UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán

Sección de Bioquímica y Farmacología Humana
LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR

REPORTE DE PRÁCTICA
No. de Práctica: 3 Título: Fraccionamiento celular y cloroplastos

Fecha de elaboración: 5/04/2022

Integrantes: Carrera: Farmacia Grupo:2351 Equipo: 7
Parámetros a evaluar
Alvarado Fernández Juan Carlos
Presentación (1) Análisis (3)
Gutiérrez Guadalupe Gerardo Introducción (1) Conclusiones (1)
Pérez Galindo Yeraldi Objetivos (1) Referencias (1)
Resultados (2)
Calificación
Introducción

El desarrollo de técnicas de fraccionamiento celular son un medio para lograr el análisis de la composición y
propiedades de elementos celulares purificados. El fraccionamiento subcelular es esencial para el desarrollo de
ensayos denominados libres de células. Estos ensayos han provisto de nuevas e importantes herramientas para
entender los mecanismos moleculares de las diversas microsomal, conocimiento de la estructura y función de
diversos tipos celulares como los eosinófilos, incluyendo la composición y función de sus gránulos, así como los
estudios en los neutrófilos en donde se han reportado la heterogeneidad, composición y movilidad de sus gránulos
utilizando gradientes de densidad.
Existen dos métodos de fraccionamiento celular, el primero método el cual fue usado en esta práctica es la
centrifugación diferencial; y el segundo, la centrifugación por gradiente de densidad. La centrifugación diferencial es
uno de los métodos más ampliamente empleados, y es usado en los primeros pasos en el fraccionamiento celular, ya
que puede separar rápidamente organelos grandes de los más pequeños, este método tiene la desventaja de que la
separación pueda ser incompleta en esta se selecciona una velocidad y del tiempo de centrifugado, el cuál dependerá
del tamaño, peso, densidad y forma de los organelos de estudio (Gómez,2007). Este método es capaz de separar
diferentes fracciones, como la nuclear, mitocondrial, microsomal y citosólica mientras que la centrifugación por
gradiente de densidad tiene la capacidad de combinar la velocidad de sedimentación más un gradiente de densidad
como la sacarosa. Este método es empleado cuando se necesita de un aislamiento de organelos subcelulares con una
mejor pureza.
Los cloroplastos son los orgánulos de las células vegetales donde se realiza la fotosíntesis, al convertir la energía
lumínica en energía química (ATP) y generar un poder reductor (NADPH).El aislamiento de cloroplastos y la evaluación
de la actividad fotosintética en condiciones in vitro, ha sido una difícil debido a las alteraciones estructurales y
funcionales que sufren los cloroplastos y a la presencia de fracciones celulares contaminantes, es por esto que en
esta práctica se hizo uso de la reacción de hill en la cual explican, que una suspensión de cloroplastos aislados se
puede desprender O2 en presencia de luz, si se administra un compuesto oxidado capaz de aceptar electrones
procedentes de la fotólisis del agua. De esta forma, el proceso de desprendimiento de O2 en la fotosíntesis pudo ser
separado del de la fijación de CO2. En la hoja intacta, los principales receptores naturales de electrones son la
ferredoxina y el NADP, pero se inactivan durante el proceso de aislamiento de los cloroplastos, pero cuando estos
están de forma in vitro sus receptores naturales pueden sustituirse por el 2,6 diclorofenolindofenol (DCPIP), debido
a que este compuesto es azul en forma oxidada (quinona) pero se decolora lentamente cuando se reduce (fenol)
(Michael, 2006).
 Objetivo General
Hacer uso del método conocido como fraccionamiento celular, sobre un tejido vegetal para poder comprobar su
actividad bioquímica a través de los cloroplastos.
Objetivos particulares
● Obtener muestras puras, a partir del fraccionamiento celular para realizar una mejor experimentación de
estas mismas.
● Conocer la importancia de la centrifugación con el fin de saber qué partículas se encuentran en el
sobrenadante y cuales en la pastilla.
● Usar la reacción de Hills para comprobar la existencia de una actividad bioquímica.

