el promedio y desviación, calcular el porcentaje del coeficiente
de variación (%CV) del bioensayo, el cual debe ser ≤20%; si esto no se cumple, eliminar el
valor más alto y más bajo y recalcular el valor de RPNa y %CV.
Anexar los resultados de RPNa expresados en valores promedio y desviación estándar e
incluir las curvas de crecimiento y alimento acumulado, así como la discusión del RPN del
producto para todas las temperaturas de estudio.
d) Concluir cuál de los parámetros estudiados es el más indicado para establecer la vida de
anaquel de su producto y proponer una fecha de caducidad a partir de la fecha de
elaboración del mismo; discutir cuáles otros parámetros deberían incluirse en el estudio de
vida de anaquel. Proponer cuál sería el empaque y las condiciones de almacenamiento
más adecuadas para este producto. Comparar el tiempo de vida de anaquel obtenido con
alimentos o productos similares.
54
Referencias
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Ed.; 15a ed.; Association of Official Analytical Chemists: Arlington, 1990, Vol 1 & 2.
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anisidine value. Sampling and analysis of commercial fats and oils. Illinois, 2006.
Bender, A.; Doell, B. Br. J. Nutr. 1957, 11, 140-147.
Brody, A.; Strupinsky E.; Kline, L. Active packaging for food applications; CRC Press: Florida, 2001.
Codex Committee on Food Hygiene. Code of Hygienic practice for refrigerated packaged foods with
extended shelf life; CAC/RCP 46; Codex Alimentarius Commission: 1999. [Online]
http://www.codexalimentarius.org/standards/list-of-
standards/es/?provide=standards&orderField=fullReference&sort=asc&num1=CAC/RCP
Codex Committee on Food Labelling. Norma general para el etiquetado de los alimentos
preenvasados; CODEX STAN 1; Codex Alimentarius Commission: 1985. [Online]
http://www.codexalimentarius.org/standards/list-of-
standards/es/?provide=standards&orderField=fullReference&sort=asc&num1=CAC/RCP
FAO/WHO/UNU. Energy and protein requirements; World Health Organization Technical Report
Series 724; WHO: Rome, 1985.
Kirk, R.; Sawyer, R.; Egan, H. Composición y análisis de alimentos de Pearson; 2ª. ed.; Compañía
Editorial Continental: México. 1996.
Labuza, T. Shelf-life dating of foods; Food & Nutrition Press: Westport, CO, 1982.
Man, C.; Jones, A. Shelf life evaluation of foods; Blackie Academic & Professional: London, 1994.
Nielsen, S. (ed). Food analysis. Laboratory Manual;. Kluwer Academic Press: New York, 2003.
Robertson, G. Food packaging: principles and practice; 2nd ed.; CRC Press/Taylor & Francis: Boca
Raton, Fl, 2006.
Sarwar, G.; Blair, D.; Friedmann, M.; Gumbmann, M.; Hackler, L.; Pellett, P.; Smith, T. J. AOAC Int.
1984, 67: 976-981.
55
ANEXO 1. METODOLOGÍAS DE LA UNIDAD 3
I) EVALUACIÓN SENSORIAL DE COLOR. USO DE LA GUÍA DE COLOR: PANTONE
Material
 Espátula 1
 Guía de color Pantone 1
 Hoja de papel 1
Procedimiento
Para comparar el color de la muestra con la guía de color Pantone es necesario usar las mismas
condiciones de luz a lo largo del estudio.
Colocar una hoja de papel blanca sobre una de las mamparas que se encuentran en la parte
posterior del laboratorio. Pesar de 4 a 6 g de muestra y formar una capa delgada sobre la hoja
(aproximadamente 2 mm de espesor). El analista debe colocarse de frente a la hoja con la
muestra. Comparar el color de la muestra con la guía de colores que se le proporciona. La guía de
color Pantone indica el número de color, seguido de un sufijo que señala el tipo de material a
imprimirse (C: con recubrimiento, U: mate) así como la fórmula para obtener dicho color.
Registrar dicha información una vez que haya comparado su muestra con la guía de color.
56
II) DETERMINACIÓN DE HUMEDAD. MÉTODO DE SECADO EN TERMOBALANZA
(Nielsen, 2003)
Material
 Espátula 1
Equipo
 Termobalanza
Procedimiento
Encender el equipo, tarar y pesar de 0.5 a 1 g de muestra (puede variar dependiendo del modelo
de equipo utilizado, esperar las indicaciones de sus profesores) en la charola de aluminio,
formando una capa lo más homogénea posible. Realizar la determinación y registrar la pérdida de
peso o el porcentaje de humedad (dependiendo del modelo de equipo utilizado) cuando ya no haya
variación en la lectura o bien, cuando el equipo señale que se ha terminado la determinación.
Cálculos
Calcular el contenido de humedad y expresarlo como porcentaje.
Nota: Según el modelo del equipo regular la intensidad de la lámpara para evitar que la muestra se
queme y el resultado sea erróneo.
57
III) EXTRACCIÓN DE GRASA POR LOTES
(Kirk, et al., 1996)
Material
 Manguera para vacío 2
 Papel aluminio
 Papel filtro
 Punta de plástico 2
 Tapón de hule horadado 2
Reactivos
 Hexano Q.P.
Equipo
 Baño con control de temperatura controlada
 Parrilla de calentamiento con agitación
 Rotaevaporador
Procedimiento
1. Pesar 10 g de muestra en un matraz Erlenmeyer de 125 mL.
2. Agregar 30 mL de hexano y tapar con papel aluminio.
3. Extraer la grasa durante 45 minutos con agitación a 25 °C, revise que la parrilla no tenga
encendido el modo de calentamiento. El matraz debe estar tapado con papel aluminio
durante la extracción.
4. Transcurrido este tiempo, dejar sedimentar la muestra y filtrar con mucho cuidado
recolectando el filtrado en otro matraz Erlenmeyer de 125 mL.
5. Evaporar el disolvente con ayuda del rotaevaporador. Una vez evaporado el disolvente y
con el matraz a temperatura ambiente puede pesar y utilizar la grasa extraída.
Guardar los desechos debidamente etiquetados para su posterior tratamiento.
58
IV) DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE DE KREISS
(Kirk, et al., 1996)
Material
 Pipeta Pasteur con bulbo 1
 Pipeta de 1 mL 1
 Propipeta 1
Reactivos
 Ácido acético glacial R.A.
 Ácido tricloroacético R.A.
 Diclorometano R.A.
 Etanol R.A.
 Floroglucinol R.A.
Equipo
 Baño con control de temperatura de temperatura controlada
I. Disolución de ácido tricloroacético al 30% en ácido acético glacial. Preparar la disolución
en la campana y utilizar lentes de seguridad y guantes.
II. Disolución de floroglucinol al 1% en ácido acético glacial. Preparar la disolución en la
campana y utilizar lentes de seguridad y guantes.
Procedimiento
1. Pesar de 150 a 500 mg de grasa en un vaso de precipitado de 50 mL y disolver con en 5 mL
de diclorometano.
2. Añadir 10 mL de una disolución de ácido tricloroacético al 30% en ácido acético glacial
(disolución I) y 1 mL de floroglucinol al 1% en ácido acético glacial (disolución II).
59
3. Agitar e incubar por 15 min, en un baño de agua a 45 °C, dejar enfriar a 25 °C y agregar 4
mL de etanol.
4. Medir la absorbancia de la muestra a 540 nm ajustando el espectrofotómetro con blanco de
reactivos.

tratamiento.
Cálculos
El Índice de Kreiss se expresa como absorbancia a 540 nm/g de grasa.
60
V) DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE DE p-ANISIDINA (AOAC CD18-90)
Material
 Pipeta Pasteur y bulbo 1
 Propipeta 1
Reactivos
 Hexano
 p-anisidina RA
Equipo
 Baño de temperatura controlada
I. Disolución de p-anisidina: Pesar 0.2500 g de p-anisidina y disolver en 100 mL de
ácido acético glacial. Preparar la disolución en la campana y utilizar lentes de
Procedimiento
1. Pesar 0.5 a 3.0 g de grasa en un matraz aforado de 25 mL y llevar al aforo con hexano.
2. Medir la absorbancia de la disolución a 350 nm (A1) ajustando el espectrofotómetro a cero
con hexano.
3. Medir 5 mL de la disolución de la muestra con una pipeta y colocarla en un tubo de ensayo
y adicionar 1 mL de la disolución de p-anisidina. Agitar y colocar en el baño a temperatura
controlada (27 °C). Realizar por duplicado.
4. De manera similar al paso anterior preparar un blanco de reactivos para ajustar a cero el
espectrofotómetro.
5. Transcurridos exactamente 10 minutos medir la absorbancia de la muestra (A2) a una
longitud de onda de 350 nm. Ajustar el espectrofotómetro con el blanco de reactivos
preparado en el paso 4.
61
tratamiento.
Cálculos
El valor de p-anisidina se calcula con la siguiente fórmula:
25 × (1.2𝐴2 − 𝐴1 )
𝑝𝐴𝑉 =
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑔𝑟𝑎𝑠𝑎
Donde:
A1= Absorbancia del blanco de muestra
A2=Absorbancia de la muestra
62
VI) DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDO ASCÓRBICO EN ALIMENTOS
(AOAC, 967.21)
Material
 Bureta de 25 ó 50 mL 1
 Espátula 1
 Embudo de tallo corto 1
 Matraz Erlenmeyer de 125 ó 250 mL 2
 Papel filtro
 Pinza de tres dedos con nuez 1
 Piseta 1
 Probeta 50 mL 1
Reactivos
 2,6-diclorofenol-indofenol R.A.
 Ácido ascórbico anhidro R.A.
 Bicarbonato de sodio R.A.
Equipo
I. Disolución de ácido acético al 5%. Preparar la disolución en la campana y utilizar
II. Disolución patrón de ácido ascórbico (1 mg/mL), llevar al volumen de aforo con la
disolución I.
III. Disolución de 2,6-diclorofenol-indofenol valorada: pesar 100 mg de 2,6-diclorofenol-
indofenol con 50 mg de bicarbonato de sodio, disolverlos con agua destilada y llevar a un
litro.
Procedimiento
Valoración del 2,6-diclorofenol-indofenol
63
1. En un matraz Erlenmeyer colocar dos alícuotas por separado de 1 mL de la disolución
patrón de ácido ascórbico (disolución II).
2. Adicionar a cada una 9 mL de disolución de ácido acético al 5% (disolución I).
3. Titular con la disolución de 2,6-diclorofenol-indofenol (disolución III) hasta que persista el
color rosado por lo menos durante 10 segundos. La cantidad utilizada se considera como
el volumen de 2,6-diclorofenol-indofenol necesario para oxidar un miligramo de ácido
ascórbico.
Valoración de la muestra
1. Pesar 0.4 g de la muestra en un vaso de precipitado de 100 mL, (esta cantidad puede
variar dependiendo del contenido esperado de ácido ascórbico), e inmediatamente
homogeneizar con 50 mL de ácido acético al 5% (disolución I).
2. Trasvasar a un matraz volumétrico de 100 mL y llevar al aforo con agua destilada, dejar
que sedimente la mayor cantidad de material insoluble y filtrar a través de papel filtro.
3. Tomar dos alícuotas de 10 mL y colocar cada una en un matraz Erlenmeyer de 125 mL.
4. Titular inmediatamente con la disolución valorada de 2,6-diclorofenol-indofenol (disolución
III) hasta que persista el color rosa tenue por lo menos 10 segundos.

