DISTRIBUCIÓN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE OXIDORREDUCCIÓN

Temario
Explicación Bioquímica
Cuestionario de práctica

GRUPO 1
EXPOSITOR: AMAYA CASTRO, Anyelo Aldair

DOCENTE: Dra. REYES BELTRÁN, María Esther Daisy

PROCEDIMIENTOS
MATERIALES Y
MATERIAL Y PROCEDIMIENTO INICIAL

MATERIAL Y EQUIPO PROCEDIMIENTO

 Buffer fosfato de sodio 0.1M Proceder a realizar el fraccionamiento celular de la siguiente manera:
a. Cada grupo recibirá una rata albina (Rattus rattus var. albicans). El
pH:7.4 animal será sacrificado, inmediatamente se hará un corte longitudinal en
(2.6-DICLOROFENOLINDOFENOL)

 2,6-diclorofenolindofenol el abdomen procediendo a extraer el hígado.

0.02% b. Se coloca el hígado en un petri se elimina la cápsula del hígado y otros
PRIMER SISTEMA

 Succinato 0.1M tejidos periféricos.

c. Homogenizado al 10%: se pesa 10gr de hígado y se corta en fragmentos
 p-fenilendiamina 1% pequeños y se coloca en el homogenizador potter y se le agrega solución
 Homogenizado total de hígado de KCl 0.154 M. Se hace presión manualmente con el embolo girando
de rata en sacarosa 0.25M hacia el fondo. Todo debe trabajarse entre 0 y 4ºC.
 Fracción nuclear del d. El homogenizado es centrifugado a 800 revoluciones por 10 minutos
colocándolo en tubos de polietileno, previa calibración en la balanza, se
homogenizado. emplea una centrífuga refrigerada. El sobrenadante es separado en un
 Fracción mitocondrial del beaker de 500ml. El sedimento constituye la fracción nuclear y se coloca
homogenizado. en un beaker de 100ml.
(p-FENILENDIAMINA)
SEGUNDO SISTEMA

 Fracción microsomal soluble e. El sobrenadante anterior es centrifugado a 15000 revoluciones por 15

minutos en la centrífuga refrigerada. Se separa el sobrenadante en un
del homogenizado. beaker, constituyendo la fracción microsomal con el citosol. El sedimento
 KCl 0.154M se separa en otro beaker y constituye la fracción mitocondrial.
PROCEDIMIENTOS
MATERIALES Y
COMPONENTES Y PROCEDIMIENTOS

Rotular previamente los tubos de ensayo y preparar el SUSTRATO INDICADOR

siguiente sistema agregando lo que se indica en el Succinato de Sodio 2-6 diclorofenolindofenol
siguiente cuadro: 2,6-DICLOROFENOLINDOFENOL
OXIDADO (ESTADO NORMAL)
2.6-DICLOROFENOLINDOFENOL
REDUCIDO
(2.6-DICLOROFENOLINDOFENOL)
PRIMER SISTEMA

Azul Incoloro

ENZIMA Succinato deshidrogenasa

FRACCIONAMIENTO CELULAR
(p-FENILENDIAMINA)
SEGUNDO SISTEMA
PROCEDIMIENTOS
MATERIALES Y
DISCUSIÓN Y FUNDAMENTO BIOQUÍMICO

1 2 3 4 5 TUBO I TUBO II
El tubo I no contiene fracciones celulares del hígado de rata, esto genera El tubo II contiene la fracción nuclear donde solo se
que no contenga enzimas; por lo que, no hay una reacción. El color azul se encuentran núcleos y células integras. Al no haber enzimas,
debe al marcador 2-6 diclorofenolindofenol en su estado normal, ya que no existe una reacción que permita al marcador reducirse;
este no ha sido reducido. por ende, conserva su color original que es el azul.
(2.6-DICLOROFENOLINDOFENOL)