Resultados:

Condición de luz Dibujo antes de los 20 Observaciones antes Dibujo despues de los Observaciones
minutos de los 20 minutos 20 minutos después de los 20
minutos
Solar En el tubo de ensaye se Como se puede
puede observar tres observar en la imagen,
capas, de abajo hacia el DCPIP se redujo
arriba se puede perdiendo su color
observar la primera azul pasando a ser
capa de color verde incoloro por lo que
correspondiente a los solo se puede admirar
cloroplastos (Pastilla) a los cloroplastos.
obtenida en el
segundo proceso de
centrifugación,
seguida por el
colorante 2,6-
Diclorofenolindofenol
y por último la capa
correspondiente a
la de aceite.
Artificial En el segundo tubo de Al exponer la muestra
ensaye se puede en está condición no se
observar tres capas, de observó ningún
abajo hacia arriba se cambio. Se observó las
puede observar la 3 capas en el tubo.
primera capa de color
verde correspondiente
a los cloroplastos
(Pastilla) obtenida en
el segundo proceso de
centrifugación,
seguida por el
colorante 2,6-
Diclorofenolindofenol
y por último la capa
correspondiente a
la de aceite.
Oscuridad En el tercer tubo de Como se puede
ensaye se puede observar en la imagen
observar tres capas, de no hubo cambio
abajo hacia arriba se alguno, por lo que se
puede observar la
 primera capa de color sigue observando las
verde correspondiente tres capas.
a los cloroplastos
(Pastilla) obtenida en
el segundo proceso de
centrifugación,
seguida por el
colorante 2,6-
Diclorofenolindofenol
y por último la capa
correspondiente a
la de aceite.

Análisis de Resultados:
Como se ha podido observar en esta práctica el fraccionamiento celular es uno de los procesos más importantes para
poder estudiar diversos organelos. En particular en está práctica se hizo uso de este método para estudiar más de
cerca los cloroplastos obtenidos a través de la espinaca. En la primera etapa del experimento se llevó a cabo el
proceso de homogeneización sobre el tejido vegetal (espinaca). Este proceso consiste en disgregar los tejidos en las
células que los componen agregando ciertos disolventes. En esta práctica se ocuparon 15 mL PBS en frío con la
intención de regular el pH y con esto inhibir las enzimas de degradación de la célula y mantener la integridad de lo
orgánulos (cloroplastos), estableciendo un medio para protegerlos de un medio isotónicos. Una vez hecho esto se
filtró y se llevó a cabo el primer proceso de fraccionamiento celular a través de la centrifugadora a 1,500 rpm por 5
minutos o 10,062 fuerza g. En este proceso la espinaca se separó mediante una acción mecánica de partículas a través
de un fluido por la acción de la fuerza de la centrífuga formando así dos capas, en donde se observó el líquido
sobrenadante (parte superior) y la pastilla (parte inferior). A estas velocidades las células se fraccionaron a tal punto
de que en la pastilla se encontrarán partículas más grandes como son núcleos, restos de otras células y citoesqueleto.
Por lo que en el líquido sobrenadante corresponden partículas con bajo peso molecular correspondientes a iones,
enzimas y ciertas estructuras disueltas en el citoplasma.
El líquido sobrenadante como ya se pudo asegurar es la parte que nos interesa para la obtención de los cloroplastos,
es por eso que se sugirió traspasar la fase líquida a otro tubo de ensayo en el cual posteriormente se calibró y se llevó
de nuevo a un segundo proceso de centrifugación a 3,500 rpm por 15 minutos o 54,782 fuerza g. Una vez acabado el
proceso se extrajo el tubo de ensayo de la centrifuga y se volvió a observar dos fases correspondientes a la pastilla y
al líquido sobrenadante, debido a que al ir aumentando la velocidad genera una presión provocando que las
macromoléculas se sedimenten en la pastilla generando esta diferencia de fases. En la pastilla se encontrarán los
cloroplastos con algunas otras fracciones mitocondriales, mientras que en la fase líquida encontrarán partículas más
ligeras. Al terminar las centrifugaciones y como ya se pudo comprobar se obtuvieron correctamente los cloroplastos
por lo que se puso a prueba su capacidad reductora mediante la reacción de Hill, la cual consiste en utilizar como
agente reductor el 2,6-Diclorofenolindofenol comprobando la transferencia de electrones mediante su cambio de
coloración (Hawkins, 1975). Para esto los cloroplastos obtenidos se les agregó 7 mL de NaCl a 0.35 M en estado frío,
se agitó fuertemente con el fin de resuspender el sedimento. Una vez terminado esto se etiquetaron tres tubos como
P1, P2 y P3, a los cuales se les agregó 5 mL del agente reductor con 1 mL de la suspensión de cloroplastos obtenida
anteriormente y con el fin de limpiar el sistema se optó por agregar 0.5 mL de aceite. Se procedió a colocarlos a
diferentes iluminaciones por 20 minutos (artificial, solar y oscuridad) y poder comprobar su actividad bioquímica
mediante la reacción de Hill. Una vez pasado los 20 minutos se observaron los diferentes tubos y cómo se puede
observar en los resultados, el tubo correspondiente al P1 (luz solar) perdió el color azul correspondiente al colorante
debido a que los cloroplastos al estar en suspensión pueden reaccionar con la presencia de luz y provocar que el
agente oxidante (colorante) pueda interceptar los electrones en la cadena fotosintética; específicamente acepta dos
electrones, por lo que la pérdida del color demuestra que el flujo de electrones está ocurriendo durante las reacciones
dependientes de la luz, formando así el DCPIP-H (incoloro) con moléculas de O2 procedentes de la reacción
bioquímica. El colorante al estar en su forma reducida se podrá observar con mayor definición un color verde más
intenso correspondiente a los cloroplastos y en la superficie la capa de aceite. En el caso del tubo P2 el cual fue puesto
a luz artificial, no presentó cambio alguno, puesto que la luz artificial no tiene la misma energía causada por la
longitud de onda que la luz solar por lo que tarda en completarse la reacción y el colorante no pueda captar los
electrones de la reacción fotosintética. Por último, en el tubo P3 al ser colocado en un espacio ausente de luz, el
colorante fue incapaz de captar los electrones debido a que los O 2 presentes en la solución procedentes a los
cloroplastos no efectuaron la reacción bioquímica y por consiguiente dejando al tubo de ensayo sin cambios en su
estructura, observándose las tres capas principales.