tratamiento.
Cálculos
Con el volumen de disolución de 2,6-diclorofenol-indofenol utilizado en la titulación del estándar de
ácido ascórbico y el volumen utilizado en la muestra, calcular el contenido de ácido ascórbico en
mg/100 g de muestra, se debe considerar el volumen de aforo y de la alícuota de la muestra.
64
VII) ACIDEZ TITULABLE EN LECHE EN POLVO
(AOAC, 947.05)
Material
 Bureta de 50 mL graduada en 0.1 mL 1
 Espátula 1
 Piseta 1
Reactivos
 Hidróxido de sodio
 Fenolftaleína
Equipo
 Parrilla de agitación
 Potenciómetro 1
I. Disolución de fenolftaleína al 1% en alcohol etílico.
II. Disolución de hidróxido de sodio 0.1 N valorado.
Procedimiento
Pesar de 9 a 10 g de la muestra y colocar en un vaso de precipitado de 250 mL, adicionar 100 mL
con agua destilada, añadir de 2 a 3 gotas de fenolftaleína (disolución I) y agitar vigorosamente;
posteriormente titular con la disolución de hidróxido de sodio 0.1 N (disolución II) empleando un
potenciómetro hasta alcanzar un pH de 8.3±0.05.
Guardar los desechos en frascos debidamente etiquetados para su posterior tratamiento.
Cálculos
Exprese el resultado como porcentaje de ácido láctico.
65
VIII) DETERMINACIÓN DE LA RELACIÓN DE PROTEÍNA NETA (RPN)
(Bender y Doell, 1957; Sarwar G., et al., 1984)
Materias primas
 Aceite de maíz o cártamo**
 Caseína U.S.P.
 Celulosa U.S.P.
 Colina U.S.P.
 Fécula de maíz (Maizena)**
 Glucosa U.S.P.
 Manteca vegetal (INCA®)**
 Mezcla de minerales
 Mezcla de vitaminas
 Sacarosa**
**Material que deberá traer el estudiante de acuerdo a la cantidad que tendrá que elaborar indicada
por su profesor.
Material
 Espátula 1
 Recipientes para pesar**
Equipo
I. Disolución de colina al 50% p/v
Procedimiento
Preparación de la dieta para la prueba biológica

Con el fin de determinar la calidad proteínica de un alimento es necesario elaborar una dieta
isoproteínica e isoenergética con respecto a la dieta de referencia, que en la mayoría de los
estudios es caseína.
Para elaborar la dieta con el producto elaborado para las pruebas ASLT como fuente de proteína,
es indispensable contar con el análisis proximal del alimento en estudio para ajustar los
nutrimentos y que la dieta sea isoproteínica e isoenergética con respecto a la composición de la
66
dieta de referencia. Es importante hacer notar que la dieta debe aportar 10% de proteína, de tal
manera que se garantice que toda la proteína va a ser incorporada si la calidad de la misma es
buena.
Dieta de referencia (dieta de caseína)
Ingredientes g/100 g de dieta
Caseína (88.0% de proteína) 11.4
Sacarosa 22.0
Glucosa 19.0
Manteca vegetal 8.0
Aceite de maíz 6.0
Mezcla de sales 2.0
Mezcla de vitaminas 1.0
Colina (disolución al 50%) 0.4
Celulosa comercial 6.0
Total 100.0
En el método de RPN se requiere alimentar a un lote de ratas con una dieta libre de nitrógeno
(DLN), (exenta de proteína), que producirá una pérdida de peso corporal, la cual debe sumarse a
la ganancia en peso del lote de ratas alimentado con la dieta de la fuente de proteína a ensayar, ya
que se asume que la pérdida de peso corporal del lote de las ratas alimentado con la DLN, es
equivalente a las necesidades proteínicas para su mantenimiento. Como se ha mencionado
anteriormente, la RPN tiene la ventaja de evaluar proteínas de baja calidad; además, es un método
biológico relativamente corto, ya que estrictamente sólo se requiere de 10 días de
experimentación, debido a que es el tiempo razonable para mantener con vida a las ratas
alimentados con la DLN. Como ya se indicó, en este estudio se incluye un lote más al cual se le
sustituye el contenido de proteína de la dieta por cualquier hidrato de carbono (fécula de maíz,
sacarosa o glucosa); de manera que esta DLN también sea isoenergética respecto a la de
referencia:
Ingredientes g/100 g de dieta

Sacarosa 22.0
Glucosa 19.0
Manteca vegetal 8.0
Aceite de maíz o cártamo 6.0
Mezcla de sales 2.0
67
Mezcla de vitaminas 1.0
Colina (disolución al 50% p/v) 0.4
Celulosa comercial 6.6
Total 100.0
Realización de la prueba biológica
Material
 Bebedero 6
 Cernidor (de 2±0.5 mm de abertura) 1
 Comedero 6
 Dieta de la fuente de proteína de prueba (isoproteínica e isoenergética con respecto a la
dieta de referencia)
 Dieta de referencia (dieta de caseína)
 Espátula 1
 Franela o un trapo limpio 1
 Jaula individual de acero inoxidable 6
 Papel Manila (un pliego)
Equipo
 Balanza granataria para animales de laboratorio
Organismo de prueba
 24 Ratas macho Wistar de 21 a 23 días de edad (recién destetadas) con un intervalo de
peso entre ellos no mayor a 10 g.
Procedimiento
1. Pesar las ratas y ordenar los pesos en forma ascendente:
P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9…Pn.
2. Colocar seis ratas por lote en las jaulas individuales del rack siguiendo la distribución de “culebra
japonesa” (ver protocolo Determinación de la dosis letal media de cafeína en ratones).
3. Una vez distribuidas las ratas en las jaulas individuales, éstas deben de mantenerse con
alimento y agua ad libitum, en condiciones controladas de luz/oscuridad (12 h x 12 h),
temperatura de 23 a 24 ºC y una humedad relativa entre 30 a 35%, durante el periodo de
ensayo (10-11 días).
68
4. Colocar debajo de cada jaula una charola hecha con papel manila para recuperar el alimento
que haya desperdiciado la rata. Separar de las heces con la ayuda de un cernidor y considerar
el alimento real ingerido.
5. Pesar las ratas cada tercer día una vez iniciado el bioensayo y registrar el peso de cada rata y el
alimento ingerido considerando el alimento recolectado de la charola de papel manila.
6. Para llevar a cabo el control de datos, es necesario un formato para anotar adecuadamente los
resultados obtenidos a través del periodo de experimentación (ver hoja de vaciado de datos al
final de éste protocolo).
Cálculos
Al término de los 10 u 11 días de experimentación, calcular la RPN de cada una de las ratas, de
acuerdo a la siguiente fórmula:
[∆𝑃 𝑃𝑅𝑈𝐸𝐵𝐴 + |∆𝑃 𝐷𝐿𝑁 |]