TUBO III TUBO IV

PRIMER SISTEMA

El tubo III contiene la fracción mitocondrial, que contiene a la enzima capaz El tubo IV contiene la fracción microsomal donde se
de producir una reacción, la succinato deshidrogenasa (que actúa a un Ph encuentran vestigios del REL, RER y ribosomas y algunas
adecuado de 7.4, generado por el buffer fosfato) que oxida al succinato en enzimas no específicas para esta práctica. Al no haber
fumarato y reduce al cofactor FAD, en FADH2. Justamente, es esta presencia de la enzima succinato deshidrogenasa, no existe
reducción es la que genera la ganancia de electrones por parte del una reacción que permita al marcador reducirse,
marcador 2-6 diclorofenolindofenol, ya que tienen mayor afinidad que el conservando su color original :azul
FAD para reducirse, tornando la reacción incolora, tono del aceptor
artificial de electrones (2-6diclorofenolindofenol) reducido.
TUBO V
2.6-DICLOROFENOLINDOFENOL OXIDADO
2.6-DICLOROFENOLINDOFENOL REDUCIDO
(ESTADO NORMAL)

El tubo V contiene el homogeneizado, donde se encuentran

(p-FENILENDIAMINA)
SEGUNDO SISTEMA

Azul Incoloro todos los vestigios del hepatocito de rata; incluso parte de lo
𝒆− 𝒅𝒆 𝟐𝑯+ que fue la mitocondria; por ende, hay presencia de la enzima
pH 7,4
succinato deshidrogenasa que permite la reacción (ver Tubo
III) tornando incolora la reacción, tono característico del
marcador reducido.
PROCEDIMIENTOS
MATERIALES Y
COMPONENTES Y PROCEDIMIENTOS
SUSTRATO E
Rotular previamente los tubos de ensayo y preparar el INDICADOR Incoloro
segundo sistema agregando lo que se indica en el siguiente p-fenilendiamina
cuadro:
(2.6-DICLOROFENOLINDOFENOL)
PRIMER SISTEMA

Marrón

ENZIMA Hierro-citocromo-c reductasa

FRACCIONAMIENTO CELULAR
(p-FENILENDIAMINA)
SEGUNDO SISTEMA
PROCEDIMIENTOS
MATERIALES Y
DISCUSIÓN Y FUNDAMENTO BIOQUÍMICO
TUBO I TUBO II
1 2 3 4 5
El tubo I no contiene fracciones celulares del hígado de rata, esto genera El tubo II contiene la fracción nuclear donde solo se
que no contenga enzimas; por lo que, no hay una reacción. El tono marrón encuentran núcleos y células integras. Al no haber enzimas,
claro (casi incoloro), se debe al sustrato p-fenilendiamina en su estado no existe una reacción que permita al sustrato oxidarse; por
normal (reducido), ya que este no ha sido oxidado. ende, conserva su tono original casi incoloro, pero que es
(2.6-DICLOROFENOLINDOFENOL)

marrón claro debido a artefactos que surgen durante la

TUBO III realización de la práctica
PRIMER SISTEMA

El tubo III contiene la fracción mitocondrial, que contiene a la enzima TUBO IV

oxidorreductasa capaz de producir una reacción, la hierro-citocromo-c
reductasa, que a un Ph adecuado de 7.4, generado por el buffer fosfato, El tubo IV contiene la fracción microsomal donde se
reduce al compuesto citocromo c – Hierro, proveniente del complejo III encuentran vestigios del REL, RER y ribosomas y algunas
(2𝐶𝑖𝑡 𝐶 𝐹𝑒 3+ → 2 𝐶𝑖𝑡 𝐶 𝐹𝑒 2+ ) mientras oxida al sustrato (e enzimas no específicas para esta práctica. Al no haber
indicador) p-fenilendiamina, tornándose la reacción de un color marrón presencia de la enzima, no existe una reacción que permita al
oscuro, tono del donador artificial de electrones oxidado. marcador oxidarse, conservando su tono origina casi
incoloro (marrón claro si hay artefactos)
2 H+
Hierro-citocromo-
c reductasa
TUBO V
(p-FENILENDIAMINA)
SEGUNDO SISTEMA