Conclusiones:
Como ya se pudo observar el fraccionamiento celular es utilizado principalmente para la determinación con cada tipo
de orgánulo, esto se lleva a cabo al exponer a la muestra a centrifugación varias veces, la fuerza de gravedad o
determinada en revoluciones y el tiempo son los responsables para que los núcleos y los orgánulos se separen,
quedando lo núcleos en el sedimento también conocida como pastilla y los orgánulos celulares en el sobrenadante.
Realizando dos veces la centrifugación aumentando el nivel de rpm y los intervalos de tiempo, con esto se obtienen
muestras puras de orgánulos a estudiar, como la separación de cloroplastos de esta práctica. Los cloroplastos se
estudiaron más de cerca gracias a este proceso (fraccionamiento celular), por lo que al estar suspendidos se
comprobó que hubo un desprendimiento de moléculas de oxígeno, los cuales reaccionan con la luz reduciendo el
colorante (reacción de hill comprobando la presencia de ciertas reacciones bioquímicas.

Referencias:
● Audesirk t.(2003). Biología 1 unidad en la diversidad. México d.f. prentice hall
● Ferrandez, J.-C. (2006). Sistema linfático, El - historia, iconografía E implicaciones fisioterapéuticas. Editorial
Médica Panamericana.
● Curtis, H. (2008). Biología. Editorial Médica Panamericana.
● Gómez-Álvarez, R. P. (2007). Citología e histología vegetal y animal (4a ed.). McGraw-Hill Interamericana.
● Tortora GJ, Case CL, Funke Berdell R. Introducción a la Microbiología. 9na ed. Buenos Aires: Editorial Médica
Panamericana, 2007.
● Forbes, Bailey and Scott. Diagnóstico Microbiológico. 11º ed. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana,
2004.