𝑅𝑃𝑁 =
𝛴𝐴𝐼 × 𝐹
Donde:
P PRUEBA = Incremento de peso con la dieta de prueba al último día del estudio (g)
|P DLN |= Valor absoluto del decremento de peso con la DLN (g)
ΣAI = Alimento ingerido al término del estudio (g)
F = Factor de conversión unitario de alimento a proteína (% de proteína en la dieta/100)
Calcular la RPN ajustada (RPNa), para ello considerar el valor estandarizado de RPN de 4.1 a la
proteína de referencia.
𝑅𝑃𝑁𝐶𝐴𝑆𝐸Í𝑁𝐴 𝑆𝑇𝐷
RPN𝑎 = 𝑅𝑃𝑁𝑃𝑅𝑈𝐸𝐵𝐴
𝑅𝑃𝑁𝐶𝐴𝑆𝐸Í𝑁𝐴 𝐸𝑋𝑃
Donde:
RPN PRUEBA = RPN experimental de la proteína de prueba
RPN CASEÍNA STD = RPN de caseína estandarizado = 4.1
RPN CASEÍNA EXP = RPN de caseína experimental
69
HOJA DE REGISTRO DE DATOS
Rata:____________ Sexo: _____ Peso inicial (Pi): ________ Dieta: ___________ Fecha: ___________Comedero (g)_______
Tiempo (días)
Peso animal (P día)
Incremento acumulado (Pdía-Pi)
Alimento inicial (I)
Alimento final (F)
Alimento ingerido (AI=I-F)
Alimento acumulado (AI)día
Observaciones: __________________________________________________________________________
Rata:____________ Sexo: _____ Peso inicial (Pi): ________ Dieta: ___________ Fecha: ___________ Comedero (g)_______
Tiempo (días)
Alimento final (F)
Observaciones: __________________________________________________________________________
Rata:____________ Sexo: _____ Peso inicial (Pi): ________ Dieta: ___________ Fecha: ___________ Comedero (g) ______
Tiempo (días)
Alimento final (F)
Observaciones: __________________________________________________________________________
70
DIAGRAMA ECOLÓGICO
EVALUACIÓN SENSORIAL DE COLOR

GUÍA DE COLOR: PANTONE
Pesar de 4 a 6 g de
muestra
Formar una capa delgada sobre una hoja de

papel blanca (2 mm de espesor)
Comparar el color de la muestra con la guía de

color Pantone
R1
Tratamiento:
R1: Depositar la muestra en los residuos orgánicos.
71
DIAGRAMA ECOLÓGICO
DETERMINACIÓN DE HUMEDAD
MÉTODO DE SECADO EN TERMOBALANZA
Pesar de 0.5 a 1 g de muestra en

la charola de aluminio, de manera
uniforme
Realizar la determinación
Muestra seca
R1
Tratamiento:
R1: Depositar la muestra seca en los residuos orgánicos.
72
DIAGRAMA ECOLÓGICO
EXTRACCIÓN DE GRASA POR LOTES
Pesar 10 g de muestra + disolvente orgánico en un

matraz Erlenmeyer de 125 mL
Tapar el matraz con papel aluminio y agitar durante 45 min a

25 °C
Sedimentar y filtrar Papel filtro con

sedimento
Evaporar el disolvente en baño de agua a

T < 60 °C. con vacío R1
R2
Tratamiento:
R1: Colocar el papel filtro con muestra desengrasada en la campana para evaporar el disolvente
residual. Una vez seco, depositar en los residuos orgánicos.
R2: Colocar la grasa sobrante en un frasco de residuos previamente etiquetado.
73
DIAGRAMA ECOLÓGICO
DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE DE KREISS
Pesar de 150 a 500 mg de grasa extraída

+ 5 mL de diclorometano en un vaso de
precipitado de 50 mL
Añadir 10 mL de ácido tricloroacético al 30% y 1 mL de

floroglucinol al 1% ambos en ácido acético glacial
Agitar e incubar 15 min en baño de agua a 45 °C
Enfriar y agregar 4 mL de etanol
Medir la absorbancia a 540 nm
R1
Tratamiento:
R1: Neutralizar la fase orgánica y tratar con carbón activado (1%), agitando al menos durante 30
min; filtrar y enviar el residuo sólido a incineración. Con base en su relación costo-beneficio,
recuperar el disolvente para su reutilización.
74
DIAGRAMA ECOLÓGICO
DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE DE p-ANISIDINA
Pesar 0.5 a 3.0 g de grasa en un matraz volumétrico de 25 mL y

disolver y aforar con hexano
Medir la absorbancia de la disolución a 350 nm (A1) ajustando

el espectrofotómetro a cero con un blanco de reactivo.
R1 Medir con una pipeta 5 mL de la disolución de la muestra en

un tubo de ensayo y adicionar 1 mL de la disolución de p-
anisidina y mezclar.
De manera similar al paso anterior preparar un blanco de

reactivos para ajustar a cero el espectrofotómetro.
Transcurridos exactamente 10 minutos medir la absorbancia

de la muestra (A2)
R2
Tratamiento:
R1: Recuperar el disolvente para su reutilización.
R2: Neutralizar, recuperar el disolvente para su reutilización y enviar el residuo sólido a

incineración.
75
DIAGRAMA ECOLÓGICO
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDO ASCÓRBICO EN ALIMENTOS
Valoración 2,6-diclorofenol-indofenol Valoración de la muestra
Pesar 400 mg de muestra + 50 mL

Mezclar 1 mL de la disolución estándar de ácido acético al 5% en vaso de
ácido ascórbico + 9 mL ácido acético al 5% precipitado
en matraz Erlenmeyer de 250 mL
Aforar a 100 mL con agua

destilada y dejar sedimentar
Filtrar
Titular con 2,6-diclorofenol-indofenol hasta que Filtrado: tomar Papel filtro con
persista color rosado por 10 s alícuotas de 10 mL sedimento
R1
R2
R3
Tratamiento:
R1: Dejar secar el papel filtro con muestra en la campana y desechar en los residuos orgánicos.
R3: Tratar la disolución de ácido acético al 5% con 2,6-diclorofenol-indofenol con 1% de carbón
activado, agitar durante 1 h y dejar 24 h en reposo. Transcurrido el tiempo filtrar, neutralizar y
desechar en el drenaje. Enviar el residuo sólido a incineración.
76
DIAGRAMA ECOLÓGICO
ACIDEZ TITULABLE EN LECHE EN POLVO
Pesar de 9 a 10 g de muestra en vaso de precipitado

de 250 mL y llevar a 100 mL con agua destilada,
añadir de 2 a 3 gotas de fenolftaleína
Agitar
Titular con hidróxido de sodio 0.1 N (valorado) hasta

alcanzar un pH de 8.3 ± 0.05
R1
Tratamiento:
R1: Desechar en el drenaje una vez que ha sido neutralizada la disolución.
77
DIAGRAMA ECOLÓGICO
DETERMINACIÓN DE LA RELACIÓN DE PROTEÍNA NETA (RPN)
Preparación de dietas
Elaboración de “culebra japonesa” para la

distribución de las ratas
Colocar a las ratas en jaulas individuales con la

dieta correspondiente1
Alimento y agua ad libitum
Pesaje de alimento y de ratas cada tercer Charolas de papel

día2 manila
Término del bioensayo (10-11 días) R1
R2 R3
1Colocar debajo de cada jaula una charola elaborada con papel manila.
2Recuperar el alimento separándolo de las heces con la ayuda del cernidor y pesarlo.
Tratamiento:
R1: Desechar las charolas de papel manila con heces en los residuos biológicos. Regresar al
comedero correspondiente el alimento recuperado una vez que ha sido pesado.
R2: Desechar las dietas en los residuos orgánicos.
R3: Al término del bioensayo, entregar los animales al encargado del bioterio para su eutanasia en
cámara de CO2 y manejo de los cadáveres de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-062-
ZOO-1999.
78
CUESTIONARIO GENERAL UNIDADES IV Y V
1. De acuerdo al Codex Alimentarius, ¿cuál es la definición de un aditivo alimentario?

2. Indicar cuáles son los organismos nacionales e internacionales reguladores del uso de
aditivos alimentarios.
3. Elaborar una tabla indicando las categorías en las que se clasifican los aditivos de acuerdo
al Codex Alimentarius, su funcionalidad y 3 ejemplos de aditivos de cada categoría.
4. ¿Cuáles son los criterios que se consideran para seleccionar un aditivo alimentario para su
aprobación y para su aplicación?
5. Definir un aditivo GRAS, enlistar cuatro ejemplos e indicar en qué tipo de productos
alimenticios se emplean.
79
4.1 EFECTO DEL pH Y LA TEMPERATURA EN COLORANTES NATURALES
Introducción
Generalmente, los consumidores juzgan y seleccionan la calidad de un producto alimenticio debido
a su color; por lo tanto, existe una relación directa entre la percepción del color y su aptitud para el
consumo. De allí que desde tiempos remotos el hombre ha encontrado sustancias adecuadas para
la tinción.
Los colorantes son un grupo de aditivos que proporcionan el color deseado y esperado de cada
alimento o producto; es decir, proporcionan, refuerzan u homogeneizan su color para hacerlo más
apetecible. No se deben emplear de manera arbitraria, sino que la cantidad de estos aditivos en
cada alimento debe atender a la corrección de la pérdida de color producida por alguno de los
siguientes factores durante el proceso de elaboración o almacenamiento de un producto
alimenticio:
 Tecnológicos: altas presiones, deshidratación, congelación y escaldado.