2Cit C 2 Cit C El tubo V contiene el homogeneizado, donde se encuentran

Fe+++ Fe++
Incoloro Marrón todos los vestigios del hepatocito de rata, incluso parte de lo
que fue la mitocondria; por ende, hay presencia de la enzima
hierro-citocromo-c reductasa que permite la reacción (ver
COMPLEJO COMPLEJO Tubo III) tornando de un color marrón oscuro la reacción,
III IV tono característico del marcador oxidado.
PREGUNTA 3 PREGUNTA 2 PREGUNTA 1
¿CUÁLES FUERON LOS OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA?

IDENTIFICAR LA DISTRIBUCIÓN INTRACELULAR DE

OBJETIVO
LAS ENZIMAS DE OXIDOREDUCCIÓN EN LOS
GENERAL
COMPARTIMENTOS CELULARES.

 Identificar los componentes del sistema enzimático

PREGUNTA 4

señalando sus principales características.

 Explicar bioquímicamente las reacciones catalíticas que

PREGUNTA 6 PREGUNTA 5

nos permiten visualizar la presencia de enzimas de

oxidorreducción
OBJETIVOS
ESPECÍFICOS  Explicar el proceso de centrifugación diferencial mediante
el método de Schreider y col, que permite el
fraccionamiento celular
PREGUNTA 8 PREGUNTA 7

 Ubicar en la cadena respiratoria el sitio de acción de los

indicadores redox usados en la práctica.
PREGUNTA 3 PREGUNTA 2 PREGUNTA 1
IDENTIFIQUE LAS VARIABLES QUE INTERVINIERON EN EL EXPERIMENTO REALIZADO EN
LA PRÁCTICA

¿Cómo la distribución intracelular de las enzimas oxidorreductasas

PROBLEMA
afecta a las reacciones en cada tubo de ensayo?
PREGUNTA 4

Las enzimas oxidorreductasas que intervienen en las reacciones

catalíticas de los dos sistemas vistos en práctica se encuentran en la
HIPÓTESIS matriz mitocondrial, lo que genera que en los tubos de ensayo en las que
PREGUNTA 6 PREGUNTA 5

no se encuentre esta organela no se genere un cambio en la coloración

final.

VARIABLE INDEPENDIENTE VARIABLE DEPENDIENTE

PREGUNTA 8 PREGUNTA 7

Distribución intracelular de las Reacciones en cada tubo de

enzimas oxidorreductasas ensayo
PREGUNTA 3 PREGUNTA 2 PREGUNTA 1 IDENTIFIQUE LOS COMPONENTES DEL SISTEMA ENZIMÁTICO EMPLEADO EN LA
PRÁCTICA Y SEÑALE SUS PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS.

ENZIMA SUCCINATO DESHIDROGENASA ENZIMA HIERRO-CITOCROMO-

C REDUCTASA
 Enzima oxidorreductasa (oxida al succinato en
fumarato)
 Se encuentra en la membrana mitocondrial interna.
 Pertenece a la familia de las
 Posee dos subunidades transmembrana, C y D y
oxidorreductasa, más específicamente a
otras dos subunidades, A y B, se extienden hacia la
PREGUNTA 4

aquellas que actúan sobre donadores de

matriz mitocondrial.
electrones con un grupo heme, con otros
 Detrás del FAD de la subunidad A se encuentra su
aceptores.
sitio activo (donde se une el succinato)
PREGUNTA 6 PREGUNTA 5