 Fisicoquímicos: cambios de pH, luz, actividad acuosa y potencial redox.
 Bioquímicos: generados por microorganismos y sus metabolitos, así como reacciones de
pardeamiento enzimático y no enzimático, principalmente.
Todos los cambios producidos por estos factores hacen que el producto sea menos atractivo para
el consumidor y surja la necesidad de usar colorantes como aditivos. De acuerdo a la regulación
mexicana, existen 51 colorantes (naturales y sintéticos) permitidos para su uso en alimentos.
Los pigmentos naturales, incluyen a los carotenoides, xantófilas, antocianinas, betalaínas,

clorofilas, azafrán, ácido carmínico, caramelo, riboflavina y bióxido de titanio (TiO 2). Los colorantes
sintéticos o también llamados artificiales, se fabrican mediante síntesis química y no se encuentran
disponibles en la naturaleza.
Los vegetales de hojas verdes contienen pigmentos, entre ellos la clorofila, responsables del color,
y los carotenos cuya presencia no es tan evidente, ya que habitualmente su color no alcanza a
manifestarse. Las moléculas de clorofila se encuentran estrechamente unidas a lípidos, proteínas y
lipoproteínas. Entre las clorofilas más abundantes se encuentra la a y la b, siendo la a la más
abundante.
Existen diferentes métodos químicos e instrumentales que ayudan a cuantificar el color de estos
pigmentos. Además, en los últimos tiempos, el avance tecnológico enfocado al análisis
instrumental ha permitido la evaluación de atributos como el color, para ayudar a cumplir con las
expectativas del consumidor.
80
Los instrumentos de medición del color buscan simular la manera en la cual los ojos humanos ven
el color de un objeto, bajo determinadas condiciones de iluminación y proporcionar una medida
cuantitativa. Así, la evaluación instrumental del color, considerando las características específicas
de un determinado tipo de alimento, permite la evaluación adecuada del mismo, una vez
seleccionadas las condiciones de análisis y la preparación de la muestra.
Actualmente, se conocen dos grupos de aparatos para la medida del color de los alimentos: los
espectrofotómetros de transmisión y de reflexión y los fotocolorímetros triestímulos.
El colorímetro es un instrumento analítico basado en la espectrofotometría, permitiendo la

cuantificación de diferencias en coloración no perceptibles por el ojo humano, lo cual tiene una
amplia aplicación en la medición de variaciones de color en alimentos. Los colorímetros usan
sensores que simulan el modo en que el ojo humano percibe el color, asignando parámetros de
medición consistentes a cada color, independientemente de las condiciones ambientales.
Cuestionario previo
1. ¿Cómo se clasifican los colorantes utilizados en alimentos?
2. Elaborar un cuadro comparativo sobre las ventajas y desventajas del uso de colorantes
naturales y artificiales. Proporcionar ejemplos del uso de dichos colorantes en productos
alimenticios y su nivel de uso.
3. Dibujar las estructuras de las moléculas de la clorofila a y b, resaltando sus diferencias
estructurales.
4. Indicar en qué disolventes son solubles las clorofilas.
5. Investigar el fundamento del colorímetro triestímulo (CIELab).
6. Consultar la densidad de todos los disolventes que utilizarán en esta práctica.
81
4.1.1 EFECTO DE LA TEMPERATURA Y EL pH SOBRE LA CLOROFILA
A. DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE CLOROFILA
Objetivo
Determinar el contenido de clorofila mediante el método AOAC 942.04; explicar y relacionar los
cambios de color en la clorofila al ser sometida a diferentes tratamientos térmicos y de pH, con los
cambios estructurales ocurridos en la molécula para que el estudiante determine las ventajas y
desventajas de su aplicación como pigmentos en la industria alimentaria.
Muestra
50 g de espinaca en trozos. El profesor asignará al equipo responsable de traer la muestra.
Material
 Agitador de vidrio 2
 Embudo de Buchner 1
 Embudo de separación de 250 mL 1
 Embudo de vidrio de talle corto 2
 Espátula 1
 Manguera para vacío 1
 Matraz aforado de 50 mL 1
 Matraz Kitasato de 100 mL 1
 Papel filtro
 Piseta 1
Reactivos
 Acetona R.A
 Ácido acético glacial R.A
 Arena de mar o carbonato de calcio
 Éter etílico R.A
 Hidróxido de sodio R.A.
82
 Sulfato de sodio anhidro R.A
Equipo
 Parrilla de calentamiento
II. Disolución de acetona al 85% (v/v)
III. Disolución de hidróxido de sodio 1N.
Procedimiento
Preparación y tratamiento de la muestra

Colocar 1 g de espinaca en trozos en un vaso de precipitado de 100 mL y someter a las diferentes
condiciones de pH y temperatura señaladas en la Tabla 1. El profesor asignará a cada equipo el
tratamiento que trabajará durante la práctica.
Tabla 1. Tratamientos de pH o Temperatura
Lote pH Temperatura
CONTROL ST* ST*
1 Ácido acético 5% (disolución I) ST*
2 NaOH 1N (disolución III) ST*
3 ST* Ebullición
4 ST* En frío
5 Ácido acético 5% (disolución I) Ebullición
6 Ácido acético 5% (disolución I) En frío
7 NaOH 1N (disolución III) Ebullición
8 NaOH 1N (disolución III) En frío
*ST: sin tratamiento

tratamiento.
83
INDICACIONES IMPORTANTES:
a) El tratamiento térmico en todos los lotes será por 5 minutos.
b) Para los lotes 1 y 2 mezclar 3 mL de la disolución indicada con 25 mL de agua destilada.
Agregar los trozos de espinaca y tomar el tiempo.
c) Para los lotes 3 y 4 llevar 25 mL de agua destilada a la condición de temperatura indicada
(a ebullición o en frío en baño de hielo por 5 min), y una vez alcanzada dicha condición,
añadir los trozos de espinaca y tomar el tiempo.
d) Para los lotes 5 y 7 mezclar 3 mL de la disolución indicada con 25 mL de agua destilada.
Calentar la disolución resultante y hasta que ésta haya alcanzado el punto de ebullición,
agregar los trozos de espinaca y tomar el tiempo.
e) Para los lotes 6 y 8 mezclar 3 mL de la disolución indicada con 25 mL de agua destilada.
Enfriar la disolución resultante durante 5 minutos en baño de hielo, agregar los trozos de
espinaca y tomar el tiempo.
f) Al término de cada tratamiento escurrir la muestra inmediatamente y comparar los cambios
de color de cada lote respecto al control. Anotar sus observaciones y proceder con el
protocolo de extracción de la clorofila en la muestra.
Extracción
1. Colocar en el mortero el gramo de espinaca sometida a la condición de pH y/o temperatura
indicada, agregar 0.1 g de arena o carbonato de calcio, 4 mL de acetona al 85%
(disolución II) y moler el tejido.
2. Adicionar 20 mL de acetona al 85% (disolución II) y transferir cuidadosamente el extracto
resultante a un embudo Büchner provisto de papel filtro y filtrar al vacío.
3. Realizar dos lavados más de 15 mL con acetona al 85% (disolución II) a la pulpa de las
hojas, juntar los tres volúmenes de filtración y colocarlos en un embudo de separación.
4. Adicionar 50 mL de éter y lavar la fase orgánica; para ello, adicionar 50 mL de agua
destilada e invertir 2-3 veces el embudo con cuidado y liberar la presión interna. Después,
dejar que se separen las fases y descartar la fase acuosa. De la misma forma, realizar un
segundo lavado a la fase orgánica con 30 mL de agua destilada. Al final del lavado,
descartar la fase acuosa.
5. A la fase orgánica, adicionar sulfato de sodio anhidro para eliminar agua remanente y
trasvasar a una probeta. Enjuagar el sulfato de sodio con el mínimo de volumen de éter
y vaciar en la probeta de fase orgánica. Medir el volumen final y mantener el extracto en un
baño de hielo.
84
Determinación espectrofotométrica
Tomar una alícuota y leer a 660 nm, si el valor de la absorbancia no se ajusta en el
intervalo de 0.2-0.8, realizar una dilución del extracto. Leer también la absorbancia de las
alícuotas a 642.5 nm.
Cálculo de la concentración de clorofila

Emplear las siguientes ecuaciones:
(1) Clorofila total (mg/L) = 7.12 A660.0 + 16.8 A642.5
(2) Clorofila a (mg/L) = 9.93 A660.0 – 0.777 A642.5
(3) Clorofila b (mg/L) = 17.6 A642.5– 2.81 A660.0
Calcular la concentración en mg/g de espinaca de la clorofila total, a y b, así como el porcentaje de
pérdida del colorante en cada tratamiento al que fue sometida. Considerar los resultados del lote
control como el 100% esperado del colorante. Discutir el cambio en el color observado y la pérdida
de colorante en cada tratamiento con la estabilidad de la estructura de la clorofila. Señalar las
condiciones en que hay un menor porcentaje de pérdida en la concentración de colorofila.
85
Referencias
AOAC. Official Methods of Analysis of AOAC International; Cunniff, P., Ed.; 16a ed.; Association of
Analytical Chemists: Gaithersburg, MD, 1998.
Baduí, S., 2006. Pigmentos. En: I. Guerrero, E. López y R. Armenta. Eds. Química de Alimentos.
Cuarta Edición. Pearson Addison Wesley.
Cabrera, S. Estimación de la concentración de clorofila a y feopigmentos: una revisión
metodológica. En: Embalses, fotosíntesis y productividad primaria; Bahamonde, N.;
Cabrera, S.; Eds.; Alfa-Beta Ediciones: Santiago, 1984.
Durán, L. Revista de Agroquímica y Tecnología de los Alimentos, 1980, 20 (1), 1-12.
Guerrero, I.; López, E.; Armenta, R. Pigmentos. En: Química de Alimentos; Badui, S., Ed.; 4ª ed.;
Pearson Educación: México, 2006.
86
B. MEDICIÓN INSTRUMENTAL DE LA INTENSIDAD DE COLOR
Objetivo
Establecer e identificar los cambios de intensidad de color de una muestra de chícharo con los
diferentes tratamientos térmicos y de pH, mediante el uso del colorímetro, para que el estudiante
se familiarice con el uso de dicho instrumento y las ventajas que éste ofrece.
Muestras
200 g de chícharos crudos
Material
 Espátula 1
 Plástico adherente (Kleen pack)
Reactivos
 Ácido acético glacial R. A
 Hidróxido de sodio R. A.
Equipo
 Colorímetro Minolta CM3600D
 Parrilla eléctrica
II. Disolución de hidróxido de sodio 1N.
Procedimiento
Colocar 10 g de chícharo en un vaso de precipitado de 100 mL y someter a las diferentes
condiciones de pH y temperatura señaladas en la Tabla 1. El profesor asignará a cada equipo el
tratamiento que trabajará durante la práctica.
87
Tabla 1. Tratamientos de pH o Temperatura
Lote pH Temperatura
CONTROL ST* ST*
1 Ácido acético 5% (disolución I) ST*
2 NaOH 1N (disolución III) ST*
3 ST* Ebullición
4 ST* En frío
5 Ácido acético 5% (disolución I) Ebullición
6 Ácido acético 5% (disolución I) En frío
7 NaOH 1N (disolución III) Ebullición
8 NaOH 1N (disolución III) En frío
*ST: sin tratamiento

tratamiento.
INDICACIONES IMPORTANTES:
a) El tratamiento térmico en todos los lotes será por 5 minutos.
b) Para los lotes 1 y 2 mezclar 3 mL de la disolución indicada con 25 mL de agua destilada.
Agregar los chícharos y tomar el tiempo.
c) En los lotes 3 y 4 llevar 25 mL de agua destilada a la condición de temperatura indicada (a
ebullición o en frío en baño de hielo por 5 min), y una vez alcanzada dicha condición,
añadir los chícharos y tomar el tiempo.
d) Para los lotes 5 y 7 mezclar 3 mL de la disolución indicada con 25 mL de agua destilada.
Calentar la disolución resultante y hasta que ésta haya alcanzado el punto de ebullición,
agregar los chícharos y tomar el tiempo.
e) Para los lotes 6 y 8 mezclar 3 mL de la disolución indicada con 25 mL de agua destilada.
Enfriar la disolución resultante durante 5 minutos en baño de hielo, agregar los chícharos y
tomar el tiempo.
f) Al término de cada tratamiento escurrir la muestra inmediatamente y comparar los cambios
de color de cada lote respecto al control. Anotar sus observaciones y proceder con la
medición de la intensidad de color con el colorímetro.
Preparación de la muestra
Elegir cinco chícharos de cada tratamiento y de la muestra control y envolver cada pieza con un
trozo de plástico adherente. Nota: Eliminar todas las burbujas que se formen en el área en
donde se realizará la medición, ya que esto puede afectar la determinación.
88
Medir la diferencia de color para cada muestra con ayuda del colorímetro Minolta bajo las
condiciones de análisis que se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Condiciones de análisis para evaluar intensidad de color en chícharo mediante el

colorímetro Minolta CM3600D
Parámetro Condición o Valor
No. de disparos o flashes 1
Estándar Nulo/Muestra seleccionada
Energía UV Incluida
Componente especular (SC) Excluido
Lente o área de visión Pequeña (Small)
Iluminante D65 (Luz de día, natural 6,504 K)
Detector 10˚
Sistema de reporte de color CIE L*a*b*
a) Anexar una tabla con todos los datos obtenidos del colorímetro Minolta CM3600D
(parámetros colorimétricos a, b y L) para cada chícharo evaluado en los distintos
tratamientos.
b) Realizar un análisis de varianza y una prueba de diferencia de medias (nivel de
significancia p= 0.05) para establecer si hay diferencia significativa entre los datos
obtenidos para el parámetro a y los diferentes tratamientos probados. Realizar el mismo
análisis para los parámetros b y L por separado.
c) Con la información obtenida del análisis estadístico, describir y explicar las diferencias de
color después de cada tratamiento, relacionándolo con cambios en la estructura de la
clorofila. Seleccionar el parámetro más adecuado para analizar diferencias de color en este
alimento.
89
Referencias
Kostyla, A.; Clydesdale, F. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 1978, 10 (3), 303-321.
Koca, N.; Karadeniz, F.; Burdurlu, H. Food Chem. 2006, 100, 609.615.
McCaig, T. Food Res. Int. 2001, 35, 731-736.
Meilgaard, M.; Civille, G.; Carr, T. Sensory Evaluation Techniques; 3rd ed.: CRC Press: Boca Ratón,
Fl, 1999.
Escamilla, V. Tesis de Licenciatura. Faculta de Química, UNAM. México D.F. 2006.
90
DIAGRAMA ECOLÓGICO

4.1.1 EFECTO DE LA TEMPERATURA Y pH SOBRE CLOROFILA
A. DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE CLOROFILA
1 g de muestra + 25 mL de agua destilada + 3 mL de

ácido acético al 5% o hidróxido de sodio 1 N
Agua con Tratamiento de temperatura

ácido o base
1 g muestra tratada + 0.1 g carbonato

de calcio + 4 mL acetona al 85%
R1 Moler
Adicionar 20 mL acetona al 85%, transferir

a embudo Buchner y filtrar
Realizar dos lavados con 15 mL de acetona al 85%

Papel filtro
con sólidos
Colocar filtrado en embudo de separación y
adicionar 50 mL éter + 50 mL de agua destilada
R2
Separar fases
Realizar un segundo lavado R3

con 30 mL de agua destilada
Fase acuosa
Separar fases
Fase orgánica
Adicionar sulfato de sodio anhidro y

medir volumen en probeta
Extracto en baño de hielo y llevar a volumen

final antes de la lectura a 642.5 y 660 nm
91
R4
Tratamiento:
R2: Dejar secar el papel filtro con muestra en la campana para evaporación del disolvente residual
y depositar en los residuos orgánicos.
R3: Con base en su relación costo-beneficio, recuperar el disolvente por destilación para su
reutilización.
R4: Con base en su relación costo-beneficio, destilar la fase orgánica y recuperar el disolvente.
92
DIAGRAMA ECOLÓGICO

4.1.1 EFECTO DE LA TEMPERATURA Y pH SOBRE CLOROFILA
B. MEDICIÓN INSTRUMENTAL DE LA INTENSIDAD DE COLOR.
Muestra de chícharos
congelados
Control Tratamientos
Agregar ácido acético al 5% o

NaOH 1 N y agua destilada
Retirar soluciones ácidas o Agua con ácido

básicas según corresponda o base
Seleccionar dos chícharos de cada tratamiento y de

la muestra control R1
Envolver cada pieza con un trozo de plástico

adherente. Evitar la formación de burbujas
Medir la intensidad de color en el colorímetro Minolta
R2
93
Tratamiento:
R2: Depositar los chícharos en los residuos orgánicos. Desechar el plástico en los residuos
inorgánicos.
94
4.2 DETERMINACIÓN DE BENZOATOS EN PRODUCTOS ALIMENTICIOS
Cuestionario previo
1. ¿Cuál es la estructura química del ácido benzoico y su reacción de disociación?
2. ¿Cuál es el espectro antimicrobiano del ácido benzoico y su mecanismo de acción en
células microbianas?
3. ¿Cuáles son los principales productos alimenticios en los que se utiliza el ácido benzoico?
4. ¿Cuándo y en qué productos se recomienda el uso combinado de benzoatos y sorbatos
como conservadores en alimentos?
5. ¿Cuál es la concentración máxima permitida en alimentos de ácido benzoico o benzoato
de sodio y la ingesta diaria admisible? Anotar las referencias.
6. Investigar la densidad del disolvente utilizado en esta práctica.
Objetivo
Determinar la concentración de ácido benzoico presente en productos alimenticios mediante un
método espectrofotométrico, para que el estudiante verifique el cumplimiento de las normas
nacionales e internacionales de uso de este aditivo.
Muestra
20 mL de salsa, bebida carbonatada o bebidas con jugo de fruta que será asignada a cada equipo
por el profesor.
Material
 Celda de cuarzo de 1 cm 1 juego
 Embudo de separación de 500 mL ó 250 mL 2
 Espátula 1
 Papel pH
 Papel filtro
95
 Recipiente para baño de hielo 1
Reactivos
 Ácido benzoico R. A.
 Ácido clorhídrico concentrado R.A.
 Éter etílico R.A.
 Hidróxido de amonio R.A.
 Sulfato de sodio anhidro R.A.
Equipo
 Espectrofotómetro UV-VIS
 Parrilla con agitación
I. Disolución patrón de ácido benzoico (0.5 mg/mL): Llevar al aforo con éter etílico.
II. Disolución concentrada de cloruro de sodio al 25% (m/v)
III. Disolución de ácido clorhídrico 0.1% (v/v)
IV. Disolución de hidróxido de amonio 0.1% (v/v)
Procedimiento
Preparación de la muestra
1. Eliminar el CO2 en las muestras carbonatadas por agitación durante 15 minutos.
2. Homogeneizar la muestra. Transferir 10 mL a un embudo de separación y mezclar con 100
mL de una disolución saturada de NaCl (disolución II).
3. Agregar 1-2 gotas de HCl concentrado hasta alcanzar un pH de 1. Verificar la acidez con
papel pH.
4. Adicionar 35 mL de éter etílico y agitar por dos minutos (romper la emulsión dejando en
reposo). Drenar la fase orgánica y reservar. Repetir el paso anterior y juntar ambas fases
orgánicas para continuar con la extracción. Descartar la fase acuosa al final de las dos
extracciones.
5. Lavar los extractos combinados de éter etílico con 20 mL de HCl al 0.1% (disolución III) y
descartar la fase acuosa.
6. Repetir el paso anterior dos veces más y descartar la fase acuosa.
7. Lavar la fase orgánica con 20 mL de NH4OH al 0.1% (disolución IV), recuperar la fase
acuosa y reservar.
96
8. Repetir el paso anterior dos veces más y combinar las fases acuosas de los tres lavados.
Descartar la fase orgánica al final de las tres extracciones.
9. Acidificar los extractos combinados de NH4OH con HCl concentrado hasta un pH de 1
(verificar la acidez con papel pH).
10. Adicionar a la disolución acidificada 35 mL de éter, drenar la fase orgánica y reservar.
11. Repetir el paso anterior y combinar las fases orgánicas. Descartar la fase acuosa al final de
las dos extracciones.
12. Pasar los extractos a través de una cama con sulfato de sodio anhidro y enjuagar el sulfato
con el mínimo de volumen de éter posible. Recuperar la fase orgánica en una probeta y
medir el volumen final. Mantener en un baño de hielo hasta el momento de leer la
absorbancia en el espectrofotómetro.
13. Leer la absorbancia en celdas tapadas en el espectrofotómetro a las longitudes de onda de
B, C y D para ácido benzoico. Si el valor de la absorbancia no se ajusta en el intervalo de
0.2-0.8, realizar una dilución del extracto.
Preparación de la curva patrón

1. Curva patrón. Tomar alícuotas de 1, 3 y 5 mL de la disolución patrón (disolución I) en un
matraz volumétrico de 25 mL y llevar al aforo con éter etílico hasta el momento de leer en
el espectrofotómetro.
2. Ajustar el espectrofotómetro a cero usando como blanco éter etílico y leer la absorbancia
en celdas tapadas, con un espectrofotómetro a las tres longitudes de onda siguientes:
B, mínima = 267.5 nm
C, máxima = 272 nm
D, mínima = 276.5 nm
tratamiento.
3. Determinar la absorbancia corregida (Acorr), para ello, calcular el promedio de las

absorbancias en B y D y restar al valor obtenido en C.
𝐵+𝐷
𝐴𝑐𝑜𝑟𝑟 = 𝐶 −
2
Donde:
Acorr = Absorbancia corregida
B = Absorbancia mínima 267.5 nm
C = Absorbancia máxima 272 nm
D = Absorbancia mínima 276.5 nm
97
a) Calcular la absorbancia corregida y trazar la curva de absorbancia vs. concentración
(mg/mL). Completar la siguiente Tabla.
Absorbancia
Disolución Concentración
267.5nm =272nm 276.5nm Corregida
patrón ácido benzoico
(mL) (mg/mL)
0 r
1 m
3 b
5
b) Reportar su resultado en las unidades adecuadas para ser comparado con los límites
máximos permitidos por las normas nacionales o internacionales.
c) Expresar la concentración encontrada de ácido benzoico como benzoato de sodio. Para
ello, multiplicar el resultado anterior de ácido benzoico por 1.18. Con todos los cálculos
obtenidos llenar el siguiente cuadro:
Absorbancia
267.5 272 276.5 Concentración
Lectura nm nm nm Corregida Benzoato de sodio
(ppm)
1
2
Promedio
98
Referencias
Cubero, N., Monferrer, A., Villalta. J., 2002. Aditivos alimentarios. Primera edición. España: Mundi-
Prensa.
Badui, D., 2013. Química de los alimentos. Quinta edición. México; Pearson.
Sociedad Mexicana de Normalización y Certificación. NMX-F-309-NORMEX-2001 (3.2) Métodos
de prueba para la determinación de conservadores en alimentos. Diario Oficial de la
Federación. 2001.
Secretaría de Salud. NOM-218-SSA1-2011. Productos y servicios. Bebidas saborizadas no
alcohólicas, sus congelados, productos concentrados para prepararlas y bebidas
adicionadas con cafeína. Especificaciones y disposiciones sanitarias. Métodos de prueba.
Diario Oficial de la Federación. 2011.
99
DIAGRAMA ECOLÓGICO
DETERMINACIÓN DE BENZOATOS EN PRODUCTOS ALIMENTICIOS
Eliminar el CO2 en muestras

carbonatadas
Transferir una alícuota de 10 mL a un

embudo de separación
Añadir 100 mL de disolución saturada de

cloruro de sodio
Agregar 1-2 gotas de HCl concentrado y

verificar pH = 1
Extraer con dos porciones de 35 mL de éter
Fase orgánica Separar fases Fase acuosa
Lavar tres veces con porciones de

20 mL de HCl al 0.1% R1
Separar fases
Fase acuosa Fase orgánica
Extraer tres veces con porciones de 20 mL

R2 de NH4OH al 0.1%
Fase acuosa Separar fases Fase orgánica
R3
Continúa en la siguiente página
100
DIAGRAMA ECOLÓGICO
DETERMINACIÓN DE BENZOATOS EN PRODUCTOS ALIMENTICIOS (Continuación)
Fase acuosa
Acidificar los extractos combinados de NH4OH

con HCl concentrado hasta pH = 1
Extraer con dos porciones de 35 mL de éter
Separar fases
Secar en una cama de sulfato de sodio

anhidro R4
Recuperar extracto en matraz volumétrico

de 100 mL y mantener en baño de hielo
Llevar al aforo hasta el momento de leer en

el espectrofotómetro
Leer a las longitudes de onda de 267.5,

272 y 276.5 nm R5
Tratamiento:
R1, R2 y R4: Neutralizar y desechar en el drenaje.

R3 y R5: Con base en su relación costo-beneficio, recuperar el disolvente por destilación para su
reutilización.
101
5.1 EFECTO DE AGENTES EMULSIFICANTES Y ESTABILIZANTES SOBRE LAS
CARACTERÍSTICAS REOLÓGICAS Y SENSORIALES DE UN PRODUCTO ALIMENTICIO
Introducción
Una emulsión es un sistema que contiene dos fases líquidas inmiscibles, una de las cuales está
dispersa en la otra y, cuya estructura es estabilizada por un agente surfactante llamado
emulsificante. Los emulsificantes son agentes anfifílicos que estabilizan mezclas de líquidos
inmiscibles, evitando la sinéresis o separación de fases. Actúan en la interfase de una emulsión,
reduciendo la tensión superficial y permitiendo que las dos fases se estabilicen para lograr un
contacto estrecho.
Las emulsiones pueden ser de aceite en agua, con la fase continua acuosa, o agua en aceite, con
la fase continua de aceite. Existen agentes emulsificantes naturales y sintéticos, siendo estos
últimos los más utilizados en la industria alimentaria.
El helado es un sistema polifásico porque es una espuma, una emulsión que contiene cristales de
hielo y una mezcla acuosa sin congelar. Se añaden emulsificantes durante el proceso de
congelación para obtener una textura más suave y garantizar que el helado no se derrita
rápidamente después de servirlo. También mejoran la estabilidad congelación-descongelación. Los
mono- y diglicéridos de ácidos grasos (E 471), las lecitinas (E 322) y los polisorbatos (E 432 y E
436) se utilizan habitualmente en la producción de helados.
Cuestionario previo
1. Definir el Balance Hidrófilico Lipofílico (BHL) e indicar qué información proporciona de un
emulsificante.
2. Completar el siguiente cuadro con la información solicitada:
Valor Tipo de emulsión que Ejemplos de productos en
Compuesto
BHL estabiliza que se utiliza
Triesterato de sorbitan
Monolaurato de sorbitan y
polioxietileno
Monoesterato de
propilenglicol
Lecitina
3. El día de la práctica, cada miembro del equipo deberá entregar una cuartilla con
información sobre los siguientes conceptos:
a) Viscosidad
b) Viscosímetro de cilindros concéntricos
102
c) Clasificación de los fluidos no newtonianos de acuerdo a su viscosidad
Objetivo
Relacionar la acción de distintos emulsificantes y estabilizantes con las propiedades sensoriales y
mecánicas del helado para que el estudiante determine cuál de los aditivos estudiados es el más
adecuado para la fabricación de helados.
Material
 Charola 1
 Cronómetro 1
 Espátula 1
 Pala de madera mediana 1
 Probeta de 500 mL ó 1000 mL 1
 Recipiente de peltre, acero inoxidable o vidrio de 3 L de capacidad 1
 Termómetro metálico 1
Aditivos
 Goma arábiga
 Goma guar
 Lecitina de soya
 Tween 20
 Saborizante artificial de vainilla
Equipo
 Batidora (puede traerla el estudiante)
 Viscosímetro de cilindros concéntricos
Material que debe traer el estudiante

 Azúcar refinada 500 g
 Cofia 1
 Cubre bocas 1
 Cucharas de plástico
103
 Crema entera 500 g
 Hielo
 Leche entera pasteurizada de cualquier marca. 2L
 Recipientes con tapa de plástico de 1 L 3
 Sal en grano 1 kg
 Vasos de plástico del #0
Procedimiento
El profesor asignará a cada equipo la formulación de helado que va a preparar. Calcular la
cantidad necesaria para elaborar 1 kg de base para helado.
Tabla 1. Ingredientes para las formulaciones de base para helado (g/100g de base)
Formulación 1 2 3 4
Leche entera 64 64 64 64
Crema (35% de grasa) 20 20 20 20
Azúcar 14 14 14 14
Lecitina 0.6 0.0 0.0 0.0
Tween 20 0.0 0.6 0.0 0.0
Goma arábiga 0.0 0.0 0.6 0.0
Goma guar 0.0 0.0 0.0 0.6

Saborizante* 1.4 1.4 1.4 1.4
* La cantidad de saborizante puede variar dependiendo de la marca disponible.
Primera Sesión
1. Calcular y pesar los ingredientes necesarios para preparar 1 kg de base para helado de la
formulación indicada para su equipo.
2. Dividir la leche en dos partes iguales. En una parte disolver el azúcar y el estabilizante a
usar (goma guar o goma arábiga).
3. Calentar la otra parte de la leche a 35 °C y disolver la crema y el emulsificante (lecitina o
tween), mezclar con la batidora hasta su completa incorporación.
4. Mezclar las dos partes de leche agitando para que no se formen grumos.
5. Incrementar lentamente la temperatura de la mezcla para pasteurizarla, agitar
constantemente con la pala de madera hasta alcanzar los 80 °C y mantenerla durante 25
segundos.
104
6. Enfriar la mezcla a temperatura ambiente y una vez fría introducirla al refrigerador por 1
hora para su maduración.
Segunda sesión
1. Al término de la maduración, medir el volumen final de la base.
2. Medir con probeta 100 mL de la base a 12 °C para determinar la viscosidad aparente de la
base de helado el viscosímetro.
3. A la par preparar un baño de hielo con sal de grano.
4. Adicionar a la base del helado el saborizante.
5. Batir la base de helado con la ayuda de una pala de madera, manteniéndola sobre el baño
de hielo hasta formar la consistencia de helado.
6. Transferir el helado al recipiente donde se va a envasar, medir el volumen del helado y
congelar.
7. Evaluar los diferentes helados de vainilla de acuerdo a los descriptores sensoriales (ver el
Anexo 2 al final de este protocolo).
a) Calcular el sobre rendimiento:
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 ℎ𝑒𝑙𝑎𝑑𝑜 − 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑏𝑎𝑠𝑒
% 𝑆𝑜𝑏𝑟𝑒 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 𝑋100
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑏𝑎𝑠𝑒
b) Llenar la siguiente Tabla con los resultados obtenidos de la práctica y discutirlos.