 La subunidad B es la que está unida a la ubiquinona,

 Es una enzima que cataliza la siguiente
además tiene tres centros Fe-S.
reacción química:
 El hemo b, que está entre la subunidades
transmembrana C y D, no se encuentra en la ruta
principal de transferencia de electrones; pero
Por lo tanto los dos sustratos de esta
protege contra la formación de especies reactivas
enzima son un ferrocitocromo c y un hierro
PREGUNTA 8 PREGUNTA 7

de oxígeno (ROS) por electrones que se desvían en

trivalente; mientras que sus dos productos
el camino
son un ferrocitocromo c y hierro bivalente.
 Dos moléculas de fosfatidiletanolamina están unidas
tan fuertemente a la subunidad D que se observan
en la estructura cristalina.
PREGUNTA 3 PREGUNTA 2 PREGUNTA 1
¿QUÉ ES EL 2,6-DICLOROFENOLINDOFENOL Y P-FENILENDIAMINA, CÓMO ACTÚAN EN LA
CADENA RESPIRATORIA?

2-6 DICLOROFENOLINDOFENOL P-FENILENDIAMINA

El 2,6-diclorofenolindofenol es un derivado La para-fenilendiamina (p-fenilendiamina) es
clorado del fenol con la fórmula química
un indicador redox, cuyo estado normal es
C6 H4 Cl2 O el cuál actúa como un indicador,
reducido a un color marrón claro, y cuando
PREGUNTA 4

cuyo estado normal es oxidado a un color

azul, y cuando se reduce ocurre un cambio se oxida ocurre un cambio a color marrón
a blanquecino, casi incoloro. En la cadena oscuro.
PREGUNTA 6 PREGUNTA 5

respiratoria, este compuesto actúa en el

complejo I, entre el FMN y la ubiquinona En la cadena respiratoria, este compuesto
(coenzima Q) actúa cediendo electrones al citocromo C.

2,6-DICLOROFENOLINDOFENOL 2.6-DICLOROFENOLINDOFENOL
OXIDADO (ESTADO NORMAL) REDUCIDO
PREGUNTA 8 PREGUNTA 7

Incoloro Marrón
Azul Incoloro
PREGUNTA 3 PREGUNTA 2 PREGUNTA 1
GRAFIQUE EN UNA CADENA DE ÓXIDO – REDUCCIÓN LA ACCIÓN DE LOS INDICADORES
RÉDOX 2,6 DICLOROFENOLINDOFENOL Y P–FENILENDIAMINA.

ACCIÓN DE 2,6
DICLOROFENOLINDOFENOL
PREGUNTA 4
PREGUNTA 6 PREGUNTA 5

Succinato
deshidrogenasa
ACCIÓN DE P-FENILENDIAMINA (COMPLEJO II)

2 H+ pH 7,4
Hierro-citocromo-
c reductasa
PREGUNTA 8 PREGUNTA 7

𝒆− 𝒅𝒆 𝟐𝑯+
2Cit C 2 Cit C
Fe+++ Fe++
Incoloro Marrón 2.6-DICLOROFENOLINDOFENOL OXIDADO 2.6-DICLOROFENOLINDOFENOL REDUCIDO
(ESTADO NORMAL)

COMPLEJO COMPLEJO
III IV Azul Incoloro
PREGUNTA 3 PREGUNTA 2 PREGUNTA 1
¿QUÉ ES UN HOMOGENIZADO DE HÍGADO Y CÓMO SE OBTIENEN LAS FRACCIONES
CELULARES POR CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL?

El homogeneizado de hígado se obtiene al homogenizar 10 gr de hígado

cortados en fragmentos pequeños. Se coloca en el homogenizador Potter y se le
agrega 0.154 M de KCl. Se hace presión manualmente con el émbolo girando
hacia el fondo, trabajándose entre 0 y 4ºC.
PREGUNTA 4

El homogenizado es centrifugado a 800 revoluciones por 10 minutos colocándolo

PREGUNTA 6 PREGUNTA 5

en tubos de polietileno, previa calibración en la balanza, se emplea una

centrífuga refrigerada. El sobrenadante es separado en un beaker de 500ml. El
sedimento constituye la fracción nuclear y se coloca en un beaker de 100ml.
PREGUNTA 8 PREGUNTA 7

El sobrenadante anterior es centrifugado a 15000 revoluciones por 15 minutos en

la centrífuga refrigerada. Se separa el sobrenadante en un beaker,
constituyendo la fracción microsomal con el citosol. El sedimento se separa en
otro beaker y constituye la fracción mitocondrial.
PREGUNTA 3 PREGUNTA 2 PREGUNTA 1
¿EN QUÉ FRACCIONES CELULARES SE ENCUENTRAN LAS ENZIMAS DE ÓXIDO –
REDUCCIÓN?