Tabla 2. Resultados de las distintas formulaciones
FORMULACIÓN 1 2 3 4
Volumen de la base (mL)
Volumen del helado (mL)
Viscosidad de la base (Pa•s)
Sobre rendimiento (%)
c) Registrar todos los resultados de viscosidad aparente (Pa•s) y anexar el gráfico

correspondiente a cada aditivo evaluado.
d) Anotar los valores de la evaluación sensorial en la Tabla correspondiente y trazar una
gráfica de araña para todos lo descriptores sensoriales evaluados.
105
Tabla 3. Características Sensoriales
FORMULACIÓN 1 2 3 4
Arenosidad
Dureza
Brillo
Uniformidad
Flavor
e) A partir de los resultados obtenidos, indicar cuál emulsificante o estabilizante es más

adecuado para este tipo de producto.
106
Referencias
Alais, C. Ciencia de la leche: Principios de técnica lechera; CECSA: Zaragoza, 1992.

Prensa.
Badui, D., 2013. Química de los alimentos. Quinta edición. México; Pearson.
Fritz, T.Fabricación de Helados; Acribia: Zaragoza, 1989.
Secretaría de Salud. NOM-036-SSA1-1993. Bienes y servicios. Helados de crema, de leche o
grasa vegetal, sorbetes y bases o mezclas para helados. Especificaciones sanitarias.
Diario Oficial de Federación. 1993.
Secretaría de Economía. NOM-155-SCFI-2003. Leche, fórmula láctea y producto lácteo
combinado. Denominaciones, especificaciones fisicoquímicas, información comercial y
métodos de prueba. Diario Oficial de la Federación. 2003.
Spreer, E. Milk and Dairy Product Technology; Marcel Dekker: New York, 1998. Walstra, P.
Ciencia de la leche y tecnología de los productos lácteos; Acribia: Zaragoza, 2001.
107
ANEXO 2
EFECTO DE AGENTES EMULSIFICANTES Y ESTABILIZANTES SOBRE LAS
EVALUACIÓN SENSORIAL
Fecha:___________
Nombre del evaluador:___________________________________________________________
Formulación No._______
Instrucciones: Frente a usted tiene una muestra, evalúela de acuerdo al atributo de

apariencia y textura correspondiente y marque con una CRUZ sobre la escala, el punto que
usted considera que describe la intensidad del atributo correspondiente.
TEXTURA: Incluye dureza y arenosidad. Se realiza cortando una muestra con una cuchara y
paladearla, dejando que se derrita en la boca.
 Arenosidad: La sensación de arenosidad está dada por la presencia de cristales grandes

de hielo. Se evalúa presionando con la lengua la muestra contra el paladar.
1 9
Menos Más
 Dureza: Resistencia que opone un objeto a ser deformado o penetrado por la aplicación de
una fuerza. Se evalúa al morder la muestra utilizando los molares.
1 9
Menos Más
APARIENCIA: Incluye color, brillo y uniformidad. La evaluación se realiza examinando visualmente

la muestra y la superficie de corte.
 Brillo: Indica el grado de luz que puede reflejar la muestra.
1 9
Menos Más
108
 Uniformidad: Cubierta, color y/o forma, no uniformes.
1 9
Menos Más
FLAVOR: Se evalúa dejando derretir la muestra en la boca y observando su gusto. En este caso
se evaluará la intensidad del sabor a vainilla.
 Sabor a vainilla
1 9
Imperceptible Intenso
109
DIAGRAMA ECOLÓGICO

(Primera sesión)
Calcular y pesar ingredientes para

preparar 1 kg de base de helado
Dividir leche en 2 partes iguales
Disolver el azúcar y el estabilizante Calentar ligeramente (35 °C) y

a usar disolver la crema y el emulsificante
Mezclar las dos partes de leche
Calentar la mezcla lentamente, agitando

constantemente hasta alcanzar los 80 °C
Mantener temperatura por 25 s para

pasteurizar
Enfriar a temperatura ambiente
Mantener en refrigeración durante 1 h

para su maduración
110
DIAGRAMA ECOLOGICO

(Segunda sesión)
Medir el volumen final de la base
Medir con probeta 100 mL de la base y

medir la viscosidad aparente a 12 °C
Adicionar el saborizante a la base del

helado
Batir la base del helado dentro de un Baño de hielo con sal

baño de hielo con sal de grano y de grano
Transferir el helado al recipiente donde

se va envasar y congelar R1
Después de 48 h medir volumen del

helado
R2
Tratamiento:
R1: En el caso de tener una sobresaturación de sal en el agua, filtrar y recuperar la sal. Dejar secar
ésta última en la campana de extracción sobre un papel kraft y una vez seca recolectar y guardar
para su uso posterior.
R2: Desecha los residuos de helado en el drenaje o en residuos orgánicos.
111
5.2 EFECTO DE AGENTES GELIFICANTES SOBRE LA TEXTURA DE UN PRODUCTO
ALIMENTICIO
Introducción
La textura es la manifestación sensorial y funcional de las propiedades estructurales, mecánicas y

de superficie de los alimentos, detectada a través de los sentidos de la vista, oído y tacto; la cual
en conjunto con la apariencia y el sabor son los tres componentes principales en la aceptación de
un producto alimenticio por parte del consumidor.
Los cambios en la textura alteran la percepción del sabor y la apariencia, debido a la modificación
en el transporte de las moléculas generadoras del estímulo hasta los receptores humanos y la
apreciación de sus otras características, por lo cual es un componente importante a evaluar. La
evaluación de la textura en un alimento puede realizarse a través del análisis sensorial y de
manera instrumental por medio de un texturómetro, el cual imita la masticación.
Dentro de los aditivos llamados “modificadores de la textura” se encuentran las sustancias que bajo
ciertas circunstancias forman geles. Desde el punto de vista químico estos pueden ser de
naturaleza muy diferente por ejemplo, el almidón es un carbohidrato, mientras que, la grenetina es
una proteína y sin embargo, ambos tienen la propiedad de formar geles.
Los geles son sólidos suaves, elásticos y deformables formados por dispersiones coloidales del
tipo liofílicos, o coloides que atraen al disolvente, se caracterizan por captar grandes cantidades
de líquido con el correspondiente aumento de volumen (imbibición), cuyo efecto puede perderse
(sinéresis).
Cuestionario previo
1. Diferencia entre gel físico y gel químico.

2. ¿A qué se refieren los términos de termoreversibilidad e histéresis térmica aplicados a
geles?
3. Investigar la definición de gelificante e hidrocoloide. ¿Para qué se utilizan en la industria
alimentaria?
112
4. Completar el siguiente cuadro:
Rango de
Resistencia Rango de pH
Estructura Uso de temperatura
Gelificante mecánica del óptimo de
química Cofactores óptimo de
gel formado gelificación
gelificación
Agar
Alginato de
sodio
Grenetina
k-carragenina
Pectina de alto
metoxilo
Pectina de
bajo metoxilo
Objetivo
Determinar la textura final de los geles elaborados mediante un análisis sensorial e

instrumental, para que el estudiante compare las diferentes características que presentan y
pueda predecir su aplicación en productos alimenticios.
Material
 Espátula 1
 Termómetro metálico 1
Material que debe traer el estudiante

 Azúcar refinada
 Cofia y cubre bocas
 Leche de vaca pasteurizada
 Papel aluminio
 Vasos de plástico #0
Equipo
113
 Analizador de textura TA-XT2
Aditivos
 Ácido cítrico
 Agar
 Carragenina
 Grenetina
 Pectina de alto metoxilo
Procedimiento
Preparar 100 g de cada una de las formulaciones asignadas por el profesor, siguiendo las
proporciones indicadas en cada una de las Tablas.
 GRENETINA
Tabla 1. Formulaciones de diferentes geles de grenetina.
FORMULACIÓN Grenetina Ácido cítrico Agua Leche

Azúcar (g)
(g) (g) (mL) (mL)
GREN 1 1 - - 99 -
GREN 2 3 - - 97 -
GREN 3 3 60 - 37 -
GREN 4 3 60 0.5 36.5
GREN 5 3 - - - 97
Preparación:
1. Mezclar la grenetina con la cantidad correspondiente de azúcar (según la formulación

asignada).
2. Agregar poco a poco la mezcla anterior en el medio de dispersión (agua o leche) para
facilitar que la grenetina se humecte adecuadamente y elevar la temperatura de la mezcla
entre 60-70 °C o hasta observar su completa disolución.
3. Una vez que la mezcla esté homogénea, retirar del fuego. S i la formulación lo indica,
al final adicionar el ácido cítrico.
4. Vaciar la solución final en vasos de plástico del número cero y dejar que se enfríen a
temperatura ambiente.
5. Almacenar en condiciones de refrigeración hasta el día de su evaluación.
114
 AGAR-AGAR
Tabla 2. Formulaciones de diferentes geles de agar-agar

Agar-agar Azúcar Agua Leche
FORMULACIÓN
(g) (g) (mL) (mL)
AGAR 1 1 - 99 -
AGAR 2 3 - 97 -
AGAR 3 3 60 37 -
AGAR 4 3 - - 97
Preparación:
1. Mezclar el agar con el azúcar (según la formulación asignada).
2. Agregar poco a poco la mezcla anterior en el medio de dispersión (agua o leche) y elevar
la temperatura de la mezcla hasta su completa disolución, aproximadamente 90 °C.
3. Una vez que la mezcla esté homogénea, retirar del fuego.
4. Vaciar la solución final en vasos de plástico del número cero y dejar que se enfríen
a temperatura ambiente.
 PECTINA DE ALTO METOXILO (PAM)
Tabla 3. Formulaciones de diferentes geles de pectina de alto metoxilo

FORMULACIÓN Pectina de alto Azúcar Ácido cítrico Agua Leche
metoxilo (g) (g) (g) (mL) (mL)
PAM 1 3 - - 97 -
PAM 2 3 60 - 37 -
PAM 3 3 60 0.5 36.5 -
PAM 4 3 60 0.5 - 36.5
Preparación:
1. Mezclar la pectina con el azúcar (según la formulación asignada).

2. Agregar poco a poco la mezcla anterior en el medio de dispersión (agua o leche) y elevar
la temperatura de la mezcla hasta su completa disolución, aproximadamente 70 °C.
3 . Una vez que la mezcla esté homogénea, retirar del fuego. Si la formulación lo indica,
al final se adiciona el ácido cítrico.
115
 CARRAGENINA
Tabla 4. Formulaciones de diferentes geles de carragenina

Carragenina Azúcar Agua Leche
FORMULACIÓN
(g) (g) (mL) (mL)
CARR 1 3 - 97 -
CARR 2 3 60 37 -
CARR 3 3 60 - 37
CARR 4 3 - - 97
Preparación:
1. Mezclar la carragenina con el azúcar (según la formulación asignada).
2. Agregar poco a poco la mezcla anterior, en el medio de dispersión (agua o leche) y elevar
la temperatura de la mezcla hasta su completa disolución, no exceder de 60 °C.
3. Una vez que la mezcla esté homogénea, retirar del fuego.
Todas las formulaciones se evaluarán mediante un análisis sensorial y un análisis

instrumental de perfil de textura.
a) Indicar, ¿cuál de las condiciones ensayadas de cada uno de los agentes gelificantes es
la más adecuada para la correcta formación del gel?
b) Evaluar los atributos sensoriales como se indica en el Anexo 3, para cada formulación
propuesta. Generar un gráfico tipo araña por gelificante, con los resultados obtenidos.
c) Comparar los resultados obtenidos de la evaluación sensorial con los obtenidos en el
análisis instrumental de textura para las mismas formulaciones.
116
Referencias
Prensa.
Jardon, S. B. Tesis de Licenciatura. Facultad de Química, UNAM, México, D.F., 2006.
Waldam, A.; Schechinger, G. G., Nowick, J. J. Chem. Education. 1998, 75(11), 1430-1431.
117
ANEXO 3
EFECTO DE AGENTES GELIFICANTES SOBRE LA TEXTURA DE UN
PRODUCTO ALIMENTICIO
EVALUACIÓN SENSORIAL
Fecha:___________
Nombre del evaluador:___________________________________________________________
Gelificante a evaluar:________________________________ Número de formulación:_______
Instrucciones: Frente a usted tiene una muestra, evalúela de acuerdo al atributo de

apariencia y textura correspondiente y marque con una CRUZ sobre la escala, el punto que
usted considera que describe la intensidad del atributo correspondiente.
TEXTURA: Incluye elasticidad, dureza, adhesividad y cohesividad.
 Elasticidad: Se define como la capacidad de un cuerpo para recuperar su forma original,

después de haberle aplicado una fuerza. Se evalúa con la yema del dedo índice,
comprimiendo la superficie de la muestra más de un 50% de su altura y liberar
inmediatamente. Observar la velocidad con la cual regresa a su altura original, así como el
movimiento ocasionado por la misma.
1 9
Menos Más
 Dureza: Resistencia que opone un objeto a ser deformado o penetrado por la aplicación de
una fuerza. Se evalúa al morder la muestra utilizando los molares.
1 9
Menos Más
 Adhesividad (al paladar): Fuerza requerida para mover el producto adherido al paladar,
usando la lengua, después de la compresión de la muestra entre la lengua y el paladar. Se
evalúa la fuerza necesaria para despegar el alimento del paladar.
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1 9
Menos Más
 Cohesividad: Cantidad de deformación soportada por el material antes de la ruptura. Se

evalúa la magnitud de deformación cuando la muestra se corta completamente con los
molares.
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Menos Más
APARIENCIA: Incluye uniformidad, brillo y sequedad. La evaluación se realiza examinando

visualmente la muestra y la superficie de corte.
 Brillo: Indica el grado de luz que puede reflejar la muestra.
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Menos Más
 Arenosidad: presencia de gránulos sobre la superficie.
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Menos Más
 Uniformidad: Cubierta, color o forma, no uniformes.
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 Sequedad: Apariencia opaca o con cuarteaduras.
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Menos Más
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DIAGRAMA ECOLÓGICO
EFECTO DE AGENTES GELIFICANTES SOBRE LA TEXTURA DE UN PRODUCTO

ALIMENTICIO
Elaboración de las formulaciones de

los diferentes gelificantes
Vaciar en moldes y refrigerar hasta su

evaluación
Realizar una evaluación sensorial de acuerdo a los

atributos de apariencia y textura
R1
Tratamiento:
R1: Los residuos de los geles se depositan en los residuos orgánicos.
120

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LABORATORIO DE

UNIDAD 2. ALIMENTOS FUNCIONALES

UNIDAD 3. VIDA DE ANAQUEL Y PRUEBAS ACELERADAS

UNIDAD 4. ADITIVOS ALIMENTARIOS

4.1.2 Medición instrumental de la intensidad de color 87

4.2 Determinación de benzoatos en productos alimenticios 95

UNIDAD 5. APLICACIÓN DE ADITIVOS ALIMENTARIOS

En la Tabla 1 se presentan valores de la DL50 de diferentes sustancias, mientras que en la Tabla 2

Tabla 1. Dosis letal media de algunos agentes xenobióticos

Etanol Ratón 10,000

Cloruro de sodio Ratón 4,000

Sulfato ferroso Rata 1,500

Sulfato de morfina Rata 900

Dicloro-difenil-tricloroetano (DDT) Rata 100

Sulfato de estricnina Rata 2

Tetradotoxina Rata 0.1

Dioxina Conejillo de Indias 0.001

Toxina botulínica Rata 0.00001

Súper tóxico <5 mg/kg

Extremadamente tóxico 5–50 mg/kg

Altamente tóxico 50–500 mg/kg

Moderadamente tóxico 0.5–5 g/kg

Ligeramente tóxico 5–15 g/kg

Prácticamente no tóxico >15 g/kg

1. Utilizar ratones con un periodo de ayuno de 12 horas (retirar sólo el alimento).

Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3 Dosis n

Figura 1. Pasos para la administración por vía oral en ratón

6. Restituir el alimento y agua. Mantener a los ratones en observación durante 48 horas

Durante la administración del xenobiótico, el periodo de observación y al término del

7. Con los resultados obtenidos calcular la DL50 de la cafeína empleando el método

Para 0% de mortalidad: 100 (0.25/n)

Para 100% de mortalidad: 100[(n-0.25)/n]

En donde n es el número de ratones en los lotes en donde se observó el 0 y el 100% de

( DL84 DL50 )  ( DL50 DL16 )

Desphande, S. Handbook of Food Toxicology; Marcel Dekker: New York, 2002.

DETERMINACIÓN DE LA DOSIS LETAL MEDIA DE CAFEÍNA EN RATONES

Elaboración de “culebra japonesa” para la

Calcular el volumen a administrar de las

Administrar por vía oral la dosis de Dosis de cafeína

Restituir alimento y agua

Registrar el número de animales

Sensibilización de los eritrocitos

Determinación semicuantitativa de lectinas

3. Agregar 0.5 mL de suspensión de glóbulos rojos al 4% a cada tubo y homogeneizar

Guardar los desechos en frascos debidamente etiquetados para su posterior

DETERMINACIÓN SEMICUANTITATIVA DE LECTINAS

Trasvasar la sangre con anticoagulante a

Agregar disolución isotónica en proporción 1:5

Centrifugar a 2500 rpm durante 10 min

Sobrenadante Eliminar el sobrenadante por decantación

Paquete de glóbulos rojos

Diluir paquete de glóbulos rojos al 4%

Añadir 1 mL de disolución tripsina por cada 10 mL de eritrocitos al 4%

Incubar por 45 min a 37 °C

Centrifugar a 2500 rpm durante 10 min

Lavar tres veces con disolución isotónica

Paquete de glóbulos rojos resuspender al volumen original (4%)

DETERMINACIÓN SEMICUANTITATIVA DE LECTINAS

Pesar muestra, moler y adicionar 25 mL

Papel filtro con

Realizar diluciones seriadas

Agregar 0.5 mL de la suspensión de glóbulos

Incubar las series de tubos a 37 °C

Observar aglutinación positiva de