Las fracciones celulares en que encontramos

enzimas de óxido-reducción son:

FRACCIÓN
MITOCONDRIAL
PREGUNTA 4

MITOCONDRIAS
PEROXISOMAS
PREGUNTA 6 PREGUNTA 5

LISOSOMAS

HOMOGENEIZADO TOTAL

Proceso por el que se hace

que una mezcla presente las
PREGUNTA 8 PREGUNTA 7

mismas propiedades en toda

la sustancia; en este caso , una
mezcla de todos los
componentes de la célula
PREGUNTA 3 PREGUNTA 2 PREGUNTA 1
HAGA UN ESQUEMA DE LA CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL
PRECENTRIFUGACIÓN ULTRACENTRIFUGACIÓN

Sobrenadante Sobrenadante Sobrenadante

de de de
Centrifugación Centrifugación Centrifugación Centrifugación
PREGUNTA 4

600 x G 20000 x G 100000 x G 200000 x G

10 min 30 min 90 min 3 hrs

CITOSOL
PREGUNTA 6 PREGUNTA 5

CÉLULAS
ALTERADAS EN
SOLUCIÓN SEDIMENTACIÓN
AMORTIGUADORA DE RIBOSOMAS

NÚCLEOS EN MITOCONDRIAS, SEDIMENTACIÓN DE

ESFERA LISOSOMAS Y RETÍCULO ENDOPLÁSMICO,
PREGUNTA 8 PREGUNTA 7

PEROXISOMAS EN COMPLEJO DE GOLGI Y

SEDIMENTO MEMBRANA PLASMÁTICA
FRACCIÓN
NUCLEAR
FRACCIÓN FRACCIÓN
MITOCONDRIAL MICROSOMAL
 CONCLUSIONES
 Las enzimas pertenecen a sectores específicos de la célula. El citoplasma, la matriz mitocondrial y la matriz
nuclear son independientes en contenido enzimático.

 El 2,6-diclorofenolindofenol y el p-fenilendiamina pueden ser usados como buenos indicadores redox. Las
reacciones de oxidorreducción permiten a estos indicadores oxidarse (es el caso de la p-fenilendiamina) o
reducirse (es el caso de la 2,6-diclorofenolindofenol) generando un color característico que hace visible la
existencia de las enzimas succinato deshidrogenasa y hierro-citocromo-c reductasa, en el primer y segundo
sistema, respectivamente.

 La diferente densidad de cada compartimiento permite separar su contenido con el uso de una centrifuga.
La centrifugación diferencial permite el fraccionamiento celular (mitocondrial, nuclear, microsomal) explicado
por la diferencia en las densidades de cada compartimento celular.
 En el homogeneizado se encuentran todas las fracciones, tanto nuclear, microsomal y mitocondrial.
 La cadena respiratoria es un claro ejemplo de reacciones de oxidoreducción, indispensables en la
transferencia de electrones.

 Se demostró que las enzimas de oxidoreducción se encuentran en la fracción mitocondrial y en el

homogenizado total.
 BIBLIOGRAFÍA

Nelson D, Cox M. Lehninger, Principles of Biochemistry. 7th Rodwell V, Bender D, Botham K, Weil P. Harper´s Illustrated
ed. Ediciones Omega; España,2019. Biochemistry. 31st ed. Mc GrawHill. LANGE; México DF, 2